Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Beteendemässig bedömning av visuell funktion via optomotorisk respons och kognitiv funktion via Y-Maze hos diabetiker råttor

Published: October 23, 2020 doi: 10.3791/61806
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,4, 1, 1, 1,2, 1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Department of Neuroscience, Emory University, 4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Neural degeneration i både ögon och hjärna till följd av diabetes kan observeras genom beteendetester som utförs på gnagare. Y-labyrinten, ett mått på rumslig kognition, och optomotorsvaret, ett mått på visuell funktion, ger båda insikt i potentiella diagnoser och behandlingar.

Abstract

Det optomotoriska svaret och Y-labyrinten är beteendetester som är användbara för att bedöma visuell respektive kognitiv funktion. Det optomotoriska svaret är ett värdefullt verktyg för att spåra förändringar i rumslig frekvens (SF) och kontrastkänslighet (CS) trösklar över tid i ett antal näthinnesjukdom modeller, inklusive diabetiker retinopati. På samma sätt kan Y-labyrinten användas för att övervaka rumslig kognition (mätt med spontan växling) och undersökande beteende (mätt med ett antal poster) i ett antal sjukdomsmodeller som påverkar centrala nervsystemet. Fördelarna med optomotorsvaret och Y-labyrinten inkluderar känslighet, testhastighet, användning av medfödda svar (träning behövs inte) och förmågan att utföras på vakna (icke-bedövade) djur. Här beskrivs protokoll för både optomotorsvaret och Y-labyrinten och exempel på deras användning som visas i modeller av typ I- och typ II-diabetes. Metoder inkluderar beredning av gnagare och utrustning, prestanda av optomotorsvaret och Y-labyrinten och dataanalys efter testet.

Introduction

Över 463 miljoner människor lever med diabetes, vilket gör det till en av de största globala sjukdomsepidemierna1. En av de allvarliga komplikationer som uppstår från diabetes är diabetiker retinopati (DR), en ledande orsak till blindhet för amerikanska vuxna i arbetsför ålder2. Under de kommande 30 åren beräknas andelen av befolkningen i riskzonen för DR fördubblas, så det är viktigt att hitta nya sätt att diagnostisera DR i dess tidigare skeden för att förhindra och mildra DR-utveckling3. DR har konventionellt ansetts vara en kärlsjukdom4,5,6. Men nu med bevis på neuronal dysfunktion och apoptos i näthinnan som föregår vaskulär patologi, definieras DR att ha neuronala och vaskulär komponenter4,5,6,7,8,9. Ett sätt att diagnostisera DR skulle vara att undersöka neurala avvikelser i näthinnan, en vävnad som kan vara mer sårbar för oxidativ stress och metabolisk stam från diabetes än annan neural vävnad10.

Nedgångar i kognitiv och motorisk funktion förekommer också med diabetes och är ofta korrelerade med retinala förändringar. Äldre individer med typ II-diabetes skildrar sämre kognitiva baslinjeprestanda och visar mer förvärrad kognitiv nedgång än kontrolldeltagare11. Dessutom har näthinnan etablerats som en förlängning av centrala nervsystemet och patologier kan manifesteras i näthinnan12. Kliniskt har förhållandet mellan näthinna och hjärna studerats i samband med Alzheimers och andra sjukdomar men är inte vanligt utforskat med diabetes12,13,14,15,16. Förändringar i hjärnan och näthinnan under progressionen av diabetes kan utforskas med hjälp av djurmodeller, inklusive STZ-råttan (en modell av typ I-diabetes där toxinet, streptozotocin eller STZ, används för att skada betaceller i bukspottskörteln) och Goto-Kakizaki-råttan (en polygen modell av typ II-diabetes där djur utvecklar hyperglykemi spontant vid cirka 3 veckors ålder). I detta protokoll ges en beskrivning av Y-labyrinten och det optomotoriska svaret för att bedöma kognitiva respektive visuella förändringar hos diabetiker gnagare. Det optomotoriska svaret (OMR) bedömer rumslig frekvens (liknar synskärpa) och kontrastkänslighet genom att övervaka karakteristiska reflexiva huvudspårningsrörelser för att mäta visuella tröskelvärden för varje öga17. Rumslig frekvens avser staplarnas tjocklek eller finhet, och kontrastkänslighet avser hur mycket kontrast det finns mellan staplarna och bakgrunden (figur 1E). Under tiden testar Y-labyrinten korttidsminne och undersökande funktion, observerad genom spontana växlingar och poster genom labyrintens armar.

Båda testerna kan utföras i vakna, icke-sövda djur och har fördelen att dra nytta av medfödda svar från djuren, vilket innebär att de inte kräver träning. Båda är relativt känsliga, genom att de kan användas för att upptäcka underskott tidigt i utvecklingen av diabetes hos gnagare, och tillförlitliga, genom att de producerar resultat som korrelerar med andra visuella, näthinne eller beteendemässiga tester. Dessutom kan användning av OMR och Y-labyrinten i samband med tester som elektroretinogram och optisk koherenstomografi skanningar ge information om när näthinne, strukturella och kognitiva förändringar utvecklas i förhållande till varandra i sjukdomsmodeller. Dessa undersökningar kan vara användbara för att identifiera neurala degenerationer som uppstår på grund av diabetes. I slutändan kan detta leda till nya diagnostiska metoder som effektivt identifierar DR i tidiga stadier av progression.

OMR och de Y-labyrintsystem som används för att utveckla detta protokoll beskrivs i materialförteckningen. Tidigare forskning om OMR, av Prusky et al.18, och Y-labyrinten, av Maurice et al.19, användes som utgångspunkt för att utveckla detta protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden godkändes av Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee och följde National Institutes of Health guide för vård och användning av laboratoriedjur (NIH Publications, 8: e upplagan, uppdaterad 2011).

1. Det optomotoriska svaret (OMR)

  1. Ställ in OMR-apparaten (information om apparater och programvara i materialförteckningen)
    1. Välj en plattform av lämplig storlek för gnagaren: mus, råtta eller stor/nedsatt råtta (figur 1A).
    2. Öppna OMR-programvaran, som ska öppnas för ett fönster med flera flikar med alternativ och en live videomatning av insidan av OMR / virtuell trumma (bild 1B). Zooma in eller ut med videokameran efter behov så att plattformen och dess omgivningar syns.
    3. Notera ikonerna längs den vänstra sidan av livebilden (bild 1C). Klicka på asteriskikonen och den roterande ränderikonen så att både den gröna asterisken och gröna roterande ränder försvinner från live-flödet.
    4. Klicka på kompassikonen så att en grön cirkel och två vinkelräta linjer visas. Sträck den gröna cirkeln så att den passar perfekt med den svarta cirkeln på plattformen, vilket säkerställer att OMR är perfekt justerad.
    5. Klicka på kompassikonen eftersom det inte är nödvändigt att se cirkeln under testningen. Klicka på den gröna asteriskikonen och den gröna roterande ränderikonen för att få dessa att dyka upp igen. Observera att de gröna ränderna roterar i samma riktning som ränderna i trumman, så att forskaren kan veta riktningen på ränderna.
    6. Klicka på fliken Testning. Klicka på fliken Psykofysik under Testning. Under Tröskelvärde väljer du Frekvens för att mäta rumslig frekvens.
      OBS: OMR-programvaran använder ett trappparadigm för att automatiskt beräkna rumslig frekvens (SF). Kontrasten bibehålls till 100 %.
    7. Klicka på fliken Förinställningar under Testning. Välj standardinställningarna för Mouse18 eller Rat20.
    8. Klicka på fliken Blanking under Testning. Markera rutan Tom på spårning, som pausar ränderna/tömmer datorskärmarna i trumman när musen högerklickas.
    9. Klicka på fliken Resultat , där testresultaten kommer att visas.
  2. Utvärdera rumslig frekvens
    1. Placera gnagaren på den cirkulära plattformen i mitten av den virtuella verklighetskammaren som består av fyra datorskärmar som visar vertikala sinusvåggaller som cirklar kammaren med en hastighet av 12°/s (figur 1D).
    2. Observera att videokameran som är placerad högst upp i kammaren projicerar gnagarens beteende live på datorskärmen.
    3. Leta efter närvaron eller frånvaron av reflexiva åtgärder av gnagarens huvud när galler rör sig i en medurs eller moturs riktning. Se till att illustrerade staplar är synliga i programmet – dessa visar gallerrörelsens riktning.
      1. Se upp för gnagarens huvud att röra sig i samma riktning som gallret. Vänta tills det finns en smidig jakt, inte oberäkneliga utbrott av huvudrörelse, för att räkna den som spårning.
      2. Klicka på Ja eller Nej beroende på vad som är lämpligt. Observera att SF börjar med 0,042 cyc/deg och justerar med varje ja och nej för att bli enklare eller svårare (figur 1E). Klicka på Återställ om testet behöver återställas på grund av oavsiktligt eller felaktigt klick på ja och nej.
    4. När gnagaren testas, se till att hålla asterisken placerad över gnagarens huvud.
      OBS: Detta har två effekter: 1) Den upprätthåller rätt rumslig frekvens. Om asterisken är placerad mellan axlarna, till exempel, blir den rumsliga frekvensen lägre och staplarna blir lättare att se, vilket resulterar i en falskt hög poäng. 2) För gnagare med små huvudrörelser gör asterisken det lättare att mäta om huvudet faktiskt rör sig.
    5. Se upp för systemet att säga "Klar" när gnagarens rumsliga frekvens uppnås. Observera att ja- och nejknapparna inte längre kan klickas.
    6. Klicka på fliken Resultat , som visar den rumsliga frekvensen för vänster öga, höger öga och kombinerade ögon.
      OBS: Ibland är programvaran inställd så att resultaten vänds, dvs det högra ögat rapporteras som vänster öga och det vänstra ögat rapporteras som höger öga. Detta upptäcktes vid bedömning av gnagare som bara hade ett öga lesionerat i en glaukom modell.
  3. Utvärdera kontrastkänslighet
    OBS: Kontrastkänslighetstestning kan utföras omedelbart efter mätningssteget för rumslig frekvens eller på egen hand samma dag eller en annan dag om gnagaren verkar trött efter rumslig frekvenstestning (följ steg 1–2.2 om man bara testar kontrastkänsligheten).
    1. Klicka på fliken Testning och sedan på fliken Psykofysik . Under Tröskelvärde väljer du Kontrast (singel) för att mäta kontrastkänslighet.
    2. Använd också ett trappparadigm, börja riva med SF-konstant på toppen av kontrastkänslighetskurvan (CS). För att göra detta, klicka på fliken Stimulans och sedan på fliken Galler . I rutan Rumslig frekvens , typ 0,064 för råttor och 0,103 för möss.
    3. Börja kontrasten vid 100% och leta efter samma reflexiva huvudrörelser som ses under rumslig frekvenstestning. Observera att kontrasten kommer att minska när testet fortskrider tills gnagaren inte längre har reflexiva huvudrörelser som svar på stimulansen (figur 1E).
    4. Se upp för att systemet ska säga "Klar" och ja - och nej-knapparna inte längre ska vara klickbara när gnagaren inte längre svarar på den visuella stimulansen och kontrastkänslighetströskeln har uppnåtts. Klicka på fliken Resultat , där kontrastkänsligheten för vänster öga, höger öga och kombinerade ögon kommer att listas.
  4. Utföra eftertestanalys
    1. För studier av diabetesretinopati, där båda ögonen förväntas ha liknande underskott, använd den kombinerade poängen (genomsnitt av höger och vänster ögon) för analys. För modeller som orsakar differentiell skada på ögonen (dvs. sprängskada eller glaukom), håll vänster och höger öga data åtskilda.
    2. För rumslig frekvens använder du råpoäng (data från fliken Resultat ) för analys och genomsnitt av dessa poäng tillsammans efter grupp (dvs. diabetiker, kontroll osv.).
    3. För Kontrastkänslighet använder du råvärdet för att beräkna michelsonkontrastens rapporterade kontrast från ett tidigare mått på skärmens luminans.

2. Y-labyrinten

  1. Förbered gnagare för testning
    1. Anpassa gnagare till rummet i 30 minuter före testning.
      OBS: Forskaren kan stanna i rummet med lamporna tända men bör vara tyst under denna tid.
    2. Rengör Y-labyrinten med saneringslösning säker för djur och torka bort all saneringslösning med pappershanddukar. Se till att labyrinten är torr.
  2. Utför Y-labyrinten
    1. Märk Y-labyrintens ursprungliga arm som B och de andra 2 armarna som A och C (figur 2A). Placera en gnagare i armen närmast forskaren (arm B) nära mitten av Y-labyrinten. När gnagaren har placerats, starta timern (detaljer om labyrint och timer i Tabell över material).
      1. Låt varje gnagare utforska Y-labyrinten i 8 min. Ta inspelningar under denna tid och notera eventuella observationer. Sitt flera meter från labyrinten medan du håller den i sikte och undvik att göra något ljud.
      2. Registrera startplatsen som A, och varje gång gnagaren gör ett inträde i en ny arm, registrera gnagarens nya plats (figur 2B). Definiera en post som alla fyra lemmar av gnagaren som är i en av armarna.
      3. Titta på gnagare att gömma sig och förbli stillastående i en arm av labyrinten. Om gnagaren förblir på samma plats i mer än 60 s och inte verkar visa undersökande beteende, flytta gnagaren mot mitten av Y-labyrinten och fortsätt rättegången.
    2. Efter varje gnagare, ta bort avföring och rengör labyrinten med saneringslösning.
      1. Se till att all saneringslösning torkas bort med pappershanddukar och labyrinten är helt torr innan du placerar nästa gnagare i labyrinten.
  3. Beräkna spontan växling och undersökande beteende
    1. Beräkna undersökande beteende som det totala antalet poster som gjorts under 8 minuter.
    2. Beräkna rumslig kognition mätt med spontan växling:
      Antalet lyckade växlingar/(det totala antalet poster - 2)
      1. Definiera en lyckad växling när gnagaren flyttar till tre olika platser sekventiellt (Exempel: ABC, CAB, BCA, etc.). Observera varje lyckad växling (figur 2B).
      2. Om rörelserna registrerades som ACABCABABCABC, bortse från de två ursprungliga startplatserna vid beräkning av spontan växling (så att det finns 11 rörelser i nämnaren). Räkna antalet exakta rörelser (exakta rörelser = 8). Beräkna procentnoggrannheten som: 8/(13 - 2) = 72,7%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

OMR anses vara framgångsrikt om rumslig frekvens och kontrastkänslighet trösklar kan erhållas från en gnagare. Här illustreras användningen av OMR för att bedöma rumslig frekvens i naiv kontroll Brun-Norge och Long-Evans råttor, både unga (3-6 månader) och i åldern (9-12 månader). Brun-norska råttor uppvisar vanligtvis en högre rumslig frekvens vid baslinjen än Long-Evans råttor. Dessutom observerades en åldrande effekt på rumslig frekvens hos Long-Evans råttor (figur 3A). Data analyserades med hjälp av en enkelriktad ANOVA följt av Holms-Sidaks post hoc-jämförelser då de unga och åldrade resultaten kom från olika kohorter.

Användningen av OMR för att bedöma kontrastkänslighet illustreras i STZ-modellen av typ I-diabetes som fick behandling med träningsintervention. Long-Evans råttor tilldelades en av de fyra grupperna: kontroll, kontroll + aktiv, diabetiker och diabetiker + aktiv. Diabetiker råttor fick intravenösa injektioner av toxinet STZ för att skada bukspottskörteln betaceller och inducera hyperglykemi. Aktiva råttor fick 30 minuters löpbandsövning, 5 dagar i veckan. Inaktiva råttor hade ett låst löpband. Betydande underskott i kontrastkänslighet (figur 3B) observerades hos diabetiker råttor. Behandling med motion minskade dessa underskott (figur 3B). Dessa resultat visar att OMR är användbart både för att upptäcka och spåra näthinneunderskott över tid och för att bedöma effekterna av behandlingar och interventioner på näthinnesjukdom22. Data analyserades med hjälp av en tvåvägs upprepad åtgärd ANOVA följt av Holms-Sidak post-hoc jämförelser. Observera att resultaten kan presenteras som data som normaliserats till kontroll (figur 3B) eller som råvärden (figur 3A; för rumslig frekvens: i cykler/grad eller c/d; för kontrastkänslighet: godtyckliga enheter eller a.u.). Vanligtvis behövs 6-10 djur, beroende på skadans svårighetsgrad, för att hitta en betydande skillnad med OMR.

Y-labyrinten anses framgångsrik om gnagaren går in i minst 5 armar av labyrinten inom 8 minuter. Här illustreras förmågan hos Y-labyrinten att bedöma kognitiv funktion och undersökande beteende i Goto-Kakizaki råttan, en polygen, icke-överviktig modell av typ II-diabetes som utvecklar måttlig hyperglykemi som börjar vid 2-3 veckors ålder och inte kräver insulintillskott. Betydande underskott i rumslig kognition, mätt med spontan växling (figur 4A) och undersökande beteende, mätt i antal poster (figur 4B), observerades hos Goto-Kakizaki råttor jämfört med Wistar kontroller som börjar vid 7 veckors ålder. Kontrollråttor verkar visa en minskning av undersökande beteende från 4 till 8 veckor. Denna trend observeras också i långtidsstudier (8+ månaders ålder). Minskningen av rörelse kan bero på brist på nyhet med upprepad labyrintexponering eller en allmän minskad rörelse med åldern. Kontrollråttor verkar visa en ökning av rumslig kognition från 4 till 8 veckor. Denna trend observeras inte i långsiktiga studier där djuren körs varje månad istället för varje vecka (i själva verket observeras ofta en minskning med åldrande), och därför kan denna ökning av rumslig kognition bero på en inlärningseffekt av att köra labyrinten en gång i veckan. Data analyserades med hjälp av en tvåvägs upprepad åtgärd ANOVA följt av Holms-Sidak post-hoc jämförelser. Minst 10 djur, beroende på skadans svårighetsgrad, behövs vanligtvis för att hitta en betydande skillnad med Y-labyrinten.

Detta protokoll genererade visuell funktion och kognitiva funktionsdata i modeller av typ I och typ II-diabetes. Poäng för enskilda djur var genomsnittliga tillsammans och användes för att upptäcka betydande skillnader mellan behandlingsgrupper tidigt i progressionen av diabetes. Att utföra både retinala och kognitiva bedömningar över tid i modeller av systemiska sjukdomar som diabetes möjliggör övervakning av det tidsmässiga utseendet på underskott över tid. Till exempel, i Goto-Kakizaki-modellen, visade sig näthinnefunktionsunderskott föregå kognitiva och undersökande beteendeunderskott23 (figur 5).

Figure 1
Bild 1: Installation av OMR-utrustningen. A) Bild av mus-, råtta- och stora eller nedsatta råttplattformar. (B) Bild på datorskärmen under provningen. (C) Knapppanel under provningen. D) Schematisk råtta på plattformen i kammaren. (E) Exempelgradienter som visar ökande rumslig frekvens och kontrastkänslighet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Bild 2: Installation av Y-labyrintutrustningen. (A) Bild av Y-labyrinten med vapen märkta. (B) Bild av en labb anteckningsbok med exempel på Y-labyrint inspelning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Bild 3: Använda OMR för att spåra visuell funktion. A) Rumsliga frekvenströsklar för unga (n = 11) och äldre (n = 15) Brun-Norge (BN) och unga (n = 20) och äldre (n = 13) Long-Evans (LE) råttor. Denna siffra presenterar brun-norska data från Feola et al., 201921. (B) Använda OMR för att spåra nedsatt näthinnefunktion över tid och skyddande effekter av träning i en STZ-råttmodell av typ I-diabetes. Kontrastkänslighetströsklar för inaktiva diabetiker råttor jämfört med aktiva diabetiker råttor och kontroll råttor. Mörkgrå asterisker representerar skillnader mellan både kontrollgrupper och båda diabetikergrupperna. Orange asterisker representerar skillnader mellan inaktiva diabetiker råttor och aktiva diabetiker råttor. Denna siffra presenterar data från en delmängd av råttor från Allen et al., 201822. Medelvärde ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Använda Y-labyrinten för att spåra kognitiv funktion och undersökande beteende över tid i Goto-Kakizaki-modellen av typ II-diabetes jämfört med Wistar-kontroller. (A) Kognitiv funktion (spontan växling) för goto-kakizaki (diabetiker) och Wistar (kontroll) råttor från 4 till 8 veckors ålder. (B) Undersökande beteende (antal poster) från 4 till 8 veckors ålder. Medelvärde ± SEM. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Asterisker representerar skillnader mellan Goto-Kakizaki och Wistar råttor vid varje tidpunkt. Endast en kohort av råttor kördes från 4 veckor till 8 veckor (GK: n = 7; Wistar: n = 10). Alla andra kohorter kördes från 5 veckor till 8 veckor (GK: n = 22; Wistar: n = 23) för totalt n av 29 (GK) och 33 (Wistar) vid vecka 5 till 8. Denna siffra har ändrats från Allen et al., 201923. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Tidslinje för funktionella förändringar i Goto-Kakizaki-modellen av typ II-diabetes. Efter utseendet av hyperglykemi, de första förändringar som observerats i Goto-Kakizaki råttan var i retinal funktion, mätt med electroretinogram (ERG), visas vid 4 veckors ålder. Kognitiva och undersökande beteende förändringar uppträdde efter 6 veckors ålder. Denna siffra har ändrats från Allen et al., 201923. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OMR och Y-labyrinten möjliggör icke-invasiv bedömning av visuell funktion och kognitiva funktionsunderskott hos gnagare över tid. I detta protokoll visades OMR och Y-labyrinten att spåra visuella och kognitiva underskott i gnagare modeller av diabetes.

Kritiska steg i protokollet

The OMR

Några viktiga punkter att tänka på när man utför OMR för att bedöma visuell funktion är de testparametrar som används, experimentell design och tidpunkt för testning och erfarenhet av att forskaren utför mätningarna. Ett av de mer kritiska stegen i protokollet är att se till att parametrarna är korrekt inställda. Dessutom bör OMR-kammaren rengöras med saneringslösning eller annat godkänt desinfektionsmedel före och efter varje gnagare som en del av installationen. Det är också viktigt att den forskare som utför åtgärderna har utbildats och har erfarenhet av att utföra åtgärderna. Bästa resultat ses när gnagare är lugna och acklimatiserade till rummet genom att lämna dem i sina burar i 30 minuter innan experimentet påbörjas. Det är också viktigt att bestämma rumslig frekvens och kontrastkänslighet vid påbörjande av arbetet med en ny stam och att notera att inte alla stammar kommer att uppvisa samma baslinjenivåer. Brun-norska råttor har större rumslig frekvens vid baslinjen än Long-Evans råttor. Under tiden verkar vissa stammar av albino råttor ha äventyrat rumslig frekvens24, medan andra stammar av albino råttor inte uppvisar spårningsbeteende alls. Många faktorer kan bidra till det begränsade svaret av albino djur på OMR: störd binokularitet på grund av att differentiell decussation av optik nerv fibrer, brist på melanin i baksidan av ögat och stor andel dubbla opsin koner. Oavsett kan albinoråttor inte vara lämpliga försökspersoner för OMR-testningen eftersom deras prestanda kan vara för nära detektionsgränsen.

Y-labyrinten

En kritisk komponent i att utföra Y-labyrinten innebär att minimera störningar under inspelningsperioden. Den första placeringen av gnagaren i labyrinten bör endast göras efter att gnagaren har kunnat acklimatisera sig till rummet i 30 min. Detta gör det möjligt för gnagaren att anpassa sig till den nya miljön och förhindrar att eventuella förvirrande faktorer påverkar gnagarens normala beteende. Att minimera störningar under varje försök är mycket viktigt. Detta inkluderar att undvika höga ljud och se till att forskaren är utom synhåll för gnagaren. Dessa distraktioner kan orsaka stress för gnagaren. Det är också viktigt att notera att rummets väggar ska förbli så nakna som möjligt med en neutral färg. Alla ljusa färger på väggarna eller affischerna kan distrahera gnagaren och kan påverka deras undersökande beteendemönster.

Begränsningar av metoden och modifieringar och felsökning av metoden

The OMR

En potentiell begränsning av OMR är att den kan påverkas av experimenterbias, och olika experimenterare kan ha något olika resultat eftersom OMR-poängen är subjektiv. Det kan vara lätt att missa en huvudrörelse som är för subtil eller klassificerar undersökande beteende som en huvudrörelse. Eftersom partiskhet kan påverka OMR-resultaten är det bäst om experimenteraren maskeras till behandlingsgruppen och studiedesign när det är möjligt. Utvecklingen av en automatisk OMR eller jämförelse av resultaten av två testare kan också bidra till att minska experimenterbias.

Ett vanligt problem som kan uppstå under OMR-testningen är när gnagaren upprepade gånger hoppar från plattformen, vilket gör det svårt att få en visuell tröskel. Om detta händer, notera det och placera försiktigt råttan tillbaka på plattformen; Det kan också bli nödvändigt att mäta råttan igen följande dag. Dessutom kan råttor som aldrig har mätts tidigare delta i undersökande beteenden när de placeras i OMR. Om detta är ett problem kan ett ytterligare baslinjemått en vecka efter den första mätningen bidra till att förbättra noggrannheten. Tester med alltför stora mängder av dessa beteenden bör kasseras.

Andra faktorer som ålder eller luktsignaler kan också bidra till oönskad aktivitet. Därför är det viktigt att utforma experiment i enlighet med tidslinjen för visuell systemutveckling hos råttor och att noggrant rengöra plattformen och kammaren före och efter testning av varje gnagare. Den tid på dagen som OMR-mätningarna utförs bör också beaktas, eftersom tidigare studier har visat att det finns dygnsrytmer i rumslig frekvens25. Att köra råttorna före middagstid verkar vara bäst för deras fokus (Rachael Allens labb - personliga observationer). Om råttor blir för distraherade kan det hjälpa till att försiktigt knacka på utsidan av OMR.

Den hastighet med vilken testningen utförs kan också påverka resultaten. Åtgärder kan bli mindre exakta efter 30 minuter eller så om gnagare förlorar intresset för stimulansen. Därför kan mer exakta resultat erhållas när mätningar görs på cirka ≤20 min. Varaktigheten för en enda prövning (för antingen SF eller CS) är 5-10 min för en expert och 30 min för en nybörjare. Om en gnagare visar liten rörelse, spenderar större delen av sin tid grooming eller på annat sätt inte tittar i riktning mot staplarna, kan den vara trött. Gnagaren kan köras igen på en annan dag. Dessutom kan SF- och CS-testning utföras på olika dagar, särskilt för nyare testare som kan vara långsammare. Frekvensen med vilken testet utförs kan också påverka resultaten - att utföra det varje vecka eller varannan vecka hjälper djuren att hålla sig acklimatiserade till testet, men att utföra det varje dag eller varannan dag kan orsaka hyperacuity26. Vi kör inte mer än en provperiod per dag, även om vi ofta kör både SF och CS samma dag eller ens i samma sammanträde. Ackumulerad daglig tid för att köra en kohort av råttor (n = 10) är 2 h för en expert.

OMR mäter varje öga oberoende, vilket resulterar i separata visuella poäng för varje öga. I Morrison och mikrober modeller av glaukom och i en optisk nerv krossa modell, vårt lab har inte observerat någon inverkan av det skadade ögat på det oskadade ögat27. I en sprängmodell, med explosionen riktad mot ett öga, visade det kontralaterala ögat skador, men detta kan också bero på en partiell sprängeffekt28. I kontrollråttor bör det inte finnas någon skillnad i resultat mellan medurs eller moturs riktningar, men vissa gnagare kan ha en partiskhet; Det skulle därför vara bäst att växla riktningarna29, om OMR-systemet inte växlar automatiskt.

Beroende på sjukdomsmodellen kan behandlingsgruppens skillnader i visuell funktion variera beroende på vilka parametrar som används. Om den rumsliga frekvensen till exempel är inställd på en nivå som ligger över det normala tröskelvärdet för rumslig frekvens och är svår att lösa, kommer skillnaderna i kontrastkänslighet mellan grupper att vara små. Men om den rumsliga frekvensen är inställd på en nivå som normalt är lätt för råttor att se, kommer skillnaderna i kontrastkänslighet mellan grupper att vara större30. Därför är det viktigt att överväga studiedesign och normala rumsliga frekvenströsklar för gnagare när parametrar för att utföra OMR.

Y-labyrinten

Om ett djur är rädd kan det frysa i ett hörn av labyrinten. Dessutom, om ett högt ljud händer utanför rummet, kan ett djur bli rädd och inte röra sig i labyrinten. För att ta hänsyn till dessa problem kan forskare acklimatisera råttor till rummet först, flytta ett fruset djur till en valpunkt, köra ett djur igen på en annan dag eller köra djuren i rött ljus, vilket tros göra dem mindre nervösa eftersom de normalt är aktiva i mörker (Rachael Allens Lab - personlig kommunikation). Det rekommenderas också att köra Y-labyrinten vid samma tid varje dag för att ta hänsyn till förändringar i aktivitetsnivåer under hela dagen på grund av dygnsrytmen. Vi kör vanligtvis råttorna före middagstid (Rachael Allens labb - personliga observationer). Varaktigheten för en enda provperiod är 8 min (10 min, med rengöring). Vi kör aldrig mer än en provperiod per dag. Om ytterligare en prövning behövs utförs prövningen en annan dag. Ackumulerad daglig tid för att köra en kohort av råttor (n = 10) är 2–3 h. Åldersrelaterade minskningar av rumslig växling observerades hos råttor vid 9-12 månaders ålder och i undersökande beteende vid 12 månaders ålder28.

Medan både undersökande beteende och rumslig kognition minskning hos diabetiker gnagare, de två verkar inte vara tätt korrelerade, och därför utvärderar vi inte självständigt locomotor aktivitet före Y-labyrint testning.

Metodens betydelse för befintliga/alternativa metoder

The OMR

Andra metoder för visuell funktionstestning, såsom optokinetisk spårning, förlitar sig på att fixera djurets huvud på plats och spåra ögonrörelser. Obegränsad optomotorisk respons (OMR) testning möjliggör longitudinell, icke-invasiv och tillförlitlig mätning av visuell funktion hos gnagare. I detta protokoll beskrevs hur OMR kan användas för att kvantifiera både rumslig frekvens och kontrastkänslighetströsklar för varje öga. Denna metod kan vara mycket användbar för att upptäcka neuronal dysfunktion i tidigt stadium i sjukdomar som diabetes. Andra tester som den visuella vattenuppgiften kan också användas för att mäta rumslig frekvens31, men eftersom det innebär att träna gnagare att simma mot en gradient i en modifierad Y-labyrint är uppgiften tidskrävande och innebär mycket träning. Vidare mäter OMR värden för varje öga självständigt, vilket är användbart i modeller där skada riktas mot ett öga och det andra ögat fungerar som en kontralateral kontroll (till exempel många glaukommodeller). Dessutom är OMR en känslig bedömning, som kan upptäcka förändringar så tidigt som 3-4 veckor efter diabetes, vilket är tidigare än andra visuella bedömningar. Elektrofysiologiska analyser är ett alternativ till beteendemässiga visuella tester. Elektroretinografi (ERG) är mer tillgänglig än OMR och kan bestämma underskott i exakta celltyper med hjälp av olika komponenter i ERG-vågen32 (a- vågor representerar fotoreceptorcellfunktionen, b- vågor representerar bipolär cellfunktion). Under tiden kan OMR användas för att bestämma ett underskott i visuell funktion, utan att avslöja den exakta nedbrytningspunkten längs vägen. OMR är dock ett känsligare mått på DR än ERG, med OMR underskott vanligtvis observeras mellan 2-4 veckor efter hyperglykemi och ERG underskott observeras vanligtvis 4-8 veckor efter hyperglykemi hos gnagare. Svåra diabeteskatarakter kan påverka OMR. Diabetiker katarakt hos gnagare uppträder och/ eller förvärras under anestesi, och därför påverkas tester som ERG och optisk koherenstomografi som kräver anestesi mycket oftare än OMR, som utförs i vakna djur.

Y-labyrinten

Y-labyrinten förlitar sig på rumslig kognition som Morris vattenlabyrint men använder inte en stark negativ stimulans (dvs. vatten) för att motivera djuret att utföra uppgiften. Således är Y-labyrinten mindre stressande för djuren och är också lättare att utföra. Det är dock möjligt att Y-labyrinten kanske inte är lika känslig som Morris vattenlabyrint eller Barnes labyrint. Till skillnad från Morris vattenlabyrint är Y-labyrinten ett automatiskt beteende och kräver ingen träning. Således är tidsbördan för att utföra Y-labyrinten mycket lägre.

Slutsatser och framtida tillämpningar eller riktningar av metoden

The OMR

OMR är användbart för att mäta visuell funktion hos gnagare genom att spåra huvudrörelser. Det är en effektiv metod, men det finns uppdateringar och tillägg som kontinuerligt görs för att förbättra protokollet. Vissa nya metoder använder gnagaren som pausar huvudet som en negativ OMR-indikator i kombination med huvudspårning som en positiv indikator33. Detta möjliggör snabbare och mer exakta mått på visuell funktion34. Ett annat sätt som denna process har modifierats är att utveckla ett system som automatiskt spårar huvudet utan konstgjorda markörer för att minska inkonsekvenser som kan uppstå från mänskliga testare35. Från och med 2016 har ett automatiserat eller kvantitativt OMR-system som kallas qOMR utvecklats väl och är kommersiellt tillgängligt. I ovanstående protokoll kunde OMR upptäcka underskott i rumslig frekvens och kontrastkänslighet hos diabetiker råttor, liksom skydd mot underskott med en behandling (motion).

Y-labyrinten

Y-labyrinten avslöjar information om undersökande beteende och rumslig kognition och användes här för att upptäcka beteendemässiga underskott hos diabetiker gnagare vid 7 veckor. Andra tester för att observera kognitiv funktion finns (dvs Morris vattenlabyrint, Barnes labyrint, ny objektigenkänning), och det är möjligt att dessa tester kan avslöja kognitiv nedgång tidigare eller ge information om olika aspekter av kognition. Framtida riktningar för Y-labyrinten inkluderar att placera ett nytt föremål eller matstimulans i en av armarna och observera gnagarens utforskande mönster36. En variant av detta innebär att blockera en av armarna i Y-labyrinten, så att gnagaren kan utforska de två återstående armarna och sedan öppna åtkomsten till den tredje armen igen och utvärdera hur länge gnagaren spenderar i den tredje nya armen. En annan värdefull förbättring som kan göras när det gäller Y-labyrinten är att utveckla automatisk spårning av gnagare för att registrera deras rörelser. Detta skulle eliminera behovet av manuell registrering av gnagarnas rörelser och skulle göra beräkningarna av de spontana växlingarna mer exakta och effektiva.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Department of Veterans Affairs Rehab R&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) till RSA och (CDA-2, RX002342) till AJF och National Institutes of Health (NIH-NICHD F31 HD097918 till DACT och NIH-NIEHS T32 ES012870 till DACT) och NEI Core Grant P30EY006360.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OptoMotry HD CerebralMechanics Inc. OMR apparatus & software
Timer Thomas Scientific 810029AR
Y-Maze apparatus San Diego Instruments 7001-043 Available specifically for rats

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. IDF. International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9th edn. , Available from: https://diabetesatlas.org/upload/resources/material/20200302_133351_IDFATLAfinal-web.pdf (2019).
  2. Wang, W., Lo, A. C. Y. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2018).
  3. Akpek, E. K., Smith, R. A. Overview of age-related ocular conditions. The American Journal of Managed Care. 19 (5), Suppl 67-75 (2013).
  4. Urano, F. Wolfram syndrome: diagnosis, management, and treatment. Current Diabetes Reports. 16 (1), 6 (2016).
  5. Adeva-Andany, M. M., Funcasta-Calderón, R., Fernández-Fernández, C., Ameneiros-Rodríguez, E., Domínguez-Montero, A. Subclinical vascular disease in patients with diabetes is associated with insulin resistance. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Reviews. 13 (3), 2198-2206 (2019).
  6. Chin, J. A., Sumpio, B. E. Diabetes mellitus and peripheral vascular disease: diagnosis and management. Clinics in Podiatric Medicine and Surgery. 31 (1), 11-26 (2014).
  7. Barber, A. J., Gardner, T. W., Abcouwer, S. F. The significance of vascular and neural apoptosis to the pathology of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (2), 1156-1163 (2011).
  8. Pardue, M. T., Allen, R. S. Neuroprotective strategies for retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 65, 50-76 (2018).
  9. Aung, M. H., Kim, M. K., Olson, D. E., Thule, P. M., Pardue, M. T. Early visual deficits in streptozotocin-induced diabetic long evans rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (2), 1370-1377 (2013).
  10. Antonetti, D. A., et al. Diabetic retinopathy: seeing beyond glucose-induced microvascular disease. Diabetes. 55 (9), 2401-2411 (2006).
  11. Logroscino, G., Kang, J. H., Grodstein, F. Prospective study of type 2 diabetes and cognitive decline in women aged 70-81 years. BMJ. 328 (7439), 548 (2004).
  12. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
  13. Archibald, N. K., Clarke, M. P., Mosimann, U. P., Burn, D. J. The retina in Parkinson's disease. Brain. 132 (5), 1128-1145 (2009).
  14. Sakai, R. E., Feller, D. J., Galetta, K. M., Galetta, S. L., Balcer, L. J. Vision in multiple sclerosis: the story, structure-function correlations, and models for neuroprotection. Journal of Neuroophthalmology. 31 (4), 362-373 (2011).
  15. Wong, T. Y., et al. Retinal microvascular abnormalities and incident stroke: the Atherosclerosis Risk in Communities Study. The Lancet. 358 (9288), 1134-1140 (2001).
  16. Marquié, M., et al. Association between retinal thickness and β-amyloid brain accumulation in individuals with subjective cognitive decline: Fundació ACE Healthy Brain Initiative. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 37 (2020).
  17. Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
  18. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Vision Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  19. Maurice, T., et al. Behavioral evidence for a modulating role of σ ligands in memory processes. I. Attenuation of dizocilpine (MK-801)-induced amnesia. Brain Research. 647 (1), 44-56 (1994).
  20. Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22 (5), 677-684 (2005).
  21. Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
  22. Allen, R. S., et al. TrkB signalling pathway mediates the protective effects of exercise in the diabetic rat retina. European Journal of Neuroscience. 47 (10), 1254-1265 (2018).
  23. Allen, R. S., et al. Retinal deficits precede cognitive and motor deficits in a rat model of type II diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 123-133 (2019).
  24. Prusky, G. T., Harker, K. T., Douglas, R. M., Whishaw, I. Q. Variation in visual acuity within pigmented, and between pigmented and albino rat strains. Behavioural Brain Research. 136 (2), 339-348 (2002).
  25. Hwang, C. K., et al. Circadian rhythm of contrast sensitivity is regulated by a dopamine-neuronal PAS-domain protein 2-adenylyl cyclase 1 signaling pathway in retinal ganglion cells. Journal of Neuroscience. 33 (38), 14989-14997 (2013).
  26. Mui, A. M., et al. Daily visual stimulation in the critical period enhances multiple aspects of vision through BDNF-mediated pathways in the mouse retina. PLoS One. 13 (2), 0192435 (2018).
  27. Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
  28. Allen, R. S., et al. Long-term functional and structural consequences of primary blast overpressure to the eye. Journal of Neurotrauma. 35 (17), 2104-2116 (2018).
  29. Maaswinkel, H., Li, L. Spatio-temporal frequency characteristics of the optomotor response in zebrafish. Vision Research. 43 (1), 21-30 (2003).
  30. Benkner, B., Mutter, M., Ecke, G., Münch, T. A. Characterizing visual performance in mice: an objective and automated system based on the optokinetic reflex. Behavioral Neuroscience. 127 (5), 788-796 (2013).
  31. Lehmann, K., Schmidt, K. F., Löwel, S. Vision and visual plasticity in ageing mice. Restorative Neurology and Neuroscience. 30, 161-178 (2012).
  32. Leinonen, H., Tanila, H. Vision in laboratory rodents-tools to measure it and implications for behavioral research. Behavioral Brain Research. 352, 172-182 (2018).
  33. Spielmann, M., Schröger, E., Kotz, S. A., Pechmann, T., Bendixen, A. Using a staircase procedure for the objective measurement of auditory stream integration and segregation thresholds. Frontiers in Psychology. 4, 534 (2013).
  34. Shi, C., et al. Optimization of optomotor response-based visual function assessment in mice. Scientific Reports. 8 (1), 9708 (2018).
  35. You, M., Yamane, T., Tomita, H., Sugano, E., Akashi, T. A novel rat head gaze determination system based on optomotor responses. PLoS One. 12 (4), 0176633 (2017).
  36. Whyte, A. J., et al. Reward-related expectations trigger dendritic spine plasticity in the mouse ventrolateral orbitofrontal cortex. The Journal of Neuroscience. 39 (23), 4595-4605 (2019).

Tags

Beteende Problem 164 diabetesretinopati näthinna Y-labyrint optomotorsvar undersökande beteende rumslig frekvens kontrastkänslighet rumsligt minne spontan växling

Erratum

Formal Correction: Erratum: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats
Posted by JoVE Editors on 01/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. The author list was updated.

The author list was updated from:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

to:

Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Stephen Q. Phillips1, Amber Douglass1, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally

Beteendemässig bedömning av visuell funktion via optomotorisk respons och kognitiv funktion via Y-Maze hos diabetiker råttor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gudapati, K., Singh, A.,… More

Gudapati, K., Singh, A., Clarkson-Townsend, D., Phillips, S. Q., Douglass, A., Feola, A. J., Allen, R. S. Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. J. Vis. Exp. (164), e61806, doi:10.3791/61806 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter