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Biology

आंतों विली एपिथेलियम से ऑर्गेनॉइड की 3डी कल्टिंग डिफरेंटेशन से गुजर रही है

Published: April 1, 2021 doi: 10.3791/61809
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biology and Chemical Biology, Stevens Institute of Technology, 2Department of Pharmacology, Pennsylvania State University College of Medicine

Summary

प्रक्रिया माउस आंतों के एपिथेलियम से विली के अलगाव का वर्णन करती है जो उनके ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता निर्धारित करने के लिए डिफाइनेशन से गुजर रही है।

Abstract

आंतों के एपिथेलियम से ऑर्गेनॉइड की क्लोनोजेनिकिटी को उसमें स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। माउस छोटे आंतों के एपिथेलियम को क्रिप्ट्स और विली में विभाजित किया जाता है: स्टेम और प्रसार कोशिकाएं क्रिप्ट तक सीमित होती हैं, जबकि विली एपिथेलियम में केवल विभेदित कोशिकाएं होती हैं। इसलिए, सामान्य आंतों के क्रिप्ट, लेकिन विली नहीं, 3 डी संस्कृतियों में ऑर्गेनॉइड को जन्म दे सकते हैं। यहां वर्णित प्रक्रिया केवल विल्लस एपिथेलियम पर लागू होती है जो विवर्तन के दौर से गुजर रही है जिससे स्टेमनेस होती है। वर्णित विधि Smad4-हानि-समारोह का उपयोग करती है: β-catenin लाभ-समारोह (Smad4KO:β-cateninGOF)सशर्त उत्परिवर्ती माउस । उत्परिवर्तन आंतों विली को डिफरेंट करने और विली में स्टेम सेल उत्पन्न करने का कारण बनता है। आंतों के विली को कांच की स्लाइड का उपयोग करके आंत से स्क्रैप किया जाता है, 70 माइक्रोन छलनी में रखा जाता है और बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में चढ़ाना से पहले किसी भी ढीली कोशिकाओं या क्रिप्ट्स को फ़िल्टर करने के लिए कई बार धोया जाता है ताकि उनके ऑर्गेनॉइड-बनाने की क्षमता निर्धारित की जा सके। यह सुनिश्चित करने के लिए दो मुख्य मानदंडों का उपयोग किया गया था कि परिणामी ऑर्गेनॉइड को डिफरेंट विलस डिब्बे से विकसित किया गया था न कि क्रिप्ट्स से: 1) 3डी मैट्रिक्स में प्लेटिंग से पहले और बाद में किसी भी सीमित तहखाने की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए अलग विली का मूल्यांकन करना, और 2) विली से ऑर्गेनॉइड विकास के समय की निगरानी करना। विली से ऑर्गेनॉइड दीक्षा चढ़ाना के दो से पांच दिन बाद ही होती है और अनियमित रूप से आकार दिखाई देती है, जबकि एक ही आंतों के एपिथेलियम से क्रिप्टो-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड चढ़ाना के सोलह घंटे के भीतर स्पष्ट होते हैं और गोलाकार दिखाई देते हैं। हालांकि, विधि की सीमा यह है कि ऑर्गेनॉइड की संख्या बनती है, और विली से ऑर्गेनॉइड दीक्षा के लिए आवश्यक समय डिफरेंटेशन की डिग्री के आधार पर भिन्न होता है। इसलिए, उत्परिवर्तन की विशिष्टता या अपमान के आधार पर, जिस पर विली को उनके ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता को परखने के लिए काटा जा सकता है, अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।

Introduction

आंतों के क्रिप्ट लेकिन विली नहीं, मैट्रिगेल या बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में सुसंस्कृत होने पर ऑर्गेनॉइड बनाते हैं। ये ऑर्गेनॉइड स्वयं-आयोजन संरचनाएं हैं, जिसे अक्सर वीवोमें आंतों के एपिथेलियम में मौजूद विभिन्न विभेदित वंश, जनक और स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण "मिनी-पेट" के रूप में जाना जाता है। क्रिप्ट्स से ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता का कारण स्टेम सेल की उपस्थिति होती है1. दूसरी ओर आंतों की विली में केवल विभेदित कोशिकाएं शामिल होती हैं, और इसलिए ऑर्गेनॉइड नहीं बन सकते हैं। हालांकि, म्यूटेशन2 या शर्तें जो विलीस एपिथेलियम के विवर्तन की अनुमति देतीहैं,विल्ली2,3में स्टेम सेल का कारण बन सकती हैं। विली एपिथेलियम में स्टेमनेस के परिणामस्वरूप इस भाग्य परिवर्तन की पुष्टि 3 डी मैट्रिक्स में डिफिडेंटिंग विलीनस एपिथेलियम को चढ़ाना द्वारा पुष्टि की जा सकती है ताकि वे विल्लस एपिथेलियम में डी-नोवो स्टेमनेस के संकेतक के रूप में अपने ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता का निर्धारण कर सकें। इसलिए, इस प्रक्रिया का महत्वपूर्ण पहलू क्रिप्टो संदूषण की अनुपस्थिति सुनिश्चित करना है।

Smad4KO:β-cateninGOF सशर्त उत्परिवर्तन विली में प्रसार और स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित आंतों के एपिथेलियम में अलग-अलग कारण बनता है, और अंततः वायली में तहखाना जैसी संरचनाओं का गठन जिसे एक्टोपिक क्रिप्ट्स के रूप में जाना जाता है, स्टेम सेल की उपस्थिति इन अलग विली को एक्टोपिक क्रिप्ट्स(वीवो में) मेंस्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति और उत्परिवर्ती विली की क्षमता ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता द्वारा निर्धारित की गई थी। एन प्लेटेड मैट्रिगेल3. नीचे उल्लिखित प्रक्रिया Smad4KOमें डिफिंग आंतों के एपिथेलियम के स्टेमनेस की पुष्टि करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति को विस्तृत करती है: β-cateninGOF उत्परिवर्ती चूहों। विली को अलग-थलग करने के लिए इस पद्धति की एक प्रमुख विशेषता EDTA चेलेशन विधि4के विपरीत आंतों के ल्यूमेन के स्क्रैपिंग का उपयोग था। EDTA चेलेशन विधि के विपरीत, स्क्रैपिंग द्वारा विली अलगाव अंतर्निहित मेसेनचिम के बहुमत को बरकरार रखता है और सीमित क्रिप्ट के बिना विली उपज के लिए स्क्रैपिंग के दबाव को समायोजित करने की अनुमति देता है। स्क्रैपिंग का दबाव ऑपरेटर के लिए व्यक्तिपरक है, इसलिए, क्रिप्ट्स के बिना विली उपज के लिए इष्टतम दबाव ऑपरेटर द्वारा अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। इस प्रक्रिया का महत्वपूर्ण पहलू बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में चढ़ाना से पहले और बाद में विली की सूक्ष्म परीक्षा द्वारा तहखाना संदूषण की अनुपस्थिति सुनिश्चित करना है।

आंतों विली को ग्लास स्लाइड के साथ आंतों के ल्यूमेन को स्क्रैप किया जाता है और 70 माइक्रोन फिल्टर में रखा जाता है और ढीली कोशिकाओं या क्रिप्ट्स से छुटकारा पाने के लिए पीबीएस के साथ धोया जाता है, यदि कोई हो, तो बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में चढ़ाना से पहले। विधि तहखाना संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित मानदंडों पर जोर देती है: ए) विली फसल को डुओडेनम के समीपस्थ आधे हिस्से तक सीमित करना जहां विली सबसे लंबे समय तक हैं, ख) विली-उपज वाले स्क्रैप की संख्या को कम करना, सी) छह-अच्छी डिश में पीबीएस की एक श्रृंखला के माध्यम से विली युक्त फिल्टर को धोना, और डी) बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में चढ़ाना से पहले और बाद में सूक्ष्म परीक्षा द्वारा तहखाना संदूषण की अनुपस्थिति की पुष्टि करता है। ईडीटीए चेलेशन के बजाय स्क्रैपिंग द्वारा विली अलगाव, अंतर्निहित मेसेनचिम के पूर्ण नुकसान को रोकता है जो विलस एपिथेलियम से ऑर्गेनॉइड दीक्षा के लिए आला संकेत5,6,7,8, यदिआवश्यक हो तो प्रदान कर सकता है।

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Protocol

सर्वाइकल अव्यवस्था द्वारा टैमोक्सिफेन और इच्छामृत्यु के उपयोग सहित किए गए सभी माउस प्रयोगों को स्टीवंस इंस्टीट्यूट ऑफ एक्नोलॉजी में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति का अनुमोदन मिला था ।

1. चूहों

नोट: Smad4f/fकी पीढ़ी; कैटनबलोक्स (ex3)/ विल्लिन-क्रेERT2 चूहों को पहले3वर्णित किया गया है । आठ से बारह सप्ताह की उम्र के बीच वयस्क मादा चूहों का उपयोग किया गया था।

  1. Smad4KO:β-cateninGOF उत्परिवर्तन Smad4f/fमें प्रेरित; कैटनबलोक्स (ex3)/ लगातार चार दिनों के लिए मकई के तेल में टैमोक्सिफेन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ विल्लिन-क्रे ERT2।
  2. पहले टैमोक्सिफेन इंजेक्शन के दस दिन बाद चूहों द्वारा सर्वाइकल अपभ्रंश का त्याग करें।
  3. पेरिटोनियल गुहा में माउस फर को प्राप्त करने से रोकने के लिए पेट को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
  4. आंत को बेनकाब करने के लिए विच्छेदन कैंची के साथ पेट की गुहा खोलें। कैंची और संदंश की सहायता से आंत को अलग करें।
    नोट: Smad4 के सहवर्ती नुकसान के साथ-साथ आंतों के एपिथेलियम में β-कैटेनिन (Smad4KO;β-cateninGOF) के समारोह उत्परिवर्तन के लाभ के साथSmad4एफ/एफइंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया गया था; कैटनबलोक्स (ex3)/ Villin-CreERT2 चूहों हर दिन लगातार चार दिनों के लिए ०.०५ ग्राम टैमोक्सिफेन/मकई के तेल में किलो शरीर के वजन के साथ । इन चूहों को पहले टैमोक्सिफेन इंजेक्शन के दस दिन बाद काटा जाता है ताकि डिफरेंट विली में स्टेम सेल से जुड़े मार्कर व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की उपस्थिति सुनिश्चित की जा सके ।

2. डुओडेनम अलगाव और तैयारी

  1. ग्रहणेल के समीपस्थ आधे हिस्से को विच्छेदन करें।
  2. ल्यूमिनल कंटेंट को क्लियर करने के लिए 10 एमएल सिरिंज में 5 एमएल आइस-कोल्ड पीबीएस के साथ ड्यूडेनम फ्लश करें ।
  3. एक कोण कैंची के साथ डुओडेनम को खोलें और ऑपरेटर का सामना कर रहे डुओडेनम के ल्यूमेन के साथ बर्फ पर 15 सेमी पेट्री प्लेट पर डुओडेनम फ्लैट बिछाएं।

3. स्क्रैपिंग द्वारा विली अलगाव

  1. स्क्रैपिंग शुरू करने से पहले, 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के कुओं में से एक में 70 माइक्रोन जाल छलनी रखें। 1x PBS के 4 एमएल के साथ सभी कुओं को भरें और बर्फ पर 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट(चित्रा 1)रखें।
  2. दो सूक्ष्म ग्लास स्लाइड का उपयोग करके विली को कुरेदना: एक डुओडेनम को नीचे रखने के लिए और दूसरा परिमार्जन करने के लिए(चित्रा 1B1)।
    1. बलगम को हटाने के लिए दो बार डुओडेनम के चमकदार पक्ष को सतही रूप से और fro परिमार्जन करें। दबाव इस तरह लागू करें कि यह कदम बलगम की परत को हटा दे, लेकिन विली नहीं।
    2. डुओडेनम को फिर से परिमार्जन करें, दो बार 3..1 में एक ही दबाव लागू करने के लिए, जिसके दौरान विली को स्लाइड्स(चित्रा 1B2)पर इकट्ठा करते हुए देखा जा सकता है। यह इष्टतम दबाव है (जिसे ऑपरेटर द्वारा अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए) क्रिप्ट्स के बिना विली को उत्प्रांवित करने के लिए।
  3. विली को स्थानांतरित करने के लिए पीबीएस युक्त 1 एमएल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें (जो चरण 3.2.2.) से स्लाइड पर एकत्र किए जाते हैं, एक 6-अच्छी डिश में रखा गया 70 माइक्रोन मेश छन्नी में। विली इस प्रकार एकत्र कर रहे हैं, हर परिमार्जन के बाद(चित्रा 1B2)।
  4. ठंडे पीबीएस (~ 4 एमएल/वेल) युक्त 6-अच्छी डिश में कुओं की एक श्रृंखला के माध्यम से छलनी (विली के साथ) को स्थानांतरित करके 70 माइक्रोन छलनी (चरण 3.3 से) में एकत्र विली को धोएं। यह ढीले क्रिप्ट्स को हटाने के लिए है, यदि कोई हो।
  5. एक p1000 पिपेट का उपयोग करके, पीबीएस (~ 3 एमएल) में विली निलंबन को 70 माइक्रोन छलनी से बर्फ पर एक नई 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. एक ग्लास स्लाइड पर विली निलंबन के 50 माइक्रोन वॉल्यूम को एस्पिरेट करने के लिए 0.1% बीएसए कोटेड कुंद-एंडेड p200 पिपेट टिप का उपयोग करें। पीबीएस निलंबन में विली की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए 4x आवर्धन के तहत 50 माइक्रोन ड्रॉपलेट में विली की संख्या की गणना करें। उदाहरण के लिए, यदि जांच किए गए 50 माइक्रोल निलंबन में 10 विली हैं, तो विली एकाग्रता 0.2 विली/माइक्रोन है। यह भी सीमित तहखाने की अनुपस्थिति की पुष्टि करने का समय है।
  7. बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स के 0.5 विली/μL की एकाग्रता पर प्लेट करने के लिए आवश्यक विली निलंबन की मात्रा की गणना करें। पिपटिंग त्रुटि के लिए खाते में एक अतिरिक्त 100 माइक्रोल जोड़ें और विली की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक सूक्ष्म परीक्षा के लिए आवश्यक मात्रा।
    सावधानी: पहले दो स्क्रैप में उपयोग किया जाने वाला दबाव, जो बलगम को हटाता है लेकिन विली नहीं, बाद के स्क्रैप में उपयोग किया जाना चाहिए जिसके दौरान विली को जारी किया जाएगा। विली रिलीज के बाद पहली बार मनाया जाता है के बाद दो करने के लिए और fro scrapings की संख्या को सीमित करें । यह उपाय क्रिप्ट्स के साथ विली की रिहाई से बचता है। सीमित तहखानों की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए विली का सूक्ष्म मूल्यांकन करना आवश्यक है।

4. बीएमई-आर1 मैट्रिक्स पर विली की चढ़ाना

  1. 0.1% बीएसए कोटेड पी 200 कुंद-एंडेड पिपेट टिप का उपयोग करके, माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें विली की मात्रा (चरण 3.6 से) बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स के 12.5 माइक्रोल में ~ 6 विली प्रति अच्छी तरह से प्लेट करने के लिए आवश्यक है। इस बिंदु पर बीएसए-लेपित कुंद-समाप्त टिप का उपयोग यह सुनिश्चित करता है कि विली, जो एक नुकीले टिप के लिए बहुत बड़े हैं, बिना अवरुद्ध या टिप के किनारों पर अटके हुए बिना खोया हुआ है।
  2. एक रेफ्रिजरेटेड सेंट्रलाइज (4 डिग्री सेल्सियस) में 200 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए विली नीचे स्पिन और सुपरनेट को हटा दें।
  3. किसी भी अवशिष्ट पीबीएस को हटाने के लिए चरण 4.2 दोहराएं और एक लैमिनार फ्लो-हुड के तहत अगले चरण में आगे बढ़ें।
  4. बर्फ पर ठंड बीएमई-R1 गल की आवश्यक मात्रा में विली गोली धीरे से खर्च करें।
  5. एक p20 pipet का उपयोग करना, थाली १२.५ μL/बीएमई में विली के अच्छी तरह से 3 डी में ९६-अच्छी तरह से यू-बॉटम प्लेट में ।
  6. बीएमई-आर1 मैट्रिक्स के ठोसकरण की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  7. पूर्व गर्म ENR के १२५ μL/well जोड़ें (एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर/नोगिन/आर-स्पॉन्डिन1) मीडिया: उन्नत डीएमईएम एफ-12 मीडिया, 1x पेनिसिलिन के साथ पूरक: स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 mM HEPES, ग्लूटामैक्स, ५० एनजी/एमएल ईजीएफ, १०० एनजी/एमएल नोगिन, एचईसी 293-टी कोशिकाओं से 5% वातानुकूलित मीडिया आर-स्पॉन्डिन1, 1x N2, 1x B27, 1 m N-acetyl cysteine, और ०.०५ मिलीग्राम/m Primocin ।
  8. एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में प्लेटेड विली को 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है, और हर दूसरे दिन मीडिया को बदलता है।
  9. किसी भी कुएं को छोड़ दें जिसमें ऑर्गेनॉइड चढ़ाना के दो दिनों से पहले दिखाई देते हैं, क्योंकि शुरुआती समय बिंदु जिस पर विली-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड दो दिनों के बाद की उम्मीद है।
    नोट: किसी भी विली जिसमें विली की आधी या आधी से अधिक लंबाई होती है, उसे एक विलस के रूप में गिना जाता है। क्रिप्टो-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड के विपरीत, प्लेटिंग के 24 घंटे के भीतर विली-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड की उम्मीद नहीं की जाती है। ऑर्गेनॉइड शुरू करने वाली विली ऑर्गेनॉइड बनने से पहले अंधेरा और सिकुड़ती दिखाई देती है। इसलिए, चढ़ाना के एक दिन के भीतर विकसित ऑर्गेनॉइड के साथ किसी भी कुओं को प्रशंसनीय तहखाना संदूषण से प्राप्त होने की प्रशंसनीयता से बचने के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए। वातानुकूलित मीडिया का उत्पादन करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति अनुरोध पर उपलब्ध है।

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Representative Results

प्रक्रिया की सफलता के लिए निर्धारक कारक तहखाना संदूषण को रोक रहा है। विली से ऑर्गेनॉइड विकास (और किसी भी दूषित क्रिप्ट से नहीं) चार प्रमुख मानदंडों की पुष्टि करके सुनिश्चित किया जाता है: 1) बीएमई-आर 1, 2 में विली चढ़ाना से पहले और बाद में सूक्ष्म परीक्षा द्वारा काटा विली की शुद्धता सुनिश्चित करना) सभी प्लेटेड विली व्यक्तिगत रूप से, 3) के दृश्य की अनुमति देने के लिए प्रति अच्छी तरह से सीमित संख्या में प्लेटिंग समय पाठ्यक्रम की छवियां विली(चित्र 3)और 4) से ऑर्गेनॉइड के विकास को दिखाती हैं, जो विल्ली से शुरू होने वाले ऑर्गेनॉइड की काइनेटिक्स और रूपात्मक उपस्थिति को समाप्त करती हैं; विली से शुरू होने वाले ऑर्गेनॉइड पहले अनियमित रूप से आकार के दिखाई देते हैं और क्रिप्ट-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड (EDTA/PBS चेलेशन विधि1,4)का उपयोग करके क्रिप्ट को अलग करके सुसंस्कृत के रूप में 4x आवर्धन के तहत देखे जा सकते हैं और दो से पांच दिन लेते हैं जो रातोंरात अच्छी तरह से परिभाषित सीमाओं(चित्र 2)के साथ गोलाकार संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं ।

विली के ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता के परीक्षण के लिए चूहों का त्याग करने के लिए इष्टतम समय विली-एपिथेलियम एक्सप्रेस स्टेम सेल मार्कर के बाद होता है और वीवो में विली में एक्टोपिक क्रिप्ट्स का विकास शुरू करता है (Smad4f/fके टैमोक्सिफेन इंजेक्शन के लगभग 10 दिन बाद; कैटनबलोक्स (ex3)/ विल्लिन-क्रेईआरटी 2 चूहों)। इन चूहों में टैमोक्सिफेन अकांक्षित क्रे-रिकॉम्बिनेस होता है जो टैमोक्सिफेन के साथ β-केटाइन सक्रियण के साथ Smad4 हानि सहवर्ती का कारण बनता है। एक्टोपिक क्रिप्ट्स उत्परिवर्तन के शामिल होने के दो सप्ताह के भीतर पूरी तरह से विकसित होते हैं, जबकि विवो में उत्परिवर्तन के प्रेरण के एक सप्ताह के भीतर विल्लस एपिथेलियम में स्टेम सेल दिखाई देतेहैं। मैट्रिगेल में चढ़ाए जाने पर ऑर्गेनॉइड बनाने वाली विली की संख्या 2% से 12%3के बीच भिन्न होती है । जब स्टेम सेल मौजूद होते हैं चारों ओर विली चढ़ाना के लिए उत्परिवर्ती माउस की कटाई (क्रे-रीकॉम्बिनेज प्रेरण के लगभग एक सप्ताह बाद) विली-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड के लिए आवश्यक समय को लम्बा कर देगा, जबकि क्रे-इंडक्शन के बाद दस दिनों के लिए फसल में देरी से संदूषण का जोखिम तहखाना बढ़ जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1:प्रायोगिक सेट-अप और विली स्क्रैपिंग आंतों के एपिथेलियम से। A)पीबीएस में ट्यूबिंग और फिल्टर (फ्लिटआर) के साथ पीबीएस से भरी सिरिंज (सिरग) । B)विली अलगाव स्क्रैपिंग(B1)और एक फिल्टर(B2)को स्थानांतरित करने के द्वारा । तीर स्लाइड पर एकत्र विली को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:एक ही माउस आंत से डिफरेंट विली एपिथेलियम बनाम क्रिप्ट्स से उभरने वाले ऑर्गेनॉइड की उपस्थिति में अंतर: ए) कार्टून जिसमें विलस और क्रिप्ट्स दिखाई देते हैं। B)पूरी माउंट (पीबीएस में) ढलाई (शीर्ष पैनल) और EDTA-chelation (निचले पैनल) द्वारा तैयार तहखाने द्वारा तैयार की गई । C)विली-व्युत्पन्न (शीर्ष पैनल) और क्रिप्ट-व्युत्पन्न (लोअर पैनल) ऑर्गेनॉइड बीएमई-आर 1 (स्केल बार, 500 उम) में एक ही माउस आंतों के एपिथेलियम से। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:डिफरेंट विली से ऑर्गेनॉइड फॉर्मेशन का टाइम कोर्स। दो अलग-अलग विली से ऑर्गेनॉइड दीक्षा दिखाई जाती है (बॉक्स्ड क्षेत्रों को मध्य और नीचे पैनलों में बढ़ाया जाता है)। ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता के साथ विली घने दिखाई देती है, संभवतः अंतर्निहित मेसेनचिम की अवधारण के कारण। विल्लस से ऑर्गेनॉइड दीक्षा दो दिन (ठोस तीर) में से एक विली (टूटी हुई सीमा के साथ बॉक्स) से स्पष्ट है, जबकि अन्य विलस (ठोस सीमा के साथ बॉक्स) में ऑर्गेनॉइड दिन चार (तीर) पर दिखाई देता है। दिन में ऊपरी बॉक्स 6 पैनल एक विकसित विली-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड दिखाता है। स्केल बार, 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह विधि वीवो में स्टेम सेल मार्कर प्राप्त करने वाले विली एपिथेलियम को अलग करने की आत्म-नवीकरण क्षमता की पुष्टि कर सकती है। सामान्य आंतों के एपिथेलियम तहखाने से ऑर्गेनॉइड को जन्म दे सकते हैं, लेकिन विली डिब्बे नहीं, जब क्रिप्ट्स 1 में स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण3डी में सुसंस्कृत होते हैं। इस प्रकार, 3 डी संस्कृतियों में सुसंस्कृत डिफरेंट विली एपिथेलियम से ऑर्गेनॉइड गठन सेल भाग्य उत्क्रमण से स्टेम सेल गठन की पुष्टि करता है। म्यूटेशन और/या चोट से उत्पन्न होने वाले आंतों के एपिथेलियम में कोशिका भाग्य पलटने की रिपोर्ट 2,3,9,10,11,12बढ़ रही है । इसलिए, यह विधि इसी तरह के परिदृश्यों में लागू होती है जहां विवो मेंविल्ली एपिथेलियम एक्सप्रेस स्टेम सेल मार्कर होते हैं।

हमने स्कैड4कोके विली से ऑर्गेनॉइड के विकास की पुष्टि की: β-कैटेनिनजीओएफ उत्परिवर्ती समय पाठ्यक्रम के माध्यम से विली(चित्रा 3)से ऑर्गेनॉइड के विकास को दिखाता है। सबसे महत्वपूर्ण पहलू तहखाना संदूषण के खिलाफ एहतियाती उपाय कर रहा है, जो झूठी सकारात्मक करने के लिए नेतृत्व करेंगे । चढ़ाना से पहले और बाद में विली तैयारी की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए निम्नलिखित उपाय किए गए थे: क) डुओडेनम के समीपस्थ आधे हिस्से से विली का अलगाव जहां विली सबसे लंबे समय तक हैं, ख) स्क्रैप की संख्या को कम करने और सीमित तहखाने के बिना विली उपज के लिए स्क्रैपिंग के दबाव को समायोजित करने, ग) किसी भी ढीले क्रिप्ट्स या कोशिकाओं डी को बाहर करने के लिए उन्हें 70 माइक्रोन जाल छलनी में रखने के बाद पीबीएस के साथ विली धोना) चढ़ाना से पहले और बाद में काटा विली की सूक्ष्म परीक्षा, और ई) प्रति अच्छी तरह से बैली चढ़ाया की संख्या को कम करने ताकि वे चढ़ाया मैट्रिक्स में व्यक्तिगत रूप से कल्पना की जा सकती है ।

प्रक्रिया को अनुकूलित करने के लिए कई विचार किए गए थे। सबसे पहले, हमने समीपस्थ डुडेनम से विली काटा जहां विली सबसे लंबे समय तक हैं। छोटी आंत में विभेदन और प्रसारीय डिब्बों के बीच शारीरिक चित्रण हमें क्रिप्ट्स से विली को यांत्रिक रूप से अलग करने के लिए स्क्रैपिंग अपनाने की अनुमति देता है। इस प्रकार इस विधि को केवल उन मामलों में अपनाया जा सकता है जहां भेदभाव और प्रसारीय डिब्बे के बीच विभाजन को कड़ाई से चित्रित किया जाता है - जैसा कि छोटी आंत में होता है लेकिन पेट में नहीं। दूसरे, हमने वीवो में देखी गई डिफरेंटेशन की डिग्री के आधार पर म्यूटेशन को शामिल करने के बाद विली आइसोलेशन के समय को अनुकूलित किया । सशर्त Smad4KOमें डिफरेंटेशन: β-कैटेलिनजीओएफ उत्परिवर्ती को क्रमशः सात और दस दिनों के भीतर विल्लस एपिथेलियम में स्टेम सेल मार्कर और एक्टोपिक क्रिप्ट्स के वीवो में उपस्थिति से चिह्नित किया जाता है3। इस प्रकार, उत्परिवर्तन विली से ऑर्गेनॉइड शुरू करने के लिए आवश्यक समय कम हो जाता है क्योंकि उत्परिवर्तन के प्रेरण के बाद बीता समय बढ़ता है। इसलिए, आंत के अन्य डिफरेंटेशन मॉडल के लिए इस विधि को अनुकूलित करते समय, विली अलगाव के लिए चूहों का त्याग करने के लिए इष्टतम समय अनुभवजन्य रूप से उत्परिवर्तन या चोट की तरह और वीवो मेंआगामी डिफरेंटेशन की डिग्री के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए। तीसरे, हमने अंतर्निहित मेसेन्चिम को बनाए रखने के लिए ईडीटीए-चेलेशन विधि के बजाय स्क्रैपिंग करके विली को अलग करने काविकल्प चुना, क्योंकि आंत5,6,7,8,13में आंतों के स्टेम सेल समारोह में एपिथेलियल-मेसेन्चिमल क्रॉस-वार्ता को फंसाया गया है। विल्ली जो ऑर्गेनॉइड शुरू करता है, मुख्य रूप से अंतर्निहित मेसेन्चिम(चित्रा 2B और 3)की उपस्थिति के कारण संभवतः अंधेरा दिखाई देता है। हमने स्टेम सेल से जुड़े मार्कर सीडी 4414, 15,और आंत विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर सीडीएक्स 216, 17, 18,19,20 की अभिव्यक्ति को सत्यापित किया, जो विली-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड(चित्रा एस 1)के एपीथियल उत्पत्ति की पुष्टि करता है।

वीवो दृष्टिकोणों की तुलना में, ऑर्गेनॉइड आनुवंशिक हेरफेर और स्क्रीनिंग के लिए अधिक उत्तरदायी हैं। चूंकि हम क्रिप्ट्स से उभरने वाले ऑर्गेनॉइड और उसी Smad4KOके विली के बीच फेनोटाइपिक मतभेदों का निरीक्षण करते हैं: β-cateninGOF आंतों के एपिथेलियम(चित्रा 2B),हम दोनों के बीच आणविक मतभेदों की अटकलें लगाते हैं, जिसकी वर्तमान में जांच की जा रही है। इस प्रकार, यह विधि डिफरेंटेशन-जनांकित म्यूटेशन के निहितार्थों और जनक बनाम भेदभाव डिब्बे में इसके अंतर प्रभावों की जांच करने में उपयोगी है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

इस प्रकाशन को एनआईएच नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट से पुरस्कार संख्या K22 CA218462-03 द्वारा समर्थित किया गया था । HEK293-T आर-Spondin1 व्यक्त कोशिकाओं डॉ माइकल पी Verzi से एक उदार उपहार था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM F-12 media Gibco 12634010
3,3-diaminobenzidine Vector Labs SK-4105
96 well U-bottom plate Fisher Scientific FB012932
ABC kit Vector Labs  PK4001
Angled scissor Fisher Scientific 11-999
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A Gibco 12587010
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder Fisher Scientific BP9703100
CD44 antibody BioLegend 1030001
Cdx2 antibody Cell Signaling 12306
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML
Corning 70-micron cell strainer Life Sciences 431751
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 R&D 3433-005-R1
Dissection scissors Fisher Scientific 22-079-747
Forceps Fisher Scientific 17-456-209
Glutamax (100X) Gibco 35050-061
HEK 293-T cells expressing RSPO-1 Gift from Dr. Michael Verzi
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Histogel Thermoscientific HG-4000-012
Mesh filter Fisher Scientific 07-201-431
Micrscope glass slide VWR 89218-844
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165
p200 Blunt tips VWR 46620-642
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122
Primocin (50mg/mL) Invivogen ant-pm-1
Quality Biological Inc PBS (10X) Fisher Scientific 50-146-770
Recombinant Murine Noggin Peprotech 250-38
Signal diluent Cell Signaling 8112L
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-1G
6-well tissue culture plate Fisher Scientific 50-146-770

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References

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जीव विज्ञान अंक 170 विली ऑर्गेनॉइड आंतों के एपिथेलियम स्टेम सेल डिफरेंटेशन सेल भाग्य
आंतों विली एपिथेलियम से ऑर्गेनॉइड की 3डी कल्टिंग डिफरेंटेशन से गुजर रही है
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Li, C., Shah, J., Wrath, K., Matouba, D., Mills, C., Punnath, K., Perekatt, A. 3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation. J. Vis. Exp. (170), e61809, doi:10.3791/61809 (2021).

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