Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En hydrofobisk vævsclearingmetode til rottehjernevæv

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/61821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

Her præsenterer vi en hydrofobisk vævsclearingmetode, der giver mulighed for visning af målmolekyler som en del af intakte hjernestrukturer. Denne teknik er nu blevet valideret for F344/N kontrol og HIV-1 transgene rotter af begge køn.

Abstract

Hydrofobe vævsclearingmetoder er let justerbare, hurtige og billige procedurer, der giver mulighed for undersøgelse af et molekyle af interesse for uændrede vævsprøver. Traditionelle immunolabelingsprocedurer kræver, at prøven skæres i tynde sektioner, hvilket begrænser evnen til at mærke og undersøge intakte strukturer. Men hvis hjernevævet kan forblive intakt under behandlingen, kan strukturer og kredsløb forblive intakte til analysen. Tidligere etablerede clearingmetoder tager betydelig tid at rydde vævet fuldstændigt, og de hårde kemikalier kan ofte skade følsomme antistoffer. IDISCO-metoden rydder hurtigt og fuldstændigt væv, er kompatibel med mange antistoffer og kræver intet specielt laboratorieudstyr. Denne teknik blev oprindeligt valideret til brug i mus væv, men den nuværende protokol tilpasser denne metode til billedet halvkugler af kontrol og transgene rotte hjerner. Derudover foretager denne protokol også flere justeringer af den allerede eksisterende protokol for at give klarere billeder med mindre baggrundsplejning. Antistoffer for Iba-1 og tyrosinhydroxylase blev valideret i hiv-1-transgene rotter og i F344/N-kontrolrotter ved hjælp af den nuværende hydrofobe vævsclearingmetode. Hjernen er et sammenvævet netværk, hvor strukturer arbejder sammen oftere end hver for sig. Analyse af hjernen som et helt system i modsætning til en kombination af individuelle stykker er den største fordel ved hele denne hjerne clearing metode.

Introduction

Flere væv clearing teknikker er blevet valideret til brug i hjernen: hydrogel, hydrofil, og hydrofobisk. Disse teknikker har til formål at gøre et væv gennemsigtigt gennem afføring, affarvning og afkalkning via indgift af opløsningsmidler. Når vævsprøvens brydningsindeks svarer til det valgte billedmediums brydningsindeks, kan der opnås et klart billede af prøven. Hydrogelbaserede teknikker, såsom KLARHED, sikrer biomolekyler i vævet ved at forbinde dem med akrylsbaserede hydrogeler, som forhindrer strukturelle skader og tab af proteiner1. Hydrogel-teknikker anvender imidlertid barske kemikalier end har potentiale til at beskadige mere skrøbelige væv, og tættere vævsprøver er muligvis ikke kompatible med hydrogelprotokollen. Visse hydrogel teknikker kan kræve dyrt udstyr eller føre til væv ekspansion. Hydrofile teknikker, som CUBIC, bevarer 3D-struktur gennem dannelsen af hydrogenbindinger i vævet2. Vævsudvidelse kan også forekomme i visse hydrofile protokol. De hydrofile teknikkers clearingevne matcher ofte ikke den evne, som hydrofobe teknikker har, hvilket er vigtigt for tættere og tykkere væv3.

Hydrofobe teknikker er normalt hurtige, kræver ikke specielt udstyr og producerer en prøve, der er let at håndtere og opbevare. iDISCO er en hydrofobisk teknik, der eliminerer krympning, der kan forekomme i andre hydrofobe protokol. Oprindeligt blev iDISCO-vævsclearingteknikken beskrevet af Renier et al.4 for embryoner og tætte, voksne organer hos mus. Denne teknik fjerner vand fra vævet i det indledende dehydreringstrin og reducerer derved lysspredningen. Væv er gennemtrængelig under forbehandling at tillade dyb antistof penetration. Alexa Fluor farvestoffer i det langt røde spektrum bruges til immunolabeling for at undgå autofluorescens af vævet ved lavere bølgelængder5. Væv, der har gennemgået hydrofobe clearing protokoller er i stand til at håndteres nemt og kan afbildes flere gange på grund af levetiden af Alexa Fluor farvestoffer. Hvis de opbevares korrekt, kan væv give billeder i måneder til et år efter den første behandling.

I denne protokol blev tyrosinhydrafylase (TH) antistof, Iba1 antistof og Koleratoksin subunit B (CTB) anvendt på både mandlig og kvindelig kontrol og HIV-1 transgene (Tg) rottehjerner. HIV-1 Tg-rotten besidder syv af de ni gener, der udgør HIV-1 viralt genom, hvilket fører til en ikke-infektiøs model for langvarig HIV-1 proteineksponering6,7,8. Dopaminergiske ændringer er tidligere blevet påvist i HIV-1 Tg-rotten, og HIV-1 i sig selv er en inflammatorisk sygdom, så antistofvalget var relevant for det eksperimentelle design9,10,11,12. CTB er en sporstof, der tillægger neuroner via ganglioside bindende og kan bruges til at spore afferente fremskrivninger i hjernen. CTB har tidligere været brugt til at studere fremskrivninger fra kernen accumbens til substantia nigra området, to områder af hjernen stærkt involveret med dopaminergiske veje13,14,15.

I denne protokol vil TH fungere som en markør for dopaminproduktion, og Iba1 vil markere aktiveret mikroglia. Det anvendte TH-antistof mærker selektivt et enkelt bånd på ca. 62 kDa, der svarer til tyrosinhydroxylase. Iba1-antistoffet svarer til Iba1-carboxyterminalsekvensen. Begge antistoffer blev opdrættet i kanin og var polyklonale. CTB vil blive anvendt til retrograd sporing af neuroner fra kernen accumbens område til substantia nigra området. Den nuværende protokol indeholder også en retningslinje for justering af den oprindelige iDISCO-protokol på to forskellige måder: 1) samlet reduktion af baggrundsfarvningen ved at ændre serumreagenserne i blokeringstrinnene og 2) skalering af inkubationstiden for at være egnet til større vævsprøver. Samlet set giver denne protokol fortsat bevis for, at hydrofobe clearingteknikker er mulige i rotters hjernevæv, ikke har nogen mærkbar skadelig interaktion med HIV-1-virusproteiner og er kompatible med TH-antistof, Iba1-antistof og CTB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprotokoller blev gennemgået og godkendt af Animal Care and Use Committee ved University of South Carolina.

1. Forberedelse af stamopløsning

  1. Opløsning 1 (1 L): Til 900 ml deioniseret H2O tilsættes 100 ml 10x fosfat buffered saltvand (PBS) og 2 ml Triton X-100.
  2. Opløsning 2 (1 L): Til 900 ml deioniseret H2O tilsættes 100 ml 10x PBS, 2 ml Tween-20 og 1 ml 10 mg/mL Heparin-stamopløsning.
  3. Opløsning 3 (500 ml): Til 400 ml opløsning 1 tilsættes 11,5 g g glycin og 100 ml dimethylsulfoxid (DMSO).
  4. Opløsning 4 (50 ml): Til 42 ml opløsning 1 tilsættes 3 ml tilsvarende serum og 5 ml DMSO.
  5. Primær antistofopløsning (50 ml): Til 46 ml opløsning 2 tilsættes 2,5 ml DMSO og 1,5 ml tilsvarende serum.
  6. Sekundær antistofopløsning (50 ml): Til 48,5 ml opløsning 2 tilsættes 1,5 ml tilsvarende serum.
    BEMÆRK: For opløsning 4, primær opløsning og sekundær opløsning skal du bruge et serum, der svarer til det sekundære antistof (f.eks. ged, hest, kvæg).

2. Prøveforberedelse

BEMÆRK: Udfør trin 2.1 til 2.7 i en røghætte for at begrænse eksponeringen for PFA.

  1. Dybt bedøve unge (3-6 uger) rotte ved hjælp af sevoflurane; fortsætte til 2,2, når rotten ikke reagerer og ikke reagerer på tå- og haleklep.
  2. Læg rotten i en liggende position og lav et snit gennem bugvæggen ved hjælp af en Iris saks.
  3. Skær op gennem bunden af brystkassen til kravebenet på begge sider af brystkassen ved hjælp af Mayo saks.
  4. Fastgør brystbenet og ribbenene væk fra hjertet og lungerne med en hæmostat.
  5. Pierce venstre ventrikel med en 23 G nål fastgjort til en perfusion pumpe og skære højre atrium med Iris saks.
  6. Transcardial perfusion udføres med ca. 75 mL 100 mM (1x) PBS.
  7. Fortsæt transcardial perfusion med ca. 100 mL 4% paraformaldehyd (PFA) bufferet i 1x PBS.
  8. Fjern hjernen fra kraniet ved hjælp af pincet.
  9. Placer hjernen i sagittal position og skær i 4 lige sektioner (ca. 3 mm i bredden) ved hjælp af et barberblad og en rotte hjerne matrix.
  10. Hvert afsnit fastgøres i 4% PFA i 1x PBS i et forseglet, 5 mL plastrør natten over ved 4 °C på en shaker.
  11. Fortsæt med at fastsætte i 4% PFA i 1x PBS ved stuetemperatur (RT) på en shaker i 1 time.
  12. Vask hvert afsnit med 1x PBS ved RT i 30 min, 3 gange.

3. Dehydrering og depigmentering

  1. Prøven inkuberes i en 20% methanol/80% deioniseret vandopløsning i 1 time ved RT.
  2. Prøven inkuberes i en 40% methanol/60% deioniseret vandopløsning i 1 time ved RT.
  3. Prøven inkuberes i en 60% methanol/40% deioniseret vandopløsning i 1 time ved RT.
  4. Prøven inkuberes i en 80% methanol/20% deioniseret vandopløsning i 1 time ved RT.
  5. Prøven inkuberes i 100% methanol i 1 time ved RT. Gentag med mere end 100% methanol, der inkuberes i 1 time ved RT.
  6. Prøven nedkøles i 100% methanol ved 4°C i ca. 10 min.
  7. Forbered en 66% dichlormethan (DCM)/33% methanolopløsning.
  8. Prøven inkuberes natten over i DCM/methanolopløsningen ved RT med omrystning.
  9. Vask med methanol på RT i 30 min, 2 gange.
  10. Prøven nedkøles i 100% methanol ved 4°C i ca. 10 min.
  11. Blegemiddel i kølet, frisklavet 5% hydrogenperoxid i methanol natten over ved 4 ° C.
  12. Prøven inkuberes i en 80% methanol/20% deioniseret vandopløsning i 1 time ved RT.
  13. Prøven inkuberes i en 60% methanol/40% deioniseret vandopløsning i 1 time ved RT.
  14. Prøven inkuberes i en 40% methanol/60% deioniseret vandopløsning i 1 time ved RT.
  15. Prøven inkuberes i en 20% methanol/80% deioniseret vandopløsning i 1 time ved RT.
  16. Prøven inkuberes i 1x PBS i 1 time ved RT.
  17. Vask i løsning 1 i 1 time ved RT, 2 gange.

4. Kolera toksin underenhed B mærkning

  1. Sæt nålespidsen på 1 mL sprøjte i kernen accumbens site.
  2. Injicer langsomt 2,5 μL af 1% biotin-CTB over 20 s.
  3. Lad nålespidsen være på plads i 1 min og fjern langsomt over 10 s for at forhindre lækage.

5. Antistof ansøgning

  1. Prøven i opløsning 3 inkuberes i 2 dage ved 37 °C i et vandbad.
  2. Prøven i opløsning 4 inkuberes i 2 dage ved 37 °C i et vandbad.
  3. Inkuber med primært antistof i 7 dage ved 37 °C i et vandbad.
  4. Vask i opløsning 2 i 5 gange, inkuber 1 time pr. vask. Opbevares i løsning 2 på RT natten over.
  5. Inkuber med sekundært antistof i 7 dage ved 37 °C i vandbad.
  6. Vask i opløsning 2 i 5 gange, inkuber 1 time pr. vask; i løsning 2 på RT natten over.
    BEMÆRK: Alle trin fra 5.6 og fremefter, herunder endelig opbevaring, skal forekomme i svagt lys. Prøverørene kan afskærmes med aluminiumsfolie. Koncentrationerne, der blev anvendt til antistofferne i denne protokol, var: TH kl. 1:100, Iba1 kl. 1:200 og det sekundære antistof kl. 1:100. Tilfør yderligere løsning 2 til trin 5.1-5.6 for at sikre, at rørene er helt fyldt.

6. Vævsrydning

  1. Prøven inkuberes i en 20% methanol/80% deioniseret vandopløsning i 1 time ved RT.
  2. Prøven inkuberes i en 40% methanol/60% deioniseret vandopløsning i 1 time ved RT.
  3. Prøven inkuberes i en 60% methanol/40% deioniseret vandopløsning i 1 time ved RT.
  4. Prøven inkuberes i en 80% methanol/20% deioniseret vandopløsning i 1 time ved RT.
  5. Inkuber prøven i 100% methanol i 1 time ved RT.
  6. Inkuber i frisk 100% methanol natten over på RT.
  7. Inkuber i 66% DCM/33% methanol i 3 timer, med rysten, ved stuetemperatur.
  8. Inkuberes i dibenzyl ether (DBE) uden at ryste. Lad prøven stå i DBE, indtil den er klar, og opbevar den i DBE, indtil den er i afbildning.

7. Montering

  1. Få et 3D-printet kammer lavet af Visijet M3 Crystal harpiks (skabeloner tilgængelige på idisco.info hjemmeside).
  2. Fastgør kammeret til et mikroskop dias ved hjælp af en epoxy.
  3. Placer prøven i det firkantede rum midt i kammeret.
  4. Fyld kammeret helt med DBE.
  5. Placer en 0,17 mm tyk coverslip over kammeret og tryk, indtil coverlip har fuld kontakt med kammeret vægge.
  6. Forsegl kanterne af coverlip til kammeret ved hjælp af epoxy.
  7. Drej kammeret, så luftbobler kan slippe ud af påfyldningsindløbet.
  8. Fyld kammeret med yderligere DBE.
  9. Forsegl påfyldningsindtaget med epoxy og lad det hærde.
    BEMÆRK: Overskydende DBE vil løbe ud under montering.

8. Billedbehandling

  1. Brug et konfokalt mikroskopsystem til at udføre z-scanning ved 4x forstørrelse (se den vedhæftede 3D-video).
  2. Der opnås fluorescerende excitation af prøven ved hjælp af et lasersæt, der udsendes ved en bølgelængde svarende til den bølgelængde, der er specificeret i det sekundære antistof. TH excitation blev opnået ved hjælp af en HeNe laser indstillet til at udsende på 632 nm.
  3. Indstil detektoren til en bølgelængde tæt på laseremissionen. For den nuværende protokol blev detektoren for TH indstillet til 650 nm.
  4. Hæv forstærkningen af detektoren, indtil der er et synligt signal. 650LP-forstærkningen for billeder blev indstillet til 7,50 B.
  5. Brug scanningsindstillingen i konfokal billedbehandlingssoftware til at flytte mikroskopstadiet, indtil prøven bringes i fokus.
  6. Naviger rundt i vævet i alle sletter og få enten enkelt billeder eller z-stack billeder ved hjælp af confocal billedbehandling software.
  7. Når billeddannelsen er afsluttet, skal prøven fjernes fra kammeret. Placer den tilbage i et rør helt fyldt med DBE og opbevares på RT på et mørkt sted, helst dækket af aluminiumsfolie.
    BEMÆRK: Prøver kan monteres igen og afbildes, så længe lysstofsignalet stadig er stærkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fuld rydning af store dele af både F344/N og HIV-1 rottehjernevæv blev opnået ved hjælp af denne modificerede hydrofobe vævsclearingprotokol. Figur 1 viser et typisk konfokalt billede for TH i substantia nigra-regionen. Figur 1A repræsenterer tæt, positiv farvning. Tætte områder som disse kan analyseres ud ved at fokusere gennem "Z" plan for at bekræfte positiv farvning og korrekt celle morfologi. Figur 1B repræsenterer sparsom positiv farvning, som kan identificeres ved TH neuronernes særskilte morfologi. Figur 1C repræsenterer væv, der ikke er positivt farvet, men stadig er mørkt til lyseblåt på grund af baggrundssignal. Områder af billedet, der vises som helt sort, indikerer fravær af væv i dette område. Helt sorte områder i billedet kan skyldes at være på kanten af prøven, et hul, der er i prøven, eller væv, der er ude af fokus.

Figur 2A viser typisk morfologi af en TH positiv neuron ved 20x forstørrelse. Korrekt farvede og fokuserede konfokale billeder vil ideelt set vise lys og sprød fluorescens mod en mørk baggrund. En TH positiv neuron har en stor soma (celle krop) og flere forgrening processer16. Figur 2B viser Iba1 farvede mikroglia, som har små cellelegemer og kortere udvidelsesprocesser17. Bekræftelse af korrekt farvning og forventet cellemorfologi er det første trin i billeddannelsen.

Figur 3 sammenligner et ideelt billede (Figur 3A) med tre uønskede billeder (Figur 3B-D). Figur 3A viser positiv, lys farvning mod en klar, mørk baggrund. Positiv farvning kan let skelnes fra baggrunden. Figur 3B er et eksempel på et forkert fokuseret billede med for meget fluorescerende gevinst. Figur 3C viser et falsk positivt signal. Lyse pletter, der ikke er i fokus med resten af vævet, er artefakter og bør ikke betragtes som et positivt signal. Figur 3D er et eksempel på brug af et blokerende serum, der ikke svarer til det sekundære antistof, som foreslået i den oprindelige iDISCO-protokol4. I dette billede producerede brugen af æselserum til et sekundært antistof lavet i ged et billede med høj baggrundsbegæring, som skjuler evnen til korrekt at identificere positiv farvning.

Figur 4A viser positiv CTB farvning i rottehjernen. De lange, tynde fibre er afferente fremskrivninger langs dopaminergiske vej. Figur 4B og figur 4C viser kolokalisering af TH og CTB. I figur 4Bkan injektionen ses i kernen accumbens-området, der fremstår som en tæt fluorescerende grøn cirkel. Figur 4C viser kolokalisering af TH og CTB i substantia nigra-området.

Figure 1
Figur 1: Konfokalt billede af en hydrofobisk ryddet vævsprøve med markører, 4x forstørrelse. (A)Tæt farvning af TH i det substantia nigra-område. (B) Sparsomme TH neuroner støder op til substantia nigra. (C)Væv mangler positive TH neuroner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Typisk morfologi af fluorescerende mærket TH positive neuroner (20x forstørrelse) og Iba1 positive microglia (10x forstørrelse). (a)To repræsentative TH positive neuroner. (B)Iba1 positive mikroglia. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Ideelle og dårlige konfokale billeder af hydrofobisk ryddet væv, 4x forstørrelse. (A) Tæt TH farvning i substantia nigra område, korrekt i fokus med en passende fluorescens gevinst. (B) Et forkert fokuseret og alt for udsat billede. (C)Falsk positiv farvning. (D) Farvning med høj baggrund som følge af, at den uændrede iDISCO-protokol følges. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Koleratoksin B mærkning langs dopaminergiske vej, 4x forstørrelse. (A)Confocal billede af positiv CTB farvning. (B) Overlappende billede af TH- og CTB- og kerneakumbensindsprøjtningsstedet. (C) Colocalization af TH og CTB i det substantia nigra område. Klik her for at se en større version af dette tal.

Film 1: 3D-film af z-scanning af prøven ved 4x forstørrelse. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vævsrydning tilbyder en løsning på begrænsningerne i den traditionelle IHC-protokol. En prøve, der er gennemsigtig minimerer spredning og absorption af lys, som giver cellulært niveau optisk adgang til intakt væv18,19. Vævsrydningsteknikker gør et væv gennemsigtigt gennem aflipidation, affarvning og afkalkning ved administration af opløsningsmidler. Når vævsprøvens brydningsindeks svarer til det brydningsindeks for det valgte billedmedium, vises prøven helt gennemsigtig og kan afbildes korrekt3. Den nuværende hydrofobe protokol fjerner vand fra vævet i de indledende dehydreringstrin, hvilket reducerer lysspredningen. Væv er gennemtrængelig under forbehandling at tillade dyb antistof penetration. Væv, der har gennemgået protokollen, kan håndteres let og kan afbildes flere gange. Hvis de opbevares korrekt, kan væv stadig give billeder i op til et år efter den første behandling.

I denne protokol anvender vi en hydrofob vævsclearingteknik på F344/N og HIV-1 Tg rottehjernevævsprøver til pletten for TH, Iba1 og CTB. Efter rydning blev vævsprøverne afbildet ved hjælp af et konfokalt mikroskop. Den nuværende protokol har flere fordele i forhold til andre hydrofobe protokol, ligesom iDISCO4. For det første blev den oprindelige iDISCO-protokol valideret til brug i musevæv, mens den nuværende protokol er levedygtig i rottehjernevæv. For det andet gør den justerede inkubationstid på hvert trin det muligt at bruge teknikken til større vævssektioner. For det tredje giver det tilsvarende serum under antistofinkubation (i modsætning til brug af et generelt serum) klarere billeder til analyse.

Mens den nuværende protokol let kan tilpasses behovene i de enkelte forskningsspørgsmål, er der flere vigtige overvejelser. Protokollen tager mindst 26 dage i træk fra start til slut. Prøven må ikke efterlades i en opløsning længere end angivet ovenfor. Prøven kan dog opbevares i DBE i slutningen af protokollen i mindst 6 måneder sikkert indtil billedbehandling, selv om det rådes til at billedet så hurtigt som muligt. Bestil et 3D-printet kammer, der passer til prøven tæt mellem mikroskopdiaset og coverlip. Alle lagerløsninger, bortset fra løsning 1, blev blandet dag-til-et beløb, der var passende til den pågældende dags brug. Prøven skal flyttes til et nyt rør, hver gang der indføres en ny opløsning for at forhindre krydskontaminering. Hvis mikrobiel vækst giver anledning til bekymring, kan natriumanzid tilsættes til løsning 2, opløsning 3, opløsning 4, den primære antistofopløsning og den sekundære antistofopløsning i en koncentration på 0,02% i totalopløsning.

Samlet set er den nuværende teknik en ekstremt alsidig, nem at implementere og billig procedure, der er kompatibel med mange antistoffer. Med denne protokol, der er valideret til at arbejde i både F344/N kontrol og HIV-1 Tg rotter, mange nye undersøgende forskningsspørgsmål kan besvares.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen af forfatterne har interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 &af T32 Training Grant 5T32GM081740

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 Invitrogen C34775
DBE Sigma-Aldrich 108014-1KG
DCM Sigma-Aldrich 270997-100mL
DMSO Sigma-Aldrich 472301-1L
Glycine Fisher Chemical G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 Invitrogen A32733
Goat serum Sigma Life Science G9023-10mL
Heparin Acros Organics 41121-0010
Iba1 primary antibody FUJIFILM Wako 019-19741
Kwik-sil epoxy VWR 70730-062
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1l-R
PBS Fisher Bioreagents BP2944-100
Perfusion machine VWR 70730-062 mini pump variable flow
PFA Sigma-Aldrich 158127-3KG
TH primary antibody Millipore Sigma AB152
TritonX-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Tween-20 Fisher Bioreagents BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).
  4. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  5. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  6. Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
  7. Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
  8. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
  9. Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
  10. Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).
  11. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152 (2018).
  12. Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
  13. Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
  14. Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
  15. Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
  16. Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
  17. Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  18. Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).

Tags

Neurovidenskab Problem 166 vævsrydning immunhistokemi iDISCO hjerne rotte konfokal
En hydrofobisk vævsclearingmetode til rottehjernevæv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A.… More

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A. R., Harrod, S. B., Mactutus, C. F., Booze, R. M. A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (166), e61821, doi:10.3791/61821 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter