Summary
Das Verfahren beschreibt die Isolierung der Zotten aus dem Darmepithel der Maus, die einer Dedifferenzierung unterzogen werden, um ihr organoidbildendes Potenzial zu bestimmen.
Abstract
Die Klonogenität von Organoiden aus dem Darmepithel wird auf das Vorhandensein von Stammzellen darin zurückgeführt. Das Dünndarmepithel der Maus ist in Krypten und Zotten unterteilt: Die Stamm- und Proliferationszellen sind auf die Krypten beschränkt, während das Zottenepithel nur differenzierte Zellen enthält. Daher können die normalen Darmkrypten, aber nicht die Zotten, in 3D-Kulturen organoide entstehen. Das hier beschriebene Verfahren ist nur auf Zottenepithel anwendbar, das einer Dedifferenzierung unterzogen wird, die zu Stielbildung führt. Die beschriebene Methode verwendet die Smad4-loss-of-function:β-catenin gain-of-function (Smad4 KO:β-cateninGOF)bedingte mutierte Maus. Die Mutation bewirkt, dass die Darmzotten dedifferenzieren und Stammzellen in den Zotten erzeugen. Darmzotten, die einer Dedifferenzierung unterzogen werden, werden mit Glasobjektträgern vom Darm abgekratzt, in ein 70 μm-Sieb gelegt und mehrmals gewaschen, um lose Zellen oder Krypten herauszufiltern, bevor sie in die BME-R1-Matrix einplattiert werden, um ihr organoidbildendes Potenzial zu bestimmen. Zwei Hauptkriterien wurden verwendet, um sicherzustellen, dass die resultierenden Organoide aus dem entdifferenzierenden Zottenkompartiment und nicht aus den Krypten entwickelt wurden: 1) mikroskopische Bewertung der isolierten Zotten, um sicherzustellen, dass keine angebundenen Krypten sowohl vor als auch nach der Beschichtung in der 3D-Matrix vorhanden sind, und 2) Überwachung des zeitliche Verlaufs der Organoidentwicklung aus den Zotten. Die organoide Initiation aus den Zotten erfolgt nur zwei bis fünf Tage nach dem Plattieren und erscheint unregelmäßig geformt, während die aus der Krypta abgeleiteten Organoide aus demselben Darmepithel innerhalb von sechzehn Stunden nach der Beschichtung sichtbar sind und kugelförmig erscheinen. Die Einschränkung der Methode besteht jedoch darin, dass die Anzahl der gebildeten Organoide und die Zeit, die für die Organoidinitiierung aus den Zotten benötigt wird, je nach Grad der Dedifferenzierung variieren. Abhängig von der Spezifität der Mutation oder der Beleidigung, die die Dedifferenzierung verursacht, muss daher das optimale Stadium, in dem Zotten entnommen werden können, um ihr organoidales Bildungspotenzial zu bestimmen, empirisch bestimmt werden.
Introduction
Die Darmkrypten, aber keine Zotten, bilden Organoide, wenn sie in Matrigel oder BME-R1-Matrix kultiviert werden. Diese Organoide sind selbstorganisierende Strukturen, die oft als "Mini-Darm" bezeichnet werden, da die verschiedenen differenzierten Linien, Vorläufer- und Stammzellen im Darmepithel in vivovorhanden sind. Das Potenzial, Organoide aus Krypten zu bilden, wird auf das Vorhandensein von Stammzellenzurückgeführt 1. Die Darmzotten hingegen bestehen nur aus differenzierten Zellen und können daher keine Organoide bilden. Mutationen 2 oderZustände, die eine Dedifferenzierung des Zottenepithels ermöglichen, können jedoch zu Stammzellen in den Zotten2,3führen. Diese Schicksalsänderung, die zu einer Stängelbildung im Zottenepithel führt, kann durch Beschichtung des dedifferenzierenden Zottenepithels in 3D-Matrix bestätigt werden, um ihr organoidbildendes Potenzial als Indikator für die De-novo-Stemness im Zottenepithel zu bestimmen. Daher besteht der kritische Aspekt dieses Verfahrens darin, sicherzustellen, dass keine Kryptenkontamination vorliegt.
Die Smad4KO:β-CateninGOF-bedingte Mutation verursacht eine Dedifferenzierung im Darmepithel, die durch die Expression von Proliferations- und Stammzellmarkern in den Zotten und schließlich die Bildung kryptenartiger Strukturen in den als ektopische Krypten bezeichneten Zotten gekennzeichnet ist Das Vorhandensein von Stammzellen, diese dedifferenzierten Zotten wurde durch die Expression von Stammzellmarkern in den ektopischen Krypten (in vivo) und die Fähigkeit der mutierten Zotten, Organoide zu bilden, bestimmt. en plattiert Matrigel3. Das unten erwähnte Verfahren erläutert die Methodik, die verwendet wird, um die Stammhaftigkeit des dedifferenzierenden Darmepithels in den Smad4KO:β-CateninGOF-mutierten Mäusen zu bestätigen. Ein Schlüsselmerkmal dieser Methodik zur Isolierung von Zotten war die Verwendung des Abkratzens des Darmlumens im Gegensatz zur EDTA-Chelatbildungsmethode4. Anders als bei der EDTA-Chelat-Methode behält die Zottenisolierung durch Abkratzen den Großteil des darunter liegenden Mesenchyms bei und ermöglicht es, den Abkratzdruck so einzustellen, dass Zotten ohne angebundene Krypten ergeben. Der Abkratzdruck ist für den Bediener subjektiv, daher muss der optimale Druck, Zotten ohne angebundene Krypten zu liefern, vom Bediener empirisch bestimmt werden. Der kritische Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, die Abwesenheit von Kryptenkontamination durch mikroskopische Untersuchung der Zotten sowohl vor als auch nach der Beschichtung in der BME-R1-Matrix sicherzustellen.
Darmzotten werden mit Glasobjektträgern vom Darmlumen abgekratzt und in einen 70 μm-Filter gegeben und mit PBS gewaschen, um lose Zellen oder Krypten, falls vorhanden, loszuwerden, bevor sie in die BME-R1-Matrix einplattiert werden. Die Methode betont die folgenden Kriterien, um eine Kryptenkontamination zu vermeiden: a) Eingrenzen der Zottenernte auf die proximale Hälfte des Zwölffingerdarms, wo die Zotten am längsten sind, b) Minimierung der Anzahl der Zotten-liefernden Kratzer, c) Waschen des Filters, der die Zotten enthält, durch eine Reihe von PBS in einer Sechs-Brunnen-Schüssel und d) Bestätigung des Fehlens einer Kryptakontamination durch mikroskopische Untersuchung vor und nach dem Plattieren in BME-R1-Matrix. Die Zottenisolierung durch Abkratzen und nicht durch EDTA-Chelatbildung verhindert den vollständigen Verlust des darunter liegenden Mesenchyms, das bei Bedarf die Nischensignale5,6,7,8für die Organoidinitiierung aus dem Zottenepithel liefern kann.
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Protocol
Alle durchgeführten Mausexperimente, einschließlich der Verwendung von Tamoxifen und der Euthanasie durch Zervixluxation, hatten die Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee am Stevens Institute of Echnology.
1. Mäuse
HINWEIS: Die Generation von Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 Mäuse wurden zuvor beschrieben3. Erwachsene weibliche Mäuse im Alter von acht bis zwölf Wochen wurden verwendet.
- Induzieren Sie die Smad4KO:β-Catenin-GOF-Mutation in der Smad4 f /f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 mit intraperitonealer Injektion von Tamoxifen in Maisöl an vier aufeinanderfolgenden Tagen.
- Opfern Sie die Mäuse zehn Tage nach der ersten Tamoxifen-Injektion durch zervikale Dislokation.
- Besprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Mausfell in die Peritonealhöhle gelangt.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Sezierschere, um den Darm freizulegen. Isolieren Sie den Darm mit Hilfe von Schere und Zette.
HINWEIS: Der gleichzeitige Verlust von Smad4 zusammen mit dem Gewinn einer Funktionsmutation von β-Catenin (Smad4KO;β-CateninGOF) im Darmepithel wurde durch Injektion vonSmad4f / ferreicht; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 Mäuse täglich an vier aufeinanderfolgenden Tagen mit 0,05 g Tamoxifen/kg Körpergewicht in Maisöl. Diese Mäuse werden zehn Tage nach der ersten Tamoxifen-Injektion geerntet, um sicherzustellen, dass Zellen vorliegen, die Stammzell-assoziierte Marker in den dedifferenzierenden Zotten exprimieren.
2. Zwölffingerdarmisolierung und -vorbereitung
- Sezieren Sie die proximale Hälfte des Zwölffingerdarms.
- Spülen Sie den Zwölffingerdarm mit 5 ml eiskaltem PBS in einer 10-ml-Spritze, um den Luminalgehalt zu klären.
- Öffnen Sie den Zwölffingerdarm längs mit einer abgewinkelten Schere und legen Sie den Zwölffingerdarm flach auf eine 15 cm lange Petriplatte auf Eis mit dem Lumen des Zwölffingerdarms dem Bediener zugewandt.
3. Zottenisolierung durch Abkratzen
- Bevor Sie mit dem Schaben beginnen, legen Sie ein 70 μm Mesh-Sieb in einen der Vertiefungen einer 6-Well-Gewebekulturplatte. Füllen Sie alle Vertiefungen mit 4 ml 1x PBS und legen Sie die 6-Well-Gewebekulturplatte auf Eis (Abbildung 1).
- Kratzen Sie die Zotten wie folgt mit zwei mikroskopisch kleinen Glasobjektträgern: eine, um den Zwölffingerdarm festzuhalten und die andere zum Kratzen (Abbildung 1B1).
- Kratzen Sie die luminale Seite des Zwölffingerdarms oberflächlich zweimal hin und her, um den Schleim zu entfernen. Drücken Sie so, dass dieser Schritt die Schleimschicht entfernt, aber nicht die Zotten.
- Kratzen Sie den Zwölffingerdarm erneut ab, indem Sie zweimal den gleichen Druck wie in 3..1 anwenden, wobei sich Zotten auf den Objektträgern sammeln(Abbildung 1B2). Dies ist der optimale Druck (der vom Betreiber empirisch bestimmt werden muss), um die Zotten ohne angebundene Krypten zu erhalten.
- Verwenden Sie ein 1-ml-Transferpipet, das PBS enthält, um die Zotten (die ab Schritt 3.2.2 auf dem Objektträger gesammelt werden) auf ein 70 μm-Maschensieb zu übertragen, das in einer 6-Well-Schüssel platziert ist. Die Zotten werden so nach jedem Kratzen gesammelt (Abbildung 1B2).
- Waschen Sie die im 70 μm-Sieb gesammelten Zotten (ab Schritt 3.3), indem Sie das Sieb (mit den Zotten) durch eine Reihe von Vertiefungen in einer 6-Well-Schüssel mit kaltem PBS (~ 4 ml / Well) übertragen. Dies dient dazu, lose Krypten zu entfernen, falls vorhanden.
- Übertragen Sie mit einer p1000-Pipett die Zottensuspension in PBS (~ 3 mL) vom 70 μm-Sieb auf ein neues 15-ml-Rohr auf Eis.
- Verwenden Sie eine 0,1% BSA-beschichtete stumpfe p200-Pipettspitze, um 50 μL Volumen der Zottensuspension auf einen Glasträger anzusaugen. Zählen Sie die Anzahl der Zotten im 50 μL-Tröpfchen unter 4-facher Vergrößerung, um die Konzentration von Zotten in der PBS-Suspension zu bestimmen. Wenn sich beispielsweise 10 Zotten in der untersuchten 50 μL-Suspension befinden, beträgt die Zottenkonzentration 0,2 Zotten / μL. Dies ist auch die Zeit, um das Fehlen von angebundenen Krypten zu bestätigen.
- Berechnen Sie das Volumen der Zottensuspension, das für die Platte in einer Konzentration von 0,5 Zotten / μL der BME-R1-Matrix erforderlich ist. Fügen Sie zusätzliche 100 μL hinzu, um den Pipettierfehler und das für die mikroskopische Untersuchung erforderliche Volumen zu berücksichtigen, um die Reinheit der Zotten sicherzustellen.
VORSICHT: Der Druck, der in den ersten beiden Kratzern verwendet wird, der den Schleim, aber nicht die Zotten entfernt, sollte in den nachfolgenden Kratzern verwendet werden, bei denen Zotten freigesetzt werden. Begrenzen Sie die Anzahl der Hin- und Her-Kratzer auf zwei, nachdem die Zottenfreisetzung zum ersten Mal beobachtet wurde. Diese Maßnahme vermeidet die Freisetzung von Zotten mit den angebundenen Krypten. Es ist wichtig, die Zotten mikroskopisch zu bewerten, um sicherzustellen, dass die angebundenen Krypten fehlen.
4. Beschichtung von Zotten auf BME-R1-Matrix
- Übertragen Sie unter Verwendung einer 0,1% BSA-beschichteten p200-Pipetenspitze mit stumpfem Ende das Volumen der Zotten (ab Schritt 3.6) in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das erforderlich ist, um bei einer Dichte von ~ 6 Zotten pro Vertiefung in 12,5 μL BME-R1-Matrix zu platten. Die Verwendung der BSA-beschichteten stumpfen Spitze an dieser Stelle stellt sicher, dass die Zotten, die für eine spitze Spitze zu groß sind, angesaugt werden, ohne blockiert zu werden oder an den Seiten der Spitze zu kleben.
- Drehen Sie die Zotten für 2 min bei 200 x g in einer Kühlzentrifuge (4 °C) herunter und entfernen Sie den Überstand.
- Wiederholen Sie Schritt 4.2, um alle PBS-Reste zu entfernen, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt unter einer laminaren Strömungshaube fort.
- Das Zottenpellet vorsichtig in der erforderlichen Menge an kaltem BME-R1 auf Eis auftauen.
- Mit einer p20-Pipettplatte 12,5 μL/Vertiefung der Zotten in BME-R1-Matrix in 3D in einer vorgewärmten 96-Well-U-Bodenplatte.
- Inkubieren Sie die Platte in einem Gewebekulturinkubator bei 37 °C für 15 Minuten, um die Erstarrung der BME-R1-Matrix zu ermöglichen.
- Fügen Sie 125 μL/Well vorgewärmter ENR-Medien (Epidermal Growth Factor/Noggin/R-spondin1) hinzu: fortgeschrittene DMEM F-12-Medien, ergänzt mit 1x Penicillin: Streptomycin, 10 mM HEPES, Glutamax, 50 ng/ml EGF, 100 ng/mL Noggin, 5% konditionierte Medien aus HEK293-T-Zellen, die R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-Acetylcystein und 0,05 mg/ml Primocin exprimieren.
- Inkubieren Sie die plattierten Zotten in einem bei 37 °C gehaltenen Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO2und wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag.
- Verwerfen Sie alle Vertiefungen, in denen Organoide vor zwei Tagen der Beschichtung erscheinen, da der früheste Zeitpunkt, an dem aus Zotten gewonnene Organoide erwartet werden, nach zwei Tagen ist.
HINWEIS: Alle Zotten, die die Hälfte oder mehr als die Hälfte der Zottenlänge haben, werden als ein Zotten gezählt. Im Gegensatz zu kryptabasierten Organoiden werden von Zotten abgeleitete Organoide nicht innerhalb von 24 Stunden nach der Beschichtung erwartet. Die organoidinitiierenden Zotten scheinen sich vor der Bildung von Organoiden zu verdunkeln und zu schrumpfen. Daher sollten alle Vertiefungen mit Organoiden, die sich innerhalb eines Tages nach der Beschichtung entwickeln, verworfen werden, um die Plausibilität einer plausiblen Kryptenkontamination zu vermeiden. Die zur Herstellung der konditionierten Medien verwendete Methodik ist auf Anfrage erhältlich.
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Representative Results
Ausschlaggebend für den Erfolg des Verfahrens ist die Vermeidung von Kryptenkontaminationen. Die Organoidentwicklung aus den Zotten (und nicht aus kontaminierenden Krypten) wird durch die Bestätigung von vier Hauptkriterien sichergestellt: 1) Sicherstellung der Reinheit der geernteten Zotten durch mikroskopische Untersuchung vor und nach dem Plattieren der Zotten in BME-R1, 2) Beschichtung einer begrenzten Anzahl von Zotten pro Vertiefung, um die Visualisierung aller plattierten Zotten einzeln zu ermöglichen, 3) tägliche Entwicklung von Organoiden; Bilder des Zeitverlaufs zeigen die Entwicklung von Organoiden aus Zotten (Abbildung 3) und 4) die kinetische und morphologische Erscheinung der organoiden, die von Zotten initiiert werden; die von Zotten ausgehenden Organoide erscheinen zunächst unregelmäßig geformt und brauchen zwei bis fünf Tage, bevor sie unter 4-facher Vergrößerung zu sehen sind, im Gegensatz zu den kryptisch abgeleiteten Organoiden (kultiviert durch Isolierung von Krypten mit der EDTA/PBS-Chelatierungsmethode1,4), die über Nacht als kugelförmige Strukturen mit genau definierten Grenzen erscheinen (Abbildung 2).
Der optimale Zeitpunkt, um die Mäuse für die Prüfung des organoidbildenden Potenzials der Zotten zu opfern, ist, nachdem die dedifferenzierenden Zottenepithel-Express-Stammzellmarker und die Entwicklung von ektopischen Krypten in den Zotten in vivo beginnen (etwa 10 Tage nach Tamoxifen-Injektion des Smad4f / f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 Mäuse). Diese Mäuse haben eine Tamoxifen-induzierbare Cre-Recombinase, die den Smad4-Verlust gleichzeitig mit β-Catenin-Aktivierung mit Tamoxifen verursacht. Die ektopischen Krypten entwickeln sich innerhalb von zwei Wochen nach Induktion der Mutation vollständig, während die Stammzellen im Zottenepithel innerhalb einer Woche nach der Induktion der Mutation in vivoerscheinen. Es wurde berichtet, dass die Anzahl der Zotten, die Organoide bilden, wenn sie in Matrigel plattiert werden, zwischen 2% und 12%variiert 3. Die Ernte der mutierten Maus zur Beschichtung der Zotten um den Zeitpunkt, zu dem Stammzellen vorhanden sind (etwa eine Woche nach der Kre-Rekombinationsinduktion), verlängert die Zeit, die für das Auftreten von Zotten-abgeleiteten Organoiden erforderlich ist, während die Verzögerung der Ernte auf später als zehn Tage nach der Kre-Induktion das Risiko einer Kontamination erhöht.
Abbildung 1: Versuchsaufbau und Zottenabkratzen aus dem Darmepithel. A) PBS-gefüllte Spritze (Syrg) mit Schlauch und Filter (Fltr) in PBS. B)Zottenisolierung durch Abkratzen (B1) und Übergabe an einen Filter (B2). Der Pfeil zeigt auf die auf der Folie gesammelten Zotten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Unterscheidung im Aussehen der aus den Krypten austretenden Organoide gegenüber dem dedifferenzierten Zottenepithel aus demselben Mausdarm: A) Karikatur mit Zotten und Krypten. B) Ganze Halterung (in PBS) von Zotten, die durch Abkratzen hergestellt werden (obere Platte) und Krypten, die durch EDTA-Chelatbildung (untere Platte) hergestellt werden. C)Villi-abgeleitete (obere Platte) und kryptische (untere) Organoide aus demselben Darmepithel der Maus in BME-R1 (Skalenbalken, 500 um). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Zeitverlauf der Organoidbildung aus den dedifferenzierenden Zotten. Die organoide Initiation von zwei verschiedenen Zotten wird gezeigt (die Box-Regionen sind in der Mitte und im unteren Bereich vergrößert). Die Zotten mit organoidbildenden Potentialen erscheinen dicht, möglicherweise aufgrund der Retention des darunter liegenden Mesenchyms. Die organoide Initiation aus dem Zotten ist am zweiten Tag (fester Pfeil) von einem der Zotten (Kasten mit gebrochener Grenze) sichtbar, während im anderen Zotten (Kasten mit fester Grenze) das Organoid am vierten Tag (Pfeil) erscheint. Die obere Box im Tag 6 Panel zeigt ein entwickeltes Zotten-abgeleitetes Organoid. Maßstabsleiste, 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Methode kann die Selbsterneuerungsfähigkeit von dedifferenzierendem Zottenepithel bestätigen, das Stammzellmarker in vivo erwirbt. Das normale Darmepithel kann Organoide aus der Krypta, aber nicht aus dem Zottenkompartiment hervorbringen, wenn es in 3D kultiviert wird, da Stammzellen in den Krypten1vorliegen. So bestätigt die Organoidbildung aus dem in 3D-Kulturen kultivierten dedifferenzierten Zottenepithel die Stammzellbildung aus der Zellschicksalsumkehr. Berichte über die Umkehrung des Zellschicksals im Darmepithel, die durch Mutationen und / oder Verletzungenentstehen,nehmenzu 2,3,9,10,11,12. Daher ist diese Methode in ähnlichen Szenarien anwendbar, in denen das dedifferenzierende Zottenepithel Stammzellmarker in vivo exprimiert.
Wir bestätigten die Entwicklung der Organoide aus den Zotten der Smad4KO:β-Catenin-GOF-Mutante durch den Zeitverlauf, der die Entwicklung von Organoiden aus den Zotten zeigt (Abbildung 3). Der kritischste Aspekt ist das Ergreifen von Vorsichtsmaßnahmen gegen Kryptenkontaminationen, die zu Fehlalarmen führen würden. Die folgenden Maßnahmen wurden ergriffen, um die Reinheit der Zottenzubereitung vor und nach dem Plattieren zu gewährleisten: a) Isolierung von Zotten aus der proximalen Hälfte des Zwölffingerdarms, wo die Zotten am längsten sind, b) Minimierung der Anzahl der Kratzer und Anpassung des Kratzdrucks, um Zotten ohne angebundene Krypten zu erhalten, c) Waschen der Zotten mit PBS, nachdem sie in ein 70 μm Netzsieb gelegt wurden, um lose Krypten oder Zellen auszuschließen d) mikroskopische Untersuchung der geernteten Zotten vor und nach der Beschichtung und e) Minimierung der Anzahl der pro Vertiefung plattierten Zotten, so dass sie einzeln in der plattierten Matrix visualisiert werden können.
Es wurden mehrere Überlegungen angestellt, um das Verfahren zu optimieren. Zuerst haben wir die Zotten aus dem proximalen Zwölffingerdarm geerntet, wo die Zotten am längsten sind. Die physikalische Abgrenzung zwischen der Differenzierung und den proliferativen Kompartimenten im Dünndarm ermöglicht es uns, das Kratzen zu übernehmen, um die Zotten mechanisch von den Krypten zu trennen. Diese Methode kann daher nur in den Fällen übernommen werden, in denen die Kompartimentierung zwischen Differenzierung und proliferativem Kompartiment streng abgegrenzt ist - wie es im Dünndarm, aber nicht im Dickdarm der Fall ist. Zweitens haben wir den Zeitpunkt der Zottenisolierung nach Induktion der Mutation basierend auf dem in vivo beobachteten Grad der Dedifferenzierung optimiert. Die Dedifferenzierung in der bedingten Smad4 KO:β-Catenin-GOF-Mutante ist durch das Auftreten von Stammzellmarkern und ektopischen Krypten im Zottenepithel innerhalb von sieben bzw. zehn Tagen3gekennzeichnet. So nimmt die Zeit, die benötigt wird, um Organoide aus den mutierten Zotten zu initiieren, mit zunehmender Zeit, die nach der Induktion der Mutation verstrichen ist. Daher sollte bei der Anpassung dieser Methode an andere Dedifferenzierungsmodelle des Darms der optimale Zeitpunkt für das Opfern der Mäuse für die Zottenisolierung empirisch in Abhängigkeit von der Art der Mutation oder Verletzung und dem Grad der anschließenden Dedifferenzierung in vivobestimmt werden. Drittens haben wir uns dafür entschieden, die Zotten durch Schaben und nicht durch die EDTA-Chelatbildungsmethode zu isolieren, um das zugrunde liegende Mesenchym zu erhalten, da epithelial-mesenchymale Kreuzgespräche mit der intestinalen Stammzellfunktion im Darm in Einbindung gebracht wurden5,6,7,8,13. Zotten, die die Organoide initiieren, erscheinen hauptsächlich dunkel, möglicherweise aufgrund des Vorhandenseins des darunter liegenden Mesenchyms (Abbildung 2B und 3). Wir verifizierten die Expression des Stammzellmarkers CD4414,15und des darmspezifischen Transkriptionsfaktors Cdx216,17,18,19,20, was den epithelialen Ursprung der von Zotten abgeleiteten Organoide bestätigt ( AbbildungS1).
Im Vergleich zu In-vivo-Ansätzen sind Organoide für genetische Manipulation und Screening besser nutzbar. Da wir phänotypische Unterschiede zwischen den aus den Krypten austretenden Organoiden und den Zotten desselben Smad4KO:β-CateninGOF Darmepithels beobachten (Abbildung 2B), spekulieren wir über molekulare Unterschiede zwischen den beiden, die derzeit untersucht werden. Daher ist diese Methode nützlich, um die Implikationen von Dedifferenzierungs-verursachenden Mutationen und ihre differentiellen Effekte im Vorläufer- versus Differenzierungskompartiment zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Publikation wurde durch die Award Number K22 CA218462-03 des NIH National Cancer Institute unterstützt. Die HEK293-T-Zellen, die R-Spondin1 exprimieren, waren ein großzügiges Geschenk von Dr. Michael P. Verzi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
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