Summary
هنا نقدم طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء التي تسمح بعرض الجزيئات المستهدفة كجزء من هياكل الدماغ السليمة. وقد تم الآن التحقق من صحة هذه التقنية للسيطرة F344/N والجرذان المعدلة وراثيا فيروس نقص المناعة البشرية-1 من كلا الجنسين.
Abstract
طرق إزالة الأنسجة الكارهة للماء قابلة للتعديل بسهولة وسريعة ومنخفضة التكلفة تسمح بدراسة جزيء مهم في عينات الأنسجة دون تغيير. تتطلب إجراءات وضع العلامات المناعية التقليدية قطع العينة إلى أقسام رقيقة ، مما يحد من القدرة على تسمية وفحص الهياكل السليمة. ومع ذلك، إذا كان يمكن أن تظل أنسجة الدماغ سليمة أثناء المعالجة، يمكن أن تظل الهياكل والدوائر سليمة للتحليل. تستغرق طرق التطهير التي تم إنشاؤها سابقا وقتا طويلا لتطهير الأنسجة تماما ، ويمكن أن تلحق المواد الكيميائية القاسية أضرارا بالأجسام المضادة الحساسة في كثير من الأحيان. طريقة iDISCO بسرعة وتماما مسح الأنسجة، متوافق مع العديد من الأجسام المضادة، ويتطلب أي معدات مختبر خاص. تم التحقق من صحة هذه التقنية في البداية لاستخدامها في أنسجة الفئران ، ولكن البروتوكول الحالي يكيف هذه الطريقة لتصوير نصفي الكرة الأرضية للتحكم وأدمغة الفئران المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى ذلك، يقوم هذا البروتوكول أيضا بإجراء تعديلات عديدة على البروتوكول الموجود مسبقا لتوفير صور أوضح مع تلطيخ أقل للخلفية. تم التحقق من صحة الأجسام المضادة لIba-1 والتيروزين هيدروكسيلاز في الفئران المعدلة وراثيا HIV-1 وفي فئران التحكم F344/N باستخدام طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء الحالية. الدماغ هو شبكة متشابكة، حيث تعمل الهياكل معا في كثير من الأحيان أكثر من منفصلة عن بعضها البعض. تحليل الدماغ ككل بدلا من نظام مزيج من القطع الفردية هو أكبر فائدة من هذا الأسلوب تطهير الدماغ كله.
Introduction
وقد تم التحقق من صحة العديد من تقنيات إزالة الأنسجة للاستخدام في الدماغ: الهيدروجيل، والهيدروفيلي، والماء. وتهدف هذه التقنيات لتحويل نسيج شفاف من خلال delipidation، إزالة اللون، والشارات عن طريق إدارة المذيبات. بمجرد أن يطابق مؤشر الانكسار لعينة الأنسجة مؤشر الانكسار لوسط التصوير المختار ، يمكن الحصول على صورة واضحة للعينة. تقنيات هيدروجيل القائمة، مثل وضوح، الجزيئات الحيوية آمنة في الأنسجة عن طريق ربطها إلى الهيدروجيلات المستندة إلى الأكرييل، والذي يمنع الضرر الهيكلي وفقدان البروتينات1. ومع ذلك، تستخدم تقنيات الهيدروجيل مواد كيميائية قاسية من القدرة على إتلاف الأنسجة الأكثر هشاشة، وقد لا تكون عينات الأنسجة الأكثر كثافة متوافقة مع بروتوكول الهيدروجيل. قد تتطلب بعض تقنيات الهيدروجيل معدات باهظة الثمن أو تؤدي إلى توسيع الأنسجة. تقنيات هيدروفيليك، مثل CUBIC، والحفاظ على بنية 3D من خلال تشكيل روابط الهيدروجين داخل الأنسجة2. يمكن أن يحدث توسع الأنسجة أيضا في بروتوكول هيدروفيلي معين. قدرة تطهير تقنيات المياه في كثير من الأحيان لا تتطابق مع القدرة التي تقنيات الكارهة للماء لديها، وهو أمر مهم للأنسجة أكثر كثافة وأكثر سمكا3.
تقنيات رهاب الماء عادة ما تكون سريعة، لا تتطلب معدات خاصة، وإنتاج عينة التي يسهل التعامل معها وتخزينها. iDISCO هو تقنية مسعورة تقضي على الانكماش الذي يمكن أن يحدث في بروتوكول مسعور آخر. في الأصل ، وصفت تقنية إزالة الأنسجة iDISCO من قبل رينييه وآخرون4 للأجنة والأعضاء الكثيفة والبالغة للفئران. هذه التقنية يزيل الماء من الأنسجة في خطوة الجفاف الأولي، وبالتالي الحد من تشتت الضوء. يتم اختراق الأنسجة أثناء المعالجة المسبقة للسماح بتغلغل الأجسام المضادة العميقة. وتستخدم الأصباغ اليكسا فلور في الطيف الأحمر البعيد ل immunolabeling لتجنب autofluorescence من الأنسجة في الأطوال الموجية أقل5. الأنسجة التي خضعت لبروتوكولات إزالة رهاب الماء قادرة على التعامل معها بسهولة ويمكن تصويرها عدة مرات بسبب طول عمر أصباغ أليكسا فلور. إذا تم تخزينها بشكل صحيح ، يمكن للأنسجة توفير الصور لعدة أشهر إلى سنة بعد المعالجة الأولية.
في هذا البروتوكول، تم استخدام الأجسام المضادة التيروزين هيدروكسيلوكس (TH)، والأجسام المضادة Iba1، والكوليرا السم Subunit B (CTB) على كل من الذكور والإناث السيطرة وفيروس نقص المناعة البشرية-1 المعدلة وراثيا (TG) أدمغة الفئران. يمتلك فأر HIV-1 Tg سبعة من الجينات التسعة التي تشكل الجينوم الفيروسي HIV-1 ، مما يؤدي إلى نموذج غير معد للتعرض الطويل الأجل للبروتين HIV-16و7و8. وقد أظهرت سابقا التعديلات الدوبامين في الفئران TG HIV-1، وفيروس نقص المناعة البشرية-1 نفسه هو مرض التهابي، لذلك كان اختيار الأجسام المضادة ذات الصلة لتصميم التجريبية9،10،11،12. CTB هو التتبع الذي يعلق على الخلايا العصبية عن طريق ربط ganglioside ويمكن استخدامها لتتبع التوقعات afferent في الدماغ. وقد سبق أن استخدمت CTB لدراسة التوقعات من نواة accumbens إلى منطقة نيغرا substantia, منطقتين من الدماغ تشارك بشكل كبير مع مسارات الدوبامين13,14,15.
في هذا البروتوكول، سوف TH بمثابة علامة لإنتاج الدوبامين، وسوف Iba1 علامة microglia تنشيط. الأجسام المضادة TH تستخدم تسميات انتقائية شريط واحد في حوالي 62 كيلودا التي تتوافق مع هيدروكسيلاز التيروزين. يتوافق الجسم المضاد Iba1 مع تسلسل Iba1 carboxy-terminal. وقد تربى كلا الجسمين المضادين في أرنب وكانت متعددة النسيلة. سيتم استخدام CTB لتتبع الخلايا العصبية إلى الوراء من منطقة النواة المتكئة إلى منطقة نيغرا تحتستانتيا. كما يقدم البروتوكول الحالي إرشادات لتعديل بروتوكول iDISCO الأصلي بطريقتين متميزتين: 1) التخفيض الإجمالي لتلطيخ الخلفية عن طريق تغيير الكواشف المصلية في خطوات الحجب ، و 2) توسيع وقت الحضانة ليكون مناسبا لعينات الأنسجة الأكبر. وعموما، يوفر هذا البروتوكول دليلا مستمرا على أن تقنيات إزالة رهاب الماء ممكنة في أنسجة الدماغ للفئران، وليس لها تفاعلات ضارة ملحوظة مع البروتينات الفيروسية HIV-1، وهي متوافقة مع الأجسام المضادة TH، والأجسام المضادة Iba1، وCTB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم مراجعة جميع بروتوكولات الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه في جامعة كارولينا الجنوبية.
1. إعداد حل المخزون
- الحل 1 (1 لتر): إلى 900 مل من H2O deionized إضافة 100 مل من 10x فوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (PBS) و 2 مل من تريتون X-100.
- الحل 2 (1 لتر): إلى 900 مل من H2O deionized، أضف 100 مل من 10x PBS، 2mL من Tween-20 و 1 مل من محلول مخزون 10 ملغم/مل هيبارين.
- الحل 3 (500 مل): إلى 400 مل من الحل 1، أضف 11.5 غرام من الجليسين و100 مل من ثنائي ميثيل سلف أكسيد (DMSO).
- الحل 4 (50 مل): إلى 42 مل من الحل 1، أضف 3 مل من المصل المقابل و5 مل من DMSO.
- حل الأجسام المضادة الأولية (50 مل): إلى 46 مل من الحل 2، أضف 2.5 مل من DMSO و 1.5 مل من المصل المقابل.
- حل الأجسام المضادة الثانوية (50 مل): إلى 48.5 مل من الحل 2، أضف 1.5 مل من المصل المقابل.
ملاحظة: بالنسبة للحل 4 والحل الأساسي والحل الثانوي، استخدم مصلا يتوافق مع الأجسام المضادة الثانوية (مثل الماعز والحصان والأبقار).
2. إعداد العينة
ملاحظة: تنفيذ الخطوات من 2.1 إلى 2.7 في غطاء الدخان بسبب الحد من التعرض لPFA.
- تخدير عميق الشباب (3-6 أسبوع) الفئران باستخدام sevoflurane; المضي قدما إلى 2.2 عندما الفئران لا تستجيب وفشل في الاستجابة لإصع القدم وقرصة الذيل.
- وضع الفئران في موقف supine وجعل شق من خلال جدار البطن باستخدام زوج من مقص إيريس.
- قطع من خلال الجزء السفلي من القفص الصدري إلى الترقوة على جانبي القفص الصدري باستخدام مقص مايو.
- لصق القص والأضلاع بعيدا عن القلب والرئتين مع hemostat.
- ثقب البطين الأيسر مع إبرة 23 G تعلق على مضخة النفخ وقطع الأذين الأيمن مع مقص إيريس.
- إجراء تغلغل عبر القلب مع ما يقرب من 75 مل من 100 mM (1x) برنامج تلفزيوني.
- مواصلة التغلغل عبر القلب مع ما يقرب من 100 مل من 4٪ paraformaldehyde (PFA) المخزنة مؤقتا في برنامج تلفزيوني 1x.
- إزالة الدماغ من الجمجمة باستخدام ملقط.
- ضع الدماغ في وضع القوس وشريحة إلى 4 أقسام متساوية (حوالي 3 ملم في العرض) باستخدام شفرة حلاقة ومصفوفة دماغ الفئران.
- إصلاح كل قسم في 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني 1x في أنبوب بلاستيكي مختومة، 5mL بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية على شاكر.
- الاستمرار في إصلاح في 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني 1x في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر لمدة 1 ساعة.
- غسل كل قسم مع برنامج تلفزيوني 1x في RT لمدة 30 دقيقة، 3 مرات.
3. الجفاف والإزالة
- احتضان العينة في محلول مياه 20٪ الميثانول / 80٪ deionized لمدة ساعة واحدة في RT.
- احتضان العينة في 40٪ الميثانول / 60٪ محلول المياه deionized لمدة 1 ساعة في RT.
- احتضان العينة في محلول مياه 60٪ الميثانول / 40٪ deionized لمدة ساعة واحدة في RT.
- احتضان العينة في محلول مياه 80٪ الميثانول / 20٪ deionized لمدة ساعة واحدة في RT.
- احتضان العينة في الميثانول 100٪ لمدة ساعة واحدة في RT. كرر مع أكثر من 100٪ الميثانول، واحتضان لمدة 1 ساعة في RT.
- قم بتبريد العينة في الميثانول بنسبة 100٪ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا.
- إعداد 66٪ ثنائي كلورو الميثان (DCM)/33٪ محلول الميثانول.
- احتضان العينة بين عشية وضحاها في محلول DCM / الميثانول في RT ، مع اهتزاز.
- يغسل بالميثانول في RT لمدة 30 دقيقة، 2 مرة.
- قم بتبريد العينة في الميثانول بنسبة 100٪ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا.
- التبييض في المبردة، أعدت حديثا 5٪ بيروكسيد الهيدروجين في الميثانول بين عشية وضحاها في 4° C.
- احتضان العينة في محلول مياه 80٪ الميثانول / 20٪ deionized لمدة ساعة واحدة في RT.
- احتضان العينة في محلول مياه 60٪ الميثانول / 40٪ deionized لمدة ساعة واحدة في RT.
- احتضان العينة في 40٪ الميثانول / 60٪ محلول المياه deionized لمدة 1 ساعة في RT.
- احتضان العينة في محلول مياه 20٪ الميثانول / 80٪ deionized لمدة ساعة واحدة في RT.
- احتضان العينة في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 1 ساعة في RT.
- اغسل في الحل 1 لمدة ساعة واحدة في RT، مرتين.
4. الكوليرا السم Subunit باء وضع العلامات
- أدخل طرف إبرة من حقنة 1 مل في موقع نواة accumbens.
- حقن ببطء 2.5 ميكرولتر من 1٪ البيوتين CTB أكثر من 20 ثانية.
- اترك طرف الإبرة في مكانه لمدة دقيقة واحدة وأزيله ببطء أكثر من 10 ق لمنع التسرب.
5. تطبيق الأجسام المضادة
- احتضان العينة في الحل 3 لمدة يومين عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- احتضان العينة في الحل 4 لمدة يومين عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 7 أيام في 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- اغسل في الحل 2 لمدة 5 مرات، واحتضان 1 ساعة لكل غسل. تخزين في الحل 2 في RT بين عشية وضحاها.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 7 أيام في 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- غسل في الحل 2 لمدة 5 مرات، واحتضان 1 ساعة لكل غسل. مخزن في الحل 2 في RT بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يجب أن تحدث كافة الخطوات من 5.6 فصاعدا، بما في ذلك التخزين النهائي، في ضوء منخفض. يمكن حماية أنابيب العينة بورق الألومنيوم. كانت التركيزات المستخدمة للأجسام المضادة في هذا البروتوكول: TH في 1:100، Iba1 في 1:200، والأجسام المضادة الثانوية في 1:100. أضف الحل الإضافي 2 إلى الخطوات 5.1-5.6 لضمان ملء الأنابيب بالكامل.
6. تطهير الأنسجة
- احتضان العينة في محلول مياه 20٪ الميثانول / 80٪ deionized لمدة ساعة واحدة في RT.
- احتضان العينة في 40٪ الميثانول / 60٪ محلول المياه deionized لمدة 1 ساعة في RT.
- احتضان العينة في محلول مياه 60٪ الميثانول / 40٪ deionized لمدة ساعة واحدة في RT.
- احتضان العينة في محلول مياه 80٪ الميثانول / 20٪ deionized لمدة ساعة واحدة في RT.
- احتضان العينة في الميثانول 100٪ لمدة ساعة واحدة في RT.
- احتضان في الميثانول الطازج 100٪ بين عشية وضحاها في RT.
- احتضان في 66٪ DCM/33٪ الميثانول لمدة 3 ساعة، مع اهتزاز، في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان في الأثير ديبينزيل (DBE) دون اهتزاز. اترك العينة في DBE حتى مسح وتخزينها في DBE حتى التصوير.
7. تصاعد
- الحصول على غرفة مطبوعة ثلاثية الأبعاد مصنوعة من راتنج Visijet M3 Crystal (قوالب متاحة على موقع idisco.info).
- تأمين الغرفة إلى شريحة المجهر باستخدام الايبوكسي.
- ضع العينة في المساحة المربعة في منتصف الغرفة.
- ملء الغرفة تماما مع DBE.
- ضع غطاء سميكا 0.17 مم فوق الغرفة وطبق الضغط حتى يتلامس الغطاء بشكل كامل مع جدران الغرفة.
- ختم حواف غطاء الغرفة باستخدام الايبوكسي.
- تدوير الغرفة للسماح فقاعات الهواء للهروب من مدخل التعبئة.
- ملء الغرفة مع DBE إضافية.
- ختم مدخل ملء مع الايبوكسي والسماح للعلاج.
ملاحظة: سوف DBE الزائدة تسرب أثناء تصاعد.
8. التصوير
- استخدام نظام المجهر confocal لإجراء z-مسح في التكبير 4x (انظر الفيديو 3Dالمرفقة ).
- تحقيق الإثارة الفلورية للعينة باستخدام مجموعة ليزر لتنبعث في الطول الموجي مماثلة للطول الموجي المحدد من قبل الأجسام المضادة الثانوية. تم تحقيق الإثارة TH باستخدام مجموعة ليزر HeNe لتنبعث منها في 632 نانومتر.
- تعيين الكاشف إلى الطول الموجي قريبة من انبعاث الليزر. بالنسبة للبروتوكول الحالي، تم تعيين كاشف TH إلى 650 نانومتر.
- رفع مكاسب الكاشف حتى يكون هناك إشارة مرئية. تم تعيين كسب 650LP للصور إلى 7.50 B.
- باستخدام خيار المسح الضوئي في برنامج التصوير البؤري، قم بتحريك مرحلة المجهر حتى يتم تركيز العينة.
- التنقل حول الأنسجة في جميع السهول والحصول على الصور إما واحدة أو صور z-كومة باستخدام برنامج التصوير confocal.
- بمجرد الانتهاء من التصوير، قم بإزالة العينة من الغرفة. وضعه مرة أخرى في أنبوب مليئة تماما مع DBE وتخزينها في RT في مكان مظلم، ويفضل أن تكون مغطاة رقائق الألومنيوم.
ملاحظة: يمكن remounted عينات وصور طالما إشارة فلوريسنس لا تزال قوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تحقيق التطهير الكامل للأقسام الكبيرة من كل من F344/N وأنسجة دماغ الفئران HIV-1 باستخدام بروتوكول إزالة الأنسجة الكارهة للماء المعدل هذا. يعرض الشكل 1 صورة كونفوجال نموذجية ل TH في منطقة نيغرا تحتستانتيا. يمثل الشكل 1A تلطيخا إيجابيا كثيفا. يمكن تحليل المناطق الكثيفة مثل هذه من خلال التركيز من خلال الطائرة "Z" لتأكيد تلطيخ إيجابي ومورفولوجيا الخلايا المناسبة. يمثل الشكل 1B تلطيخ إيجابي متفرق ، والتي يمكن تحديدها من قبل مورفولوجيا الخلايا العصبية TH المتميزة. الشكل 1C يمثل الأنسجة التي ليست ملطخة بشكل إيجابي ولكن لا يزال الظلام إلى الأزرق الفاتح بسبب إشارة الخلفية. تشير مناطق الصورة التي تظهر على أنها سوداء تماما إلى عدم وجود أنسجة في تلك المنطقة. يمكن أن تكون المناطق السوداء تماما في الصورة بسبب كونها على حافة العينة ، أو ثقب موجود في العينة ، أو أنسجة خارج التركيز.
الشكل 2A يظهر مورفولوجيا نموذجية من الخلايا العصبية الإيجابية TH في التكبير 20x. سوف تظهر الصور confocal الملطخة والمركزة بشكل صحيح من الناحية المثالية مضان مشرق وهش على خلفية مظلمة. وTH الخلايا العصبية الإيجابية لديه سوما كبيرة (جسم الخلية) والعديد من عمليات المتفرعة16. الشكل 2B يظهر Iba1 microglia الملون، والتي لديها أجسام الخلايا الصغيرة وأقصر عمليات تمديد17. تأكيد تلطيخ السليم والمتوقع مورفولوجيا الخلية هي الخطوة الأولى في التصوير.
يقارن الشكل 3 صورة مثالية(الشكل 3A)بثلاث صور غير مرغوب فيها (الشكل 3B-D). يظهر الشكل 3A تلطيخا إيجابيا ومشرقا على خلفية واضحة ومظلمة. تلطيخ إيجابي يمكن تمييزه بسهولة عن الخلفية. الشكل 3B هو مثال على صورة تركز بشكل غير صحيح مع الكثير من المكاسب الفلورية. ويبين الشكل 3C إشارة إيجابية خاطئة. النقاط المضيئة التي ليست في التركيز مع بقية الأنسجة هي القطع الأثرية وينبغي ألا تعتبر إشارة إيجابية. الشكل 3D هو مثال على استخدام مصل حجب لا يطابق الأجسام المضادة الثانوية ، كما هو مقترح في بروتوكول iDISCO الأصلي4. في هذه الصورة ، أدى استخدام مصل الحمير لأجسام مضادة ثانوية مصنوعة في الماعز إلى إنتاج صورة ذات خلفية عالية ، مما يحجب القدرة على تحديد التلطيخ الإيجابي بشكل صحيح.
يظهر الشكل 4A تلطيخ CTB إيجابي في دماغ الفئران. الألياف الطويلة والرقيقة هي إسقاطات أففيرنت على طول المسار الدوبامين. الشكل 4B والشكل 4C تظهر كولوكالينيس من TH وCTB. في الشكل 4B، يمكن رؤية الحقن في منطقة النواة المتكئة ، والتي تظهر كدائرة خضراء فلورية كثيفة. يعرض الشكل 4C تعني من TH و CTB في منطقة نيغرا substantia.
الشكل 1: صورة كونفوجكال لعينة نسيج مسح هيدروفوبيليكالي مع علامات، 4x التكبير. (أ) كثيفة TH تلطيخ في منطقة النيغرا substantia. (ب) الخلايا العصبية TH متفرق المتاخمة لnigra substantia. (ج) الأنسجة تفتقر إلى الخلايا العصبية TH إيجابية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مورفولوجيا نموذجية من الخلايا العصبية الإيجابية TH المسمى fluorescently (20x التكبير) وIba1 microglia إيجابية (10x التكبير). (أ) اثنين من الخلايا العصبية الإيجابية TH ممثل. (ب) Iba1 ميكروجليا إيجابية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور كونفولوجية مثالية وضعيفة للأنسجة المطهية هيدروفوبيليكالي، التكبير 4x. (أ) كثيفة TH تلطيخ في منطقة نيغرا substantia، بشكل صحيح في التركيز مع كسب مضان مناسبة. (ب) صورة مركزة بشكل غير صحيح ومفرطة في التعرض. (ج) تلطيخ إيجابي كاذب. (D) تلطيخ الخلفية العالية نتيجة اتباع بروتوكول iDISCO غير المعدل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الكوليرا السم باء وضع العلامات على طول المسار الدوبامين، 4x التكبير. (أ) صورة Confocal من تلطيخ CTB إيجابية. (ب) صورة متداخلة من TH و CTB والنواة accumbens موقع الحقن. (ج) كولكالينج من TH وCTB في منطقة نيغرا substantia. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1 : فيلم 3D من ض المسح الضوئي للعينة في التكبير 4x. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر تطهير الأنسجة حلا لقيود بروتوكول IHC التقليدي. عينة شفافة تقلل من تشتت وامتصاص الضوء ، والتي توفر الوصول البصري على المستوى الخلوي إلى الأنسجة السليمة18،19. تقنيات إزالة الأنسجة تحويل نسيج شفاف من خلال delipidation، إزالة اللون، والشارات مع إدارة المذيبات. بمجرد أن يطابق مؤشر الانكسار لعينة الأنسجة مؤشر الانكسار لوسط التصوير المختار ، ستظهر العينة شفافة تماما ويمكن تصويرها بشكل صحيح3. البروتوكول الحالي الكاره للماء يزيل الماء من الأنسجة في خطوات الجفاف الأولية ، وبالتالي تقليل تشتت الضوء. يتم اختراق الأنسجة أثناء المعالجة المسبقة للسماح بتغلغل الأجسام المضادة العميقة. الأنسجة التي خضعت للبروتوكول قادرة على التعامل معها بسهولة ويمكن تصويرها عدة مرات. إذا تم تخزينها بشكل صحيح ، لا تزال الأنسجة قادرة على توفير الصور لمدة تصل إلى عام بعد المعالجة الأولية.
في هذا البروتوكول، ونحن نطبق تقنية إزالة الأنسجة الكارهة للماء إلى F344/N وفيروس نقص المناعة البشرية-1 TG عينات أنسجة الدماغ الفئران لبقعة لTH، Iba1، وCTB. بعد المقاصة ، تم تصوير عينات الأنسجة باستخدام المجهر confocal. البروتوكول الحالي له العديد من المزايا على بروتوكول مسعور آخر، مثل iDISCO4. أولا، تم التحقق من صحة بروتوكول iDISCO الأصلي للاستخدام في أنسجة الفئران، في حين أن البروتوكول الحالي قابل للتطبيق في أنسجة دماغ الفئران. ثانيا، يسمح وقت الحضانة المعدل في كل خطوة باستخدام هذه التقنية لأقسام الأنسجة الأكبر. ثالثا، بما في ذلك المصل المقابل أثناء حضانة الأجسام المضادة (بدلا من استخدام مصل عام) يوفر صورا أوضح للتحليل.
10- وفي حين أن البروتوكول الحالي قابل للتكيف بسهولة ليناسب احتياجات كل سؤال من المسائل البحثية، فهناك عدة اعتبارات هامة. يستغرق البروتوكول، على الأقل، 26 يوما متتاليا من البداية إلى النهاية. لا تترك العينة في حل لفترة أطول من المذكورة أعلاه. ومع ذلك، يمكن تخزين العينة في DBE في نهاية البروتوكول لمدة 6 أشهر على الأقل بأمان حتى التصوير، على الرغم من أنه ينصح بالصور في أقرب وقت ممكن. اطلب غرفة مطبوعة ثلاثية الأبعاد تناسب العينة بشكل مريح بين شريحة المجهر وشريحة الأغطية. وكانت جميع حلول الأسهم، باستثناء الحل 1، مختلطة في اليوم من المبلغ المناسب لاستخدام ذلك اليوم. يجب نقل العينة إلى أنبوب جديد كلما تم إدخال حل جديد لمنع التلوث المتبادل. إذا كان النمو الميكروبي مصدر قلق ، يمكن إضافة أزيد الصوديوم إلى الحل 2 ، الحل 3 ، الحل 4 ، حل الأجسام المضادة الأساسي ، وحل الأجسام المضادة الثانوي بتركيز 0.02٪ في الحل الكلي.
عموما، تقنية الحالية هو متعدد الاستخدامات للغاية، وسهلة التنفيذ، وإجراءات منخفضة التكلفة التي تتوافق مع العديد من الأجسام المضادة. مع هذا البروتوكول الذي تم التحقق من صحته للعمل في كل من F344/N السيطرة وفيروس نقص المناعة البشرية-1 TG الفئران، يمكن الإجابة على العديد من الأسئلة الجديدة البحوث التحقيقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى أي من أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من منح المعاهد القومية للصحة: NS100624، DA013137، HD043680، MH106392 & amp؛ بواسطة T32 منحة التدريب 5T32GM081740
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | C34775 | |
| DBE | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| DCM | Sigma-Aldrich | 270997-100mL | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-1L | |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-500 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Goat serum | Sigma Life Science | G9023-10mL | |
| Heparin | Acros Organics | 41121-0010 | |
| Iba1 primary antibody | FUJIFILM Wako | 019-19741 | |
| Kwik-sil epoxy | VWR | 70730-062 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1l-R | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP2944-100 | |
| Perfusion machine | VWR | 70730-062 | mini pump variable flow |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-3KG | |
| TH primary antibody | Millipore Sigma | AB152 | |
| TritonX-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Tween-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
References
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
- Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
- Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).
- Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152 (2018).
- Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
- Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
- Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
- Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
- Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
- Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
- Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
