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Summary
糖尿病の結果としての目と脳の両方の神経変性は、げっ歯類に対して行われる行動検査を通じて観察することができる。Y迷路、空間認知の尺度、および視機能の尺度である光運動応答は、両方とも潜在的な診断と治療に関する洞察を提供する。
Abstract
視運動応答とY迷路は、それぞれ視覚機能と認知機能を評価するのに有用な行動検査である。検眼応答は、糖尿病性網膜症を含む多くの網膜疾患モデルにおける空間周波数(SF)およびコントラスト感受性(CS)閾値の経時変化を追跡するための貴重なツールです。同様に、Y迷路は、中枢神経系に影響を与える多くの疾患モデルにおける空間認知(自発的な交代によって測定される)および探索的行動(多数のエントリによって測定される)を監視するために使用することができる。光運動応答とY迷路の利点は、感度、テストの速度、自然応答の使用(トレーニングは必要ありません)、および目覚め(非麻酔)動物に実行される能力を含みます。ここでは、オプト運動応答とY迷路の両方についてプロトコルが記載されており、その使用例はI型およびII型糖尿病のモデルに示されている。方法には、げっ歯類や機器の調製、検眼応答とY迷路の性能、および試験後のデータ分析が含まれる。
Introduction
4億6,300万人以上の人々が糖尿病と一緒に暮らしており、世界で最大の病気の流行の1つとなっています。糖尿病に起因する重篤な合併症の1つは、アメリカの成人の失明の主な原因である糖尿病性網膜症(DR)である2。今後30年間で、DRのリスクを持つ人口の割合は2倍になると予測されるため、DRの開発を予防し軽減するために、初期段階でDRを診断する新しい方法を見つけることが重要です3。DRは従来、血管疾患4,5,6であると考えられている。しかし、血管病理に先行する神経機能障害とアポトーシスの証拠が現在、DRは神経および血管成分4,5,6,7,8,9を有すると定義されている。DRを診断する1つの方法は、他の神経組織10よりも糖尿病による酸化ストレスや代謝株に対してより脆弱である可能性のある組織であるレティナの神経異常を調べることである。
認知機能と運動機能の低下は、糖尿病でも起こり、しばしば、疾患の変化と相関する。II型糖尿病の高齢者は、ベースライン認知能力の低下を描写し、対照参加者11よりも悪化した認知機能低下を示す。さらに、レティナは中枢神経系の延長として確立されており、病理はretina12に現れる可能性がある。臨床的には、アルツハイマー病および他の疾患の文脈で、レティナと脳の関係は研究されているが、一般的に糖尿病12、13、14、15、16で探索されていない。糖尿病の進行時の脳とレチナの変化は、STZラット(毒素、ストレプトゾトシンまたはSTZが膵臓ベータ細胞に損傷を与えるために使用されるI型糖尿病のモデル)や後頭柿ラット(動物が3週齢頃に高血圧を発症するII型糖尿病のポリジェニックモデル)を含む動物モデルを使用して探索することができる。このプロトコルでは、糖尿病性げっ歯類における認知的および視覚的変化を評価するためのY迷路および眼運動応答についての説明がそれぞれ提供される。光運動応答(OMR)は、各眼17の視覚閾値を測定するために特徴的な反射的なヘッド追跡の動きを監視することによって、空間周波数(視力に似ている)とコントラスト感度を評価します。空間周波数とは、バーの太さまたは細かさを指し、コントラスト感度とは、バーと背景のコントラストの程度を指します(図1E)。一方、Y迷路は、迷路の腕を通して自発的な交代とエントリを通して観察される短期的な空間記憶と探索的機能をテストします。
両方のテストは、目を覚まし、麻酔をしない動物で行われ、動物の生来の応答を利用する利点があり、訓練を必要としないことを意味する。どちらも比較的敏感であり、げっ歯類の糖尿病の進行の早い段階で赤字を検出するために使用することができ、信頼性があり、他の視覚、女性、または行動検査と相関する結果を生み出すという。さらに、OMRとY迷路を電気レチノグラムや光学コヘレンス断層撮影スキャンなどのテストと組み合わせて使用すると、疾患モデルにおいて、レチナル、構造、認知の変化が互いに相対的に発達する時期に関する情報を提供することができます。これらの調査は、糖尿病によって起こる神経退性を同定するのに役立つ可能性がある。最終的には、これは進行の初期段階でDRを効果的に識別する新しい診断方法につながる可能性があります。
このプロトコルの開発に使用されるOMRとY迷路システムは 、材料表に記載されています。OMRに関するこれまでの研究は、プルスキーら18、およびY迷路、モーリスら19によって、このプロトコルを開発するための出発点として使用された。
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Protocol
すべての手続きは、アトランタ退役軍人事務施設動物のケアと使用委員会によって承認され、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイドに準拠しました(NIH出版物、第8 版、2011年更新)。
1. オプトモーター応答(OMR)
- OMR装置の設定(材料表の装置とソフトウェアの詳細)
- げっ歯類に適したサイズのプラットフォーム(マウス、ラット、または大/障害のあるラット)を選択します(図1A)。
- OMRソフトウェアを開き、オプションの複数のタブとOMR/仮想ドラムの内部のライブビデオフィードを持つウィンドウに開く必要があります(図1B)。必要に応じてビデオカメラでズームインまたはズームアウトして、プラットフォームとその周囲を表示します。
- ライブイメージの左側にあるアイコンを確認します(図1C)。緑色のアスタリスクと緑の回転ストライプの両方がライブフィードから消えるように、アスタリスクアイコンと回転ストライプアイコンをクリックします。
- コンパス アイコンをクリックして、緑色の円と 2 本の垂直線が表示されるようにします。緑色の円を伸ばしてプラットフォーム上の黒い円と完全に一致するようにして、OMR が完全に整列するようにします。
- テスト中に円を見る必要がないので、 コンパスアイコン をクリックしてください。 緑色のアスタリスクアイコン と 緑の回転ストライプアイコンを クリックすると、これらのアイコンが再表示されます。緑色のストライプはドラムのストライプと同じ方向に回転し、研究者はストライプの方向を知ることができます。
- [ テスト ] タブをクリックします。[ テスト] の [ 心理物理学 ] タブをクリックします。[ しきい値] で、[ 周波数 ] を選択して空間周波数を測定します。
注: OMR ソフトウェアは、階段パラダイムを使用して、空間周波数 (SF) を自動的に計算します。コントラストは100%に維持されます。 - [ テスト] の [プリセット] タブ を クリックします。Mouse18 または Rat20 のデフォルト設定を選択します。
- [ テスト] の [ ブランキング ] タブをクリックします。マウスが右クリックされるたびにドラム内のコンピュータ画面のストライプ/ブランクを一時停止する [トラッキング 時に空白]ボックスをオンにします。
- [ 結果 ] タブをクリックすると、テストの結果が表示されます。
- 空間周波数の評価
- 12°/sの速度でチャンバを周回する垂直正音波格子を示す4台のコンピュータモニタからなるバーチャルリアリティチャンバーの中央にある円形プラットフォーム上にげっ歯類を置きます(図1D)。
- チャンバーの上部に配置されたビデオカメラは、げっ歯類の動作をコンピュータモニターに生き生きと映し出していることに注意してください。
- 格子が時計回りまたは反時計回りに移動する場合、げっ歯類の頭による反射的な動作の有無を探します。図示されたバーがプログラムに表示されていることを確認します。
- げっ歯類の頭がグレーティングと同じ方向に動くのを見てください。頭の動きの不安定なバーストではなく、スムーズな追求が起こるまで待って、追跡としてカウントします。
- [ はい ] または [ いいえ ] をクリックします。SF は 0.042 cyc/deg から始まり、各 yes と no を調整して、より簡単または難しくなるようにします(図 1E)。誤って [はい] と [いいえ] をクリックしたためにテストをリセットする必要がある場合は、[ リセット ] をクリックします。
- げっ歯類がテストされると、げっ歯類の頭の上にアスタリスクを置くようにしてください。
注: これは 2 つの効果があります: 1) 正しい空間周波数を維持します。たとえば、アスタリスクが肩の間に配置されている場合、空間周波数が低くなり、バーが見やすくなり、スコアが誤って高くなります。2)わずかな頭の動きを持つげっ歯類の場合、アスタリスクは、頭が実際に動いているかどうかを測定することが容易になります。 - げっ歯類の空間周波数に達したときにシステムが「完了」と言うのを見てください。 [はい ] ボタンと [いいえ ] ボタンはクリックできなくなります。
- [ 結果 ] タブをクリックすると、左目、右目、および結合された目の空間周波数が表示されます。
注:ソフトウェアは、結果が反転する、すなわち、右目が左目として報告され、左目が右目として報告されるように設定されている場合があります。これは、緑内障モデルで1つの目しか病変していなかったげっ歯類を評価する際に発見された。
- コントラスト感度の評価
注: コントラスト感度テストは、空間周波数測定ステップの直後または同じ日または別の日に、空間周波数テストの後にげっ歯類が疲労しているように見える場合に実行できます(コントラスト感度のみをテストする場合は、手順1~2.2に従います)。- [ テスト ] タブをクリックし、[ 精神物理学 ] タブをクリックします。[ しきい値] で [ コントラスト (単一)] を選択して、コントラスト感度を測定します。
- また、階段パラダイムを使用して、コントラスト感度(CS)曲線のピーク時にSF定数でグレーティングを開始します。これを行うには、[ 刺激 ]タブをクリックし、[ グレーティング ]タブをクリックします。[ 空間周波数 ] ボックスで、ラットの 場合は 0.064 、マウスの場合 は 0.103 と入力します。
- 100%からコントラストを開始し、空間周波数テストで見たのと同じ反射的な頭部の動きを探します。試験が進むにつれてコントラストは、げっ歯類が刺激に反応して反射的な頭部の動きを持たなくなるまで減少することに注意してください(図1E)。
- システムが「完了」と表示され、[ はい ]ボタンと [いいえ ]ボタンは、げっ歯類が視覚刺激に応答しなくなり、コントラスト感度のしきい値に達するとクリックできなくなるのを監視します。[ 結果 ]タブをクリックすると、左目、右目、および結合された目のコントラスト感度が表示されます。
- テスト後の分析を実行する
- 両眼が同様の欠損を有すると予想される糖尿病性網膜症の研究では、組み合わせたスコア(左右の目の平均)を分析に使用します。眼に差動損傷を起こすモデル(例えば、爆風損傷や緑内障)については、左右の目のデータを別々に保ちます。
- [空間周波数] では、分析に生のスコア ( [結果 ] タブのデータ) を使用し、これらのスコアをグループ別に平均化します (たとえば、糖尿病、制御など)。
- コントラスト感度の場合、生の値を使用して、以前の画面の輝度の測定とは対照的に、ミッシェルソンのコントラストによって報告されたコントラスト感度を計算します。
2. Y迷路
-
テスト用のげっ歯類を準備する
- テスト前に30分間、げっ歯類を部屋に適応させろ。
注:研究者はライトをつけたまま部屋に残ることができますが、この間は静かにしてください。 - 動物にとって安全な消毒液でY迷路を洗浄し、ペーパータオルですべての消毒液を拭き取ります。迷路が乾燥していることを確認します。
- テスト前に30分間、げっ歯類を部屋に適応させろ。
-
Y迷路を指揮する
- Y迷路の初期アームをB、他の2アームをAとCとラベル付けします(図2A)。Y迷路の中心近くの研究者(腕B)に最も近い腕にげっ歯類を1つ置きます。げっ歯類が配置されたら、タイマー( 材料のテーブルで迷路とタイマーの詳細)を開始します。
- 各げっ歯類が8分間Y迷路を探索できるようにします。この時間の間に録音を取り、任意の観察をメモします。迷路を視界に入れながら迷路から数フィート離れたところに座り、騒音を出さないようにしてください。
- 開始位置を A として記録し、げっ歯類が新しいアームに入るたびに、げっ歯類の新しい位置を記録します(図 2B)。げっ歯類の4つの手足すべてが腕の1つに入っているエントリとして定義します。
- げっ歯類が隠れて迷路の片腕に静止したままにするのを見てください。げっ歯類が60以上同じ場所に残っていて、探索的な行動を示していないように見える場合は、げっ歯類をY迷路の中心に向かって動かし、裁判を続けます。
- 各げっ歯類の後、任意の便を除去し、消毒溶液で迷路をきれいにします。
- すべての消毒液がペーパータオルで拭き取られ、迷路が完全に乾燥していることを確認してから、迷路に次のげっ歯類を置きます。
- Y迷路の初期アームをB、他の2アームをAとCとラベル付けします(図2A)。Y迷路の中心近くの研究者(腕B)に最も近い腕にげっ歯類を1つ置きます。げっ歯類が配置されたら、タイマー( 材料のテーブルで迷路とタイマーの詳細)を開始します。
-
自発的な交代と探索的挙動を計算する
- 探索的動作を 8 分の間に行われたエントリの合計数として計算します。
- 自発的な交代によって測定された空間認知を計算する:
成功したオルターネーションの数/(エントリの合計数 - 2)- げっ歯類が 3 つの異なる場所に順番に移動する際に、正常な交代を定義します (例: ABC、CAB、BCA など)。各正常な切り取りに注意してください(図 2B)。
- 動きがACABCABABCABCとして記録された場合、自発的な交代(分母に11の動きがある)を計算する際に、2つの初期の開始位置を無視してください。正確な動きの数を数えます(正確な動き= 8)。パーセント精度を計算します: 8/(13 - 2) = 72.7%
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Representative Results
空間周波数とコントラスト感度のしきい値をげっ歯類から取得できる場合、OMR は成功と見なされます。ここでは、空間周波数を評価するためのOMRの使用は、若い(3-6ヶ月)と高齢者(9-12ヶ月)の両方のナイーブコントロールブラウンノルウェーとロングエバンスラットで示されています。ブラウンノルウェーラットは、典型的には、ロングエバンスラットよりも高いベースライン空間周波数を示す。さらに、ロングエバンスラットでは空間周波数に対する老化効果が認められた(図3A)。若い結果と老化した結果が異なるコホートから来たため、データは一方向のANOVAを使用して分析され、その後ホルムス・シダックのポストホック比較が行われました。
OMRを用いてコントラスト感受性を評価することは、運動介入治療を受けたI型糖尿病のSTZモデルに示されている。ロングエバンスラットは、コントロール、コントロール+アクティブ、糖尿病、糖尿病+アクティブの4つのグループのいずれかに割り当てられました。糖尿病ラットは、膵臓ベータ細胞を損傷し、高血糖を誘導するために毒素STZの静脈注射を与えられた。活動ラットは週5日トレッドミル運動の30分を受けた。不活性ラットはロックされたトレッドミルを持っていた。糖尿病ラットではコントラスト感受性の著しい欠損(図3B)が認められた。運動治療はこれらの赤字を減らした(図3B)。これらの結果は、OMRが時間の経過とともにレチンの欠損を検出および追跡し、治療および介入が疾患に及ぼす影響を評価するのに有用であることを示している22。データは、双方向反復測定ANOVAを用いて分析し、続いてホルムス・シダック後の比較を行った。結果は、制御に正規化されたデータとして(図3B)または生の値として提示される可能性があることに注意してください(図3A;空間周波数:サイクル/度またはc/d;コントラスト感度:任意の単位またはa.u.)通常、OMRとの有意な差を見つけるためには、傷害の重症度に応じて6〜10匹の動物が必要です。
げっ歯類が8分以内に迷路の少なくとも5つの腕に入ると、Y迷路は成功と見なされます。ここでは、Y迷路が認知機能と探索的行動を評価する能力が、2~3週齢から始まる適度な高血糖を発症し、インスリン補充を必要としないII型糖尿病のポリジェニックで非肥満モデルである後頭柿崎ラットに示されている。自然発生的な交互作用(図4A)で測定した空間認知の著しい欠損、および探索的挙動は、エントリ数(図4B)で、7週齢から始まるウィスターコントロールと比較して、後藤柿崎ラットで観察された。対照ラットは、探索的行動が4週間から8週間に減少することを示すようだ。この傾向は、長期研究(8+年齢の8ヶ月)でも観察されます。動きの減少は、繰り返し迷路暴露を伴う新規性の欠如または年齢とともに一般的な動きの減少による可能性があります。対照ラットは、4〜8週間の空間認知の増加を示すように見える。この傾向は、動物が毎週ではなく毎月実行される長期研究では観察されない(実際には、老化に伴う減少がしばしば観察される)、したがって、空間認知のこの増加は、週に一度迷路を走らせる学習効果によるものかもしれない。データは、双方向反復測定ANOVAを用いて分析し、続いてホルムス・シダック後の比較を行った。最低10匹の動物は、傷害の重症度に応じて、Y迷路との有意な差を見つけるために必要とされる。
このプロトコルは、I型およびII型糖尿病のモデルにおいて視覚機能および認知機能データを生成した。個々の動物のスコアを一緒に平均し、糖尿病の進行の早い段階で治療群間の有意な違いを検出するために使用された。糖尿病などの全身疾患のモデルで経時的に陰性評価と認知評価の両方を行うことで、時間の経過とともに赤字の一時的な出現を監視することができます。例えば、後方柿モデルでは、認知的行動と探索的行動の欠損に先行する経月機能障害が示された(図5)。
図1:OMR機器のセットアップ (A) マウス、ラット、および大きなまたは障害のあるラットのプラットフォームの画像。(B) テスト中のコンピュータ画面の画像。(C) テスト中のボタンのパネル。(D)チャンバー内のプラットホーム上のラットの模式図。(e)空間周波数とコントラスト感度の増加を示すグラデーション例。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:Y迷路装置のセットアップ (A) 腕がラベル付けされたY迷路の写真。(B) Y迷路記録の例を示すラボノートブックの画像。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: OMR を使用して視覚機能を追跡する (A) 若年(n=11)および高齢者(n=15)ブラウンノルウェー(BN)および若年(n=20)および老化(n=13)ロングエバンス(LE)ラットの空間周波数閾値。この図は、201921年のFeolaらからのブラウンノルウェーのデータを示しています。(B)OMRを使用して、I型糖尿病のSTZラットモデルにおける運動の時間の経過とともに減少した腎機能と保護効果を追跡する。非アクティブな糖尿病ラット対活性糖尿病ラットおよび対照ラットのコントラスト感受性閾値。濃い灰色のアスタリスクは、コントロールグループと両方の糖尿病群の違いを表します。オレンジ色のアスタリスクは、不活性糖尿病ラットと活性糖尿病ラットの違いを表します。この図は、201822年のAllenらからのラットのサブセットからのデータを示す。平均 ± SEM. ** p < 0.01, *** p < 0.001. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:Y迷路を使用して、Wistarコントロールと比較して、II型糖尿病の後藤柿モデルにおける認知機能と探索的行動を経て追跡する。 (A)後藤柿(糖尿病)ラットとウィスター(対照)ラットの認知機能(自然交替)4~8週齢(B) 4~8週齢の探索的行動(エントリー数)平均 ± SEM. ** p < 0.01, *** p < 0.001.アスタリスクは、各タイムポイントにおける後藤柿とウィスターラットの違いを表しています。ラットの1コホートのみを4週間から8週間まで実行した(GK:n= 7;ウィスター: n = 10)。他のすべてのコホートは5週間から8週間まで実行されました(GK:n = 22;ウィスター: n = 23) 合計 n の 29 (GK) と 33 (ウィスター) 週間 5 から 8.この数字は、201923年のAllenらから変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:II型糖尿病の後人柿モデルにおける機能変化の年表 高血糖症が出現した後、後方柿皮ラットで最初に観察された変化は、電気レチノグラム(ERG)で測定したレチナル機能で、4週齢で現れた。認知的および探索的行動の変化は、6週齢後に現れた。この数字は、201923年のAllenらから変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
OMRとY迷路は、時間の経過とともにげっ歯類の視覚機能および認知機能の欠損の非侵襲的評価を可能にする。このプロトコルでは、OMRとY迷路が糖尿病のげっ歯類モデルにおける視覚および認知的欠陥を追跡することが実証された。
プロトコルの重要なステップ
ザ OMR
OMRを実行して視覚機能を評価する際に考慮すべき重要な点は、使用されるテストパラメータ、試験の実験設計とタイミング、および測定を行う研究者の経験です。プロトコルの中で重要な手順の 1 つは、パラメータが正しく設定されていることを確認することです。さらに、セットアップの一部として、OMRチャンバーは、各げっ歯類の前と後に消毒液または別の承認消毒剤で洗浄する必要があります。また、対策を実施する研究者が訓練を受け、対策を実施する経験を積むことも重要です。最良の結果は、げっ歯類が落ち着いていて、実験を開始する前に30分間ケージに入れて部屋に慣れているときに見られます。また、新しい歪みで作業を開始するたびにベースラインの空間周波数とコントラスト感度を決定し、すべての歪みが同じベースラインレベルを示すわけではないことに注意することも重要です。ブラウンノルウェーラットは、ロングエバンスラットよりもベースライン空間周波数が高い。一方、アルビノラットの一部の株は空間周波数24を損なったようですが、アルビノラットの他の株は追跡行動を全く示していません。多くの要因は、OMR上のアルビノ動物の限られた応答に寄与する可能性があります:視神経線維の差影付けによる双眼性の乱れ、目の後ろのメラニンの欠如、および二重オプシンコーンの大部分。いずれにせよ、アルビノラットは、その性能が検出限界に近すぎる可能性があるため、OMR検査には適切でない可能性があります。
Y迷路
Y迷路を実行する上で重要な要素は、記録期間中の妨害を最小限に抑えることを含みます。迷路のげっ歯類の最初の配置は、げっ歯類が30分間部屋に順応することを許可した後にのみ行われるべきです。これにより、げっ歯類は新しい環境に合わせて調整され、交じろいろ要因がげっ歯類の正常な動作に影響を与えることを防ぐことができます。各試行中の妨害を最小限に抑えることは非常に重要です。これには、大きな音を避け、研究者がげっ歯類の目に見えなくなることを確認することが含まれます。これらの気晴らしはげっ歯類にストレスを引き起こす可能性があります。部屋の壁は、ニュートラルカラーでできるだけ裸のままにする必要があることに注意することも重要です。壁やポスターの明るい色はげっ歯類の邪魔になり、探索的な行動パターンに影響を与える可能性があります。
メソッドの制限と変更とトラブルシューティング
ザ OMR
OMRの潜在的な制限は、実験者のバイアスの影響を受ける可能性があり、OMRスコアリングが主観的であるため、異なる実験者はわずかに異なる結果を持つことができるということです。あまりにも微妙な頭の動きを見逃したり、探索的行動を頭の動きとして分類したりするのは簡単です。バイアスはOMRの結果に影響を与える可能性があるため、可能であれば実験者が治療群と研究計画にマスクされている場合に最適です。自動OMRの開発や2人のテスターの結果の比較は、実験者のバイアスを減らすのにも役立ちます。
OMR テスト中に発生する可能性がある一般的な問題の 1 つは、げっ歯類が繰り返しプラットフォームから飛び降り、視覚的なしきい値を取得することが困難な場合です。この場合は、注意して、ラットをプラットフォームにそっと戻します。また、翌日に再度ラットを測定する必要があるかもしれません。さらに、これまでに測定されたことのないラットは、OMRに入れられたときに探索的行動に従事する可能性があります。これが問題である場合、最初の測定の1週間後に追加のベースライン測定を行うと、精度が向上する可能性があります。これらの動作が過剰な量のテストは破棄する必要があります。
年齢や嗅覚の手がかりなどの他の要因も望ましくない活動に寄与する可能性があります。そのため、ラットの視覚システム開発のタイムラインに従って実験を設計し、各げっ歯類をテストする前後にプラットフォームとチャンバーを徹底的に清掃することが重要です。以前の研究では、空間周波数25に概日リズムがあることを示しているように、OMR測定が行われる時刻も考慮する必要があります。正午までにラットを走らせたのは、その焦点に最も適しているように見えます(レイチェル・アレンの研究室- 個人的な観察)。ラットがあまりにも気が散った場合、それは穏やかにOMRの外側をタップするのに役立ちます。
テストの実行速度も結果に影響します。げっ歯類が刺激に興味を失った場合、30分ほど後に測定の精度が低下する可能性があります。したがって、測定を約≤20分で測定すると、より正確な結果が得られる可能性があります。1 回のトライアルの期間 (SF または CS) は、エキスパートが 5 ~ 10 分、初心者が 30 分です。げっ歯類がほとんど動きを示していない場合、ほとんどの時間をグルーミングに費やしたり、バーの方向を見ていない場合は、疲労している可能性があります。げっ歯類は別の日に再び実行される可能性があります。また、SF および CS テストは、特に遅い可能性がある新しいテスターに対して、異なる日に実行できます。テストを実行する頻度は結果にも影響を与えますが、毎週または隔週で実行すると、動物はテストに慣れ続けることができますが、毎日または 1 日おきに実行すると hyperacuity26 が発生する可能性があります。1日に複数のトライアルを実行するわけではありませんが、同じ日にSFとCSの両方を同じ日に、あるいは同じ座り込みで実行することがよくあります。ラットのコホートを実行するための累積日次時間(n=10)は専門家にとって2時間である。
OMRは各目を独立して測定し、その結果、各目の視覚スコアが別々になります。緑内障のモリソンおよびマイクロビーズモデルおよび視神経クラッシュモデルでは、私たちの研究室は損傷していない眼27に損傷した目の影響を観察していません。ブラストモデルでは、ブラストを片目に向けて、対側の目は損傷を示しましたが、これは部分的な爆風効果28によるものでもあります。コントロールラットでは、時計回り方向と反時計回りの方向の間に結果に違いはありませんが、一部のげっ歯類はバイアスを持つことができます。したがって、OMRシステムが自動的に交互に行わない場合は、方向29を交互に行うのが最善でしょう。
疾患モデルに応じて、視覚機能の治療群の違いは、使用されるパラメータに応じて変化する可能性があります。たとえば、コントラスト感度をテストする場合、空間周波数が通常の空間周波数閾値を超えて解決が困難なレベルに設定されている場合、グループ間のコントラスト感度の差は小さくなります。しかし、空間周波数がラットにとって通常見やすいレベルに設定されている場合、グループ間のコントラスト感度の差は30大きくなります。したがって、OMR を実行するためのパラメータを設定する際には、げっ歯類の設計と通常の空間周波数閾値を検討することが重要です。
Y迷路
動物が怖がっていると、迷路の片隅で凍る可能性があります。また、部屋の外で大きな音が発生すると、動物が怖くなり、迷路で動かないことがあります。これらの問題を説明するために、研究者は最初にラットを部屋に順応させ、凍った動物を選択ポイントに移動したり、別の日に動物を再び走らせたり、赤い光で動物を走らせたりすることができます。また、概日リズムによる1日を通して活動レベルの変化を考慮するために、毎日同じ時間にY迷路を実行することをお勧めします。私たちは通常、正午までにラットを実行します(レイチェル・アレンの研究室- 個人的な観察)。1回のトライアル期間は8分(10分、クリーンアップ付き)です。1日に複数のトライアルを実行することはありません。追加のトライアルが必要な場合は、別の日にトライアルが実行されます。ラットのコホートを実行するための累積毎日の時間(n = 10)は2〜3時間です。年代変化の年齢関連の減少は、ラットの9-12ヶ月齢で、そして12ヶ月齢22ヶ月で探索的行動において観察された。
糖尿病性げっ歯類の探索的挙動と空間認知の両方が減少するが、両者は密接に相関しているようには見えないため、Y迷路試験の前に独自に運動活動を評価するわけではない。
既存/代替方法に関する方法の意義
ザ OMR
オプトキネティック追跡などの視覚機能検査の他の方法は、動物の頭部を所定の位置に固定し、眼球の動きを追跡することに依存しています。拘束されていない検眼応答(OMR)試験は、げっ歯類の視覚機能の縦方向、非侵襲的、および信頼性の高い測定を可能にします。本プロトコルでは、OMRを使用して各眼の空間周波数およびコントラスト感度の閾値の両方を定量化する方法を説明した。この方法は、糖尿病などの疾患における初期の神経機能障害を検出するのに非常に有用である可能性があります。視覚的な水のタスクなどの他のテストは、空間周波数31を測定するためにも使用することができますが、これは変更されたY迷路の勾配に向かって泳ぐためにげっ歯類を訓練することを含むので、タスクは時間がかかり、多くのトレーニングを伴います。さらに、OMRは、傷害が片方の眼に向けられ、もう片方の眼が対側制御(例えば、多くの緑内障モデル)として機能するモデルで有用である、各眼の値を独立して測定する。さらに、OMRは、糖尿病後3~4週間の早い時期に変化を検出できる、他の視覚評価よりも早い、敏感な評価です。電気生理学的アッセイは、行動視覚検査に代わるものです。電解法(ERG)は、OMRよりも利用可能であり、ERG wave32 の異なる成分を使用して正確な細胞タイプの欠損を決定することができます(a-波は感光体細胞機能を表し、b波は双極性細胞機能を表します)。一方、OMRは、経路に沿って正確な故障点を明らかにすることなく、視覚機能の欠陥を決定するために使用することができます。しかし、OMRはERGよりもDRのより敏感な尺度であり、OMR欠損は通常高血糖後2~4週間の間に見られ、ERG欠損はげっ歯類の高血糖後4~8週間に見られる。重度の糖尿病性白内障はOMRに影響を与える可能性があります。しかし、げっ歯類の糖尿病性白内障は麻酔下で現れたり悪化したりするため、麻酔を必要とするERGや光学コテレンス断層撮影などの検査は、目覚めの動物で行われるOMRよりもはるかに頻繁に影響を受ける。
Y迷路
Y迷路は、モリス水迷路のような空間認知に依存していますが、強い負の刺激(すなわち、水)を使用して動物がタスクを実行する動機付けをしません。したがって、Y迷路は動物にとってストレスが少なく、また実行しやすいです。しかし、Y迷路はモリスの水迷路やバーンズ迷路ほど敏感ではない可能性があります。モリス水迷路とは異なり、Y迷路は自動動作であり、訓練を必要としません。このように、Y迷路の実行に伴う時間負担ははるかに低くなります。
この方法の結論と今後の応用または方向
ザ OMR
OMRは頭の動きを追跡することによってげっ歯類の視覚機能の測定を取る場合に有用である。これは効果的な方法ですが、プロトコルを改善するために継続的に行われる更新と追加があります。いくつかの新しい方法は、正の指標としてヘッドトラッキングと組み合わせた負のOMR指標として頭を一時停止げっ歯類を利用します33.これにより、視機能34のより迅速かつ正確な測定が可能になります。このプロセスが変更されたもう一つの方法は、人間のテスター35から生じる可能性のある矛盾を減らすために人工マーカーなしで自動的に頭部を追跡するシステムを開発することです。2016年現在、qOMRと呼ばれる自動または定量的なOMRシステムが十分に開発され、市販されています。上記のプロトコルでは、OMRは糖尿病ラットの空間周波数とコントラスト感度の欠損と、治療(運動)による欠損に対する保護を検出することができた。
Y迷路
Y迷路は、探索的行動と空間認知に関する情報を明らかにし、7週で糖尿病性げっ歯類の行動障害を検出するためにここで使用されました。認知機能を観察する他のテスト(すなわち、モリス水迷路、バーンズ迷路、新しい物体認識)が存在し、これらのテストは認知機能の低下を早期に明らかにしたり、認知の異なる側面に関する情報を提供することができる可能性があります。Y迷路の今後の方向には、新しい物体または食物刺激を腕の1つに入れ、げっ歯類36の探索パターンを観察することがある。このバリエーションは、Y迷路の腕の1つをブロックし、げっ歯類が残りの2つの腕を探検することを可能にし、第3の腕へのアクセスを再開し、げっ歯類が3番目の小説の腕に費やす時間を評価することを含む。Y迷路に関して行うことができるもう一つの貴重な改善は、その動きを記録するためにげっ歯類の自動追跡を開発することです。これは、げっ歯類の動きを手動で記録する必要を排除し、自発的なオルターネーションの計算をより正確かつ効率的にします。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作品は退役軍人省のリハビリR&Dサービスキャリア開発賞(CDA-1、RX002111;CDA-2;RX002928)からRSA、AJFおよび国立衛生研究所(NIH-NICHD F31 HD097918からDACTおよびNIH-NIEHS T32 ES012870からDACT)およびNEIコアグラントP30EY006360に(
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OptoMotry HD | CerebralMechanics Inc. | OMR apparatus & software | |
| Timer | Thomas Scientific | 810029AR | |
| Y-Maze apparatus | San Diego Instruments | 7001-043 | Available specifically for rats |
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行動 問題 164 糖尿病性網膜症 網膜 Y迷路 検眼応答 探索的挙動 空間周波数 コントラスト感度 空間記憶 自発的な交互Erratum
Formal Correction: Erratum: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats
Posted by JoVE Editors on 01/05/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Behavioral Assessment of Visual Function via Optomotor Response and Cognitive Function via Y-Maze in Diabetic Rats. The author list was updated.
The author list was updated from:
Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally
to:
Kaavya Gudapati*1,2, Anayesha Singh*1,3, Danielle Clarkson-Townsend1,4, Stephen Q. Phillips1, Amber Douglass1, Andrew J. Feola1,2, Rachael S. Allen1,2
1Center for Visual and Neurocognitive Rehabilitation, Atlanta VA Medical Center,
2Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology,
3Department of Neuroscience, Emory University,
4Gangarosa Department of Environmental Health, Emory University
* These authors contributed equally
