Summary
在这里，我们提出了一个疏水组织清除方法，允许查看目标分子作为完整的大脑结构的一部分。这项技术现已得到F344/N控制和艾滋病毒-1转基因两性大鼠的验证。
Abstract
疏水组织清除方法易于调节、快速和低成本的程序，允许研究未受变组织样本中感兴趣的分子。传统的免疫标签程序要求将样品切成薄部分，这限制了标记和检查完整结构的能力。但是，如果脑组织在处理过程中能够保持完整，则结构和回路可以保持完好无损进行分析。先前建立的清除方法需要大量时间才能完全清除组织，而苛刻的化学物质通常会损害敏感的抗体。iDISCO 方法快速、完全地清除组织，与许多抗体兼容，无需特殊的实验室设备。这项技术最初被验证用于小鼠组织，但目前的协议使这种方法适应了控制半球和转基因大鼠大脑的图像。除此之外，本协议还对预先存在的协议进行了若干调整，以提供更清晰的图像，减少背景污渍。使用目前的疏水组织清除方法，在HIV-1转基因大鼠和F344/N控制大鼠中验证了Iba-1和酪氨酸羟基酶的抗体。大脑是一个交织在一起的网络，结构相互作用的频率高于彼此的相互作用。分析整个系统的大脑，而不是单个片段的组合，是整个大脑清理方法的最大好处。
Introduction
一些组织清除技术已被验证用于大脑：水凝胶，亲水性和疏水性。这些技术旨在通过溶剂的管理，通过脱毛、去装饰和贴花来使组织透明化。一旦组织样本的折射指数与所选成像介质的折射指数匹配，就可以获得样本的清晰图像。水凝胶技术，如 CLARITY，通过将生物分子与丙烯酸酯水凝胶连接起来，确保组织中的生物分子的安全，从而防止结构损伤和蛋白质损失1.然而，水凝胶技术使用的苛刻化学物质比有可能损害更脆弱的组织，更密集的组织样本可能不符合水凝胶协议。某些水凝胶技术可能需要昂贵的设备或导致组织扩张。亲水技术，如立方体，通过在组织2内形成氢键来保存3D结构。组织扩张也可能发生在某些亲水协议中。亲水技术的清除能力往往与疏水技术的能力不相称，这对更稠密、更厚的组织非常重要。
疏水技术通常速度快，不需要特殊设备，并产生易于处理和存储的样品。iDISCO 是一种疏水技术，可消除其他疏水协议中可能发生的收缩。最初，DISCO组织清除技术是由Renier等人描述的 ，用于小鼠的胚胎和密集的成人器官。该技术在初始脱水步骤中去除组织中的水，从而减少光散射。组织在预处理过程中渗透，允许深层抗体渗透。远红光谱中的亚历克萨氟染料用于免疫标签，以避免组织在低波长5的自身发光。经过疏水清除协议的组织能够轻松处理，并且由于 Alexa 氟染料的寿命长，可以成像几次。如果储存得当，组织可以在初始处理后提供数月到一年的图像。
在本协议中，酪氨酸羟基酶（TH）抗体、Iba1抗体和霍乱毒素亚细胞B（CTB）用于男性和女性控制以及HIV-1转基因（Tg）大鼠大脑。HIV-1 Tg大鼠拥有构成HIV-1病毒基因组的9个基因中的7个，这导致了长期HIV-1蛋白暴露的非传染性模型6，7，8。多巴胺变种以前在HIV-1 Tg大鼠身上已经证明，HIV-1本身是一种炎症性疾病，所以抗体选择与实验设计9，10，11，12有关。CTB是一种通过结核结合附着在神经元的示踪器，可用于追踪大脑中令人不关心的投影。CTB以前曾被用来研究从细胞核到亚斯坦蒂娅黑鬼区域的投影，大脑的两个区域严重涉及多巴胺性通路13、14、15。
在此协议中，TH 将作为多巴胺生产的标志，Iba1 将标记激活的微胶质。TH 抗体使用选择性地标记单个带在大约 62 kDa，对应酪氨酸羟基酶。Iba1 抗体对应于 Iba1 卡盒终端序列。这两种抗体都是在兔子身上培养的，是多克隆的。CTB 将用于逆行追踪神经元从细胞核区到亚斯坦蒂娅黑鬼区域。当前协议还以两种不同的方式为原 iDISCO 协议的调整提供了指导：1） 通过更改阻塞步骤中的血清试剂来全面减少背景染色，2） 扩大孵化时间以适合较大的组织样本。总体而言，本协议提供了持续的证据，证明疏水清除技术在大鼠的脑组织中是可行的，与HIV-1病毒蛋白没有明显的有害相互作用，并且与TH抗体、Iba1抗体和CTB相容。
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Protocol
所有动物协议都经过南卡罗来纳大学动物护理和使用委员会的审查和批准。
1. 库存解决方案准备
- 解决方案 1 （1 L）： 到 900 mL 的去离子 H2O 添加 100 mL 的 10 倍磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和 2 mL 的 Triton X-100。
- 解决方案 2 （1 L）： 至 900 mL 的去离子 H2O， 添加 100 mL 的 10 倍 PBS， 2mL 的 Tween-20 和 1 mL 的 10 毫克/mL 肝素库存解决方案。
- 解决方案 3 （500 mL）： 至 400 mL 的解决方案 1，添加 11.5 克甘氨酸和 100 mL 二甲基硫化物 （DMSO）。
- 解决方案 4 （50 mL）：要达到 42 mL 的解决方案 1，添加 3 mL 的相应血清和 5 mL 的 DMSO。
- 初级抗体溶液 （50 mL）：要达到 46 mL 的解决方案 2，添加 2.5 mL 的 DMSO 和 1.5 mL 的相应血清。
- 二级抗体溶液 （50 mL）：要达到 48.5 mL 的解决方案 2，添加 1.5 mL 的相应血清。
注：对于解决方案 4、初级溶液和二级溶液，请使用与二级抗体（例如山羊、马、牛）对应的血清。
2. 样品制备
注：由于限制对 PFA 的暴露，请在烟雾罩中执行步骤 2.1 至 2.7。
- 使用 sevoflurane 对幼鼠（3-6 周）进行深度麻醉;当大鼠没有反应，对脚趾和尾巴捏没有反应时，继续到2.2。
- 将老鼠放在一个超音位，用一把虹膜剪刀切开腹部壁。
- 用梅奥剪刀切开肋骨笼底部，切到肋骨笼两侧的锁骨上。
- 用下皮将胸骨和肋骨与心脏和肺部擦开。
- 用23G针刺穿左心室，连接到灌注泵上，用虹膜剪刀切开右心房。
- 用约 75 mL 的 100 mM （1x） PBS 进行跨心灌注。
- 继续转心灌注，在 1x PBS 中缓冲约 100 mL 的 4% 半甲醛 （PFA）。
- 用钳子把大脑从头骨上取下。
- 将大脑置于下垂位置，然后使用剃须刀刀片和鼠脑矩阵切成4个相等部分（宽度约3毫米）。
- 在密封的 5mL 塑料管中将每个部分在 1x PBS 中将每个部分在 4% PFA 中固定在摇床上，在 4 °C 处过夜。
- 在室温下（RT）在摇床上将 4% PFA 固定在 1x PBS 中，持续固定 1 小时。
- 在 RT 中用 1x PBS 清洗每个部分 30 分钟，3 次。
3. 脱水和脱皮
- 在 RT 的 20% 甲醇/80% 去离子水溶液中孵育样品 1 小时。
- 在 RT 的 40% 甲醇/60% 去离子水溶液中将样品孵育 1 小时。
- 在 RT 的 60% 甲醇/40% 去离子水溶液中孵育样品 1 小时。
- 在 RT 的 80% 甲醇/20% 去离子水溶液中将样品孵育 1 小时。
- 在 Rt. 用超过 100% 甲醇重复 1 小时的 100% 甲醇孵化样品， 在 Rt 孵育 1 小时。
- 将样品在 4° C 下 100% 甲醇中冷却约 10 分钟。
- 准备 66% 二氯甲烷 （DCM）/33% 甲醇溶液。
- 在 RT 的 DCM/甲醇溶液中将样品在一夜之间孵化，并进行摇晃。
- 在 Rt 用甲醇清洗 30 分钟， 2 次。
- 将样品在 4° C 下 100% 甲醇中冷却约 10 分钟。
- 在 4° C 下，在甲醇中冷冻、新鲜制备的 5% 过氧化氢中漂白过夜。
- 在 RT 的 80% 甲醇/20% 去离子水溶液中将样品孵育 1 小时。
- 在 RT 的 60% 甲醇/40% 去离子水溶液中孵育样品 1 小时。
- 在 RT 的 40% 甲醇/60% 去离子水溶液中将样品孵育 1 小时。
- 在 RT 的 20% 甲醇/80% 去离子水溶液中孵育样品 1 小时。
- 在 RT 将样品在 1x PBS 中孵育 1 小时。
- 在 RT 中将溶液 1 洗涤 1 小时，2 次。
4. 霍乱毒素子字组 B 标签
- 将 1 mL 注射器的针尖插入原子核累积位点。
- 慢慢注射 2.5 μL 的 1% 生物素 CTB 超过 20 秒。
- 将针尖留在原位 1 分钟，然后缓慢取出超过 10 秒，以防止泄漏。
5. 抗体应用
- 在水浴中将样品在 37 °C 下在解决方案 3 中孵育 2 天。
- 在水浴中将样品在溶液 4 中孵育 2 天，在 37 °C 下。
- 在水浴中用原性抗体在 37 °C 下孵育 7 天。
- 在解决方案 2 中清洗 5 次，每次洗涤孵育 1 小时。在 Rt 过夜存储解决方案 2 。
- 在水浴中37°C下用二次抗体孵育7天。
- 在解决方案 2 中清洗 5 次，每次洗涤孵化 1 小时;在 Rt 过夜的解决方案 2 中存储。
注：从 5.6 开始的所有步骤，包括最终存储，应在低光下进行。样品管可以用铝箔屏蔽。本协议中用于抗体的浓度为：TH在1：100，Iba1在1：200，二级抗体在1：100。在步骤 5.1-5.6 中添加额外的解决方案 2，以确保管子完全充满。
6. 组织清除
- 在 RT 的 20% 甲醇/80% 去离子水溶液中孵育样品 1 小时。
- 在 RT 的 40% 甲醇/60% 去离子水溶液中将样品孵育 1 小时。
- 在 RT 的 60% 甲醇/40% 去离子水溶液中孵育样品 1 小时。
- 在 RT 的 80% 甲醇/20% 去离子水溶液中将样品孵育 1 小时。
- 在 RT 将样品在 100% 甲醇中孵育 1 小时。
- 在 Rt 过夜孵育新鲜 100% 甲醇。
- 在室温下以 66% DCM/33% 甲醇孵育 3 小时，并具有抖动。
- 在二苯醚 （DBE） 中孵育，无需摇晃。将样品留在 DBE 中直到清除，并存储在 DBE 中直到成像。
7. 安装
- 获取由 Visijet M3 水晶树脂制成的 3D 打印室（idisco.info 网站上提供模板）。
- 使用环氧树脂将腔室固定在显微镜滑动器上。
- 将样品放在房间中间的方形空间中。
- 将房间完全填充 DBE。
- 将 0.17 毫米厚的盖唇放在腔室上并施加压力，直到盖唇与腔室墙壁完全接触。
- 使用环氧树脂将盖唇边缘密封到腔室。
- 旋转腔室，让气泡从填充入口中逸出。
- 给会议厅加满额外的 DBE。
- 用环氧树脂密封灌装入口，并允许治愈。
注意：在安装过程中，多余的 DBE 会溢出。
8. 成像
- 使用共聚焦显微镜系统进行 4 倍放大的 z 扫描（参见所附 的 3D 视频）。
- 使用激光设置以类似于二级抗体指定的波长的波长发出样品的荧光激发。利用 HeNe 激光集以 632 nm 的速度发射，实现了 TH 激发。
- 将探测器设置为接近激光发射的波长。对于当前协议，TH 探测器设置为 650 nm。
- 提高探测器的增益，直到有可见信号。图像的 650LP 增益设置为 7.50 B。
- 使用共聚焦成像软件中的 扫描 选项，移动显微镜阶段，直到样品成为焦点。
- 在所有平原的组织周围导航，并使用共焦成像软件获取单个图像或 z 堆栈图像。
- 成像完成后，将样品从腔室中取出。将其放回完全充满 DBE 的管子中，并存放在 RT 的黑暗地方，最好用铝箔覆盖。
注：只要荧光信号仍然强烈，样品就可以重新安装并成像。
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Representative Results
利用这种经过修改的疏水组织清除方案，实现了F344/N和HIV-1大鼠脑组织的大面积完全清除。 图1 显示了在亚斯坦蒂娅尼格拉区域TH的典型共聚焦图像。 图 1A 表示密集、正色。通过"Z"平面聚焦以确认正染色和适当的细胞形态，可以分析出像这样的密集区域。 图1B 表示稀疏的正染色，可以通过TH神经元独特的形态来识别。 图 1C 表示未正面染色但因背景信号而变暗至浅蓝色的组织。图像中显示为完全黑色的区域表示该区域没有组织。图像中的完全黑色区域可能是由于位于样品边缘、样品中的孔或失去焦点的组织。
图2A显示TH阳性神经元的典型形态，放大倍数为20倍。正确染色和聚焦的聚焦图像最好在黑暗的背景下显示明亮而清脆的荧光。TH阳性神经元有一个大的躯体（细胞体）和几个分支过程16。图2B显示Iba1染色微胶质，具有小细胞体和较短的扩展过程17。确认适当的染色和预期的细胞形态是成像的第一步。
图3 将理想图像（图3A）与三幅不良图像（图3B-D）进行比较。 图 3A 在清晰、黑暗的背景下显示正光、明亮的污渍。正染色很容易与背景区分开来。 图 3B 是集中注意力不当的图像的示例，具有太多的荧光增益。 图 3C 显示误报信号。与组织的其他部分不集中的亮点是人工制品，不应被视为一个积极信号。 图3D 是使用阻塞血清，不符合次要抗体的例子，如原来的iDISCO协议4建议。在这张图片中，使用驴血清作为山羊制造的二级抗体，产生了高背景染色图像，从而掩盖了正确识别正染色的能力。
图4A 显示大鼠大脑中CTB阳性染色。长而薄的纤维是沿着多巴胺通道的冷漠投影。 图 4B 和 图 4C 显示 TH 和 CTB 的共位化。在 图4B中，注射可以在原子核区看到，该区域呈浓密的荧光绿色圆。 图4C 显示TH和CTB在亚斯坦蒂亚尼格拉区域的共定位。
图1：水性清除组织样本的共聚焦图像，标记，放大4倍。（A） 在亚斯坦丁亚尼格拉地区密集的 TH 污渍。（B） 稀疏的TH神经元毗邻亚斯坦蒂娅尼格拉。（C） 缺乏正TH神经元的组织。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：荧光标记的TH阳性神经元（20倍放大）和Iba1阳性微胶质（10倍放大）的典型形态。（A） 两个有代表性的TH阳性神经元。（B） 伊巴1阳性微胶质。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：疏水清除组织的理想和差的共聚焦图像，放大4倍。（A） 在亚斯坦丁亚黑gra区域的致密TH染色，适当聚焦与适当的荧光增益。（B） 注意力不集中和过度曝光的图像。（C） 误报染色。（D） 高背景污渍，因为遵循未不变的 iDISCO 协议。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：霍乱毒素B沿多巴胺通路标注，放大4倍。（A） 正 CTB 染色的主要图像。（B） TH 和 CTB 和核累积注射部位的重叠图像。（C） 在亚斯坦提亚尼格拉地区将TH和CTB共用化。 请单击此处查看此图的较大版本。
电影1：Z-扫描样品的3D电影，放大4倍。请点击这里下载此视频。
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Discussion
组织清除为传统 IHC 协议的局限性提供了解决方案。透明的样品可最大限度地减少光的散射和吸收，从而提供细胞水平的光学访问到完整的组织18，19。组织清除技术通过脱毛、去装饰和贴花与溶剂的管理使组织透明化。一旦组织样本的折射指数与所选成像介质的折射索引匹配，样本将呈现完全透明，并可以正确成像3。目前的疏水方案在初始脱水步骤中从组织中去除水，从而减少光散射。组织在预处理过程中渗透，允许深层抗体渗透。已处理协议的组织能够轻松处理，并且可以成像几次。如果储存得当，组织在初始处理后仍能提供长达一年的图像。
在本协议中，我们将疏水组织清除技术应用于 F344/N 和 HIV-1 Tg 大鼠脑组织样本，以染色 TH、Iba1 和 CTB。清理后，使用共聚焦显微镜对组织样本进行成像。与其他疏水协议（如 iDISCO4）相比，本协议有几个优点。首先，原始的iDISCO协议被验证用于小鼠组织，而目前的协议在老鼠脑组织中是可行的。其次，每个步骤的调整孵化时间允许该技术用于较大的组织部分。第三，包括抗体孵化过程中的相应血清（而不是使用一般血清），提供更清晰的图像进行分析。
虽然本协议很容易适应个别研究问题的需要，但有几个重要的考虑因素。该协议至少需要从头到尾连续26天。不要将样品留在溶液中的时间超过上述时间。但是，样品可以在协议结束时安全地存储在 DBE 中至少 6 个月，直到成像，但建议尽快成像。订购一个3D打印室，将适合显微镜幻灯片和覆盖唇之间的样品紧贴。除解决方案 1 外，所有股票解决方案都是混合的，其数量适合当天使用。每当引入新溶液以防止交叉污染时，应将样品移到新管中。如果微生物生长值得关注，则可以在解决方案 2、解决方案 3、解决方案 4、初级抗体溶液和总溶液浓度为 0.02% 的二级抗体溶液中添加钠 azide。
总的来说，目前的技术是一种极其多才多艺，易于实施，低成本的程序，与许多抗体兼容。通过这个协议，验证在F344/N控制和HIV-1 Tg大鼠的工作，许多新的调查研究问题可以回答。
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Disclosures
作者没有利益冲突要申报。
Acknowledgments
这项工作由国家卫生研究院赠款资助：NS100624、DA013137、HD043680、MH106392 – T32 培训补助金 5T32GM081740
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | C34775 | |
| DBE | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| DCM | Sigma-Aldrich | 270997-100mL | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-1L | |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-500 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Goat serum | Sigma Life Science | G9023-10mL | |
| Heparin | Acros Organics | 41121-0010 | |
| Iba1 primary antibody | FUJIFILM Wako | 019-19741 | |
| Kwik-sil epoxy | VWR | 70730-062 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1l-R | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP2944-100 | |
| Perfusion machine | VWR | 70730-062 | mini pump variable flow |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-3KG | |
| TH primary antibody | Millipore Sigma | AB152 | |
| TritonX-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Tween-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
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