Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/61821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

Hier presenteren we een hydrofobe weefselontruimingsmethode die het mogelijk maakt om doelmoleculen te bekijken als onderdeel van intacte hersenstructuren. Deze techniek is nu gevalideerd voor F344/N-bestrijding en HIV-1 transgene ratten van beide geslachten.

Abstract

Hydrofobe weefselontruimingsmethoden zijn eenvoudig instelbare, snelle en goedkope procedures die het mogelijk maken om een molecuul te bestuderen dat van belang is in ongewijzigde weefselmonsters. Traditionele immunolabelingprocedures vereisen het snijden van het monster in dunne secties, wat het vermogen om intacte structuren te labelen en te onderzoeken beperkt. Als hersenweefsel echter intact kan blijven tijdens de verwerking, kunnen structuren en circuits intact blijven voor de analyse. Eerder vastgestelde clearingmethoden nemen veel tijd in om het weefsel volledig te zuiveren en de agressieve chemicaliën kunnen vaak gevoelige antilichamen beschadigen. De iDISCO-methode zuivert snel en volledig weefsel, is compatibel met veel antilichamen en vereist geen speciale laboratoriumapparatuur. Deze techniek werd aanvankelijk gevalideerd voor het gebruik in muizenweefsel, maar het huidige protocol past deze methode aan beeldhelften van controle en transgene rattenhersenen aan. Daarnaast maakt het huidige protocol ook verschillende aanpassingen aan het reeds bestaande protocol om duidelijkere beelden te bieden met minder achtergrondkleuring. Antilichamen voor Iba-1 en tyrosinehydroxylase werden gevalideerd bij de HIV-1 transgene rat en bij F344/N-controleratten met behulp van de huidige hydrofobe weefselopruimingsmethode. De hersenen zijn een verweven netwerk, waar structuren vaker samenwerken dan afzonderlijk van elkaar. Het analyseren van de hersenen als een heel systeem in tegenstelling tot een combinatie van individuele stukken is het grootste voordeel van deze hele hersenontruimingsmethode.

Introduction

Verschillende weefselophelderingstechnieken zijn gevalideerd voor gebruik in de hersenen: hydrogel, hydrofiele en hydrofobe. Deze technieken zijn erop gericht om een weefsel transparant te maken door delipidatie, ontkleuring en ontkalking via de toediening van oplosmiddelen. Zodra de brekingsindex van het weefselmonster overeenkomt met de brekingsindex van het gekozen beeldvormingsmedium, kan een duidelijk beeld van het monster worden verkregen. Hydrogel gebaseerde technieken, zoals CLARITY, beveiligen biomoleculen in het weefsel door ze te koppelen aan hydrogels op acrylbasis, die structurele schade en verlies van eiwitten voorkomen1. Hydrogeltechnieken maken echter gebruik van agressieve chemicaliën dan het potentieel hebben om meer fragiele weefsels te beschadigen, en dichtere weefselmonsters zijn mogelijk niet compatibel met het hydrogelprotocol. Bepaalde hydrogeltechnieken kunnen dure apparatuur vereisen of leiden tot weefselexpansie. Hydrofiele technieken, zoals CUBIC, behouden de 3D-structuur door de vorming van waterstofbindingen in het weefsel2. Weefselexpansie kan ook optreden in een bepaald hydrofiel protocol. Het clearingvermogen van hydrofiele technieken komt vaak niet overeen met het vermogen dat hydrofobe technieken hebben, wat belangrijk is voor dichtere en dikkere weefsels3.

Hydrofobe technieken zijn meestal snel, vereisen geen speciale apparatuur en produceren een monster dat gemakkelijk te hanteren en op te slaan is. iDISCO is een hydrofobe techniek die de krimp elimineert die kan optreden in andere hydrofobe protocollen. Oorspronkelijk werd de iDISCO weefselopruimingstechniek beschreven door Renier et al.4 voor de embryo's en dichte, volwassen organen van muizen. Deze techniek verwijdert water uit het weefsel in de eerste uitdrogingsstap, waardoor de lichtverstrooiing wordt verminderd. Weefsel wordt gepermeabiliseerd tijdens de voorbehandeling om diepe antilichaampenetratie mogelijk te maken. Alexa Fluor kleurstoffen in het ver-rode spectrum worden gebruikt voor immunolabeling om autofluorescentie van het weefsel bij lagere golflengten te voorkomen5. Weefsel dat hydrofobe clearingprotocollen heeft ondergaan, kan gemakkelijk worden behandeld en kan meerdere keren worden afgebeeld vanwege de levensduur van de Alexa Fluor-kleurstoffen. Indien goed opgeslagen, kunnen weefsels beelden leveren gedurende maanden tot een jaar na de eerste verwerking.

In dit protocol werden tyrosine hydroxylase (TH) antilichamen, Iba1 antilichaam en Cholera Toxin Subunit B (CTB) gebruikt op zowel mannelijke als vrouwelijke controle en HIV-1 transgene (Tg) rattenhersenen. De HIV-1 Tg-rat bezit zeven van de negen genen waaruit het hiv-1 virale genoom bestaat, wat leidt tot een niet-infectieus model van langdurige hiv-1-eiwitblootstelling6,7,8. Dopaminerge veranderingen zijn eerder aangetoond bij de HIV-1 Tg-rat en HIV-1 zelf is een ontstekingsziekte, dus de antilichaamkeuze was relevant voor het experimentele ontwerp9,10,11,12. CTB is een tracer die zich via gangliosidebinding aan neuronen hecht en kan worden gebruikt om afferente projecties in de hersenen te traceren. CTB is eerder gebruikt voor het bestuderen van projecties van de nucleus accumbens naar het substantia nigra-gebied , twee gebieden van de hersenen die sterk betrokken zijn bij dopaminerge routes13,14,15.

In dit protocol zal TH dienen als een marker voor dopamineproductie en Iba1 zal geactiveerde microglia markeren. Het gebruikte TH-antilichaam labelt selectief een enkele band van ongeveer 62 kDa die overeenkomt met tyrosinehydroxylase. Het Iba1-antilichaam komt overeen met de Iba1 carboxy-terminale sequentie. Beide antilichamen werden bij konijnen gekweekt en waren polyklonaal. CTB zal worden gebruikt voor retrograde tracering van neuronen van het nucleus accumbens-gebied naar het substantia nigra-gebied. Het huidige protocol biedt ook een richtlijn voor aanpassing van het oorspronkelijke iDISCO-protocol op twee verschillende manieren: 1) algehele vermindering van de achtergrondkleuring door het veranderen van de serumreagentia in de blokkeringsstappen, en 2) het schalen van de incubatietijd om geschikt te zijn voor grotere weefselmonsters. Over het algemeen levert het huidige protocol voortdurend bewijs dat hydrofobe clearingtechnieken haalbaar zijn in hersenweefsels van de rat, geen waarneembare schadelijke interacties hebben met HIV-1 virale eiwitten en compatibel zijn met TH-antilichamen, Iba1-antilichamen en CTB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Universiteit van South Carolina.

1. Bereiding van voorraadoplossing

  1. Oplossing 1 (1 L): Voeg aan 900 ml gedeïdentiseerde H2O 100 ml 10x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 2 ml Triton X-100 toe.
  2. Oplossing 2 (1 L): Voeg aan 900 ml gedeïoniseerde H2O 100 ml 10x PBS, 2 ml Tween-20 en 1 ml heparinevoorraadoplossing van 10 mg/ml toe.
  3. Oplossing 3 (500 ml): Voeg aan 400 ml oplossing 1 11,5 g g glycine en 100 ml dimethylsulfoxide (DMSO) toe.
  4. Oplossing 4 (50 ml): Voeg aan 42 ml oplossing 1 3 ml overeenkomstig serum en 5 ml DMSO toe.
  5. Primaire antilichaamoplossing (50 ml): Voeg aan 46 ml oplossing 2 2,5 ml DMSO en 1,5 ml overeenkomstig serum toe.
  6. Secundaire antilichaamoplossing (50 ml): Voeg aan 48,5 ml oplossing 2 1,5 ml overeenkomstig serum toe.
    OPMERKING: Gebruik voor oplossing 4, primaire oplossing en secundaire oplossing een serum dat overeenkomt met het secundaire antilichaam (bijv. geit, paard, rund).

2. Monstervoorbereiding

OPMERKING: Voer de stappen 2.1 tot en met 2.7 uit in een zuurkast om de blootstelling aan PFA te beperken.

  1. Verdoof de jonge (3-6 weken) rat diep met behulp van sevofluraan; ga verder met 2.2 wanneer de rat niet reageert en niet reageert op teen- en staartknijpen.
  2. Leg de rat in een liggende positie en maak een incisie door de buikwand met behulp van een irisschaar.
  3. Snijd door de onderkant van de ribbenkast naar het sleutelbeen aan beide zijden van de ribbenkast met behulp van een Mayo-schaar.
  4. Breng het borstbeen en de ribben weg van het hart en de longen met een hemostase.
  5. Doorboor de linkerventrikel met een 23 G naald bevestigd aan een perfusiepomp en snijd het rechter atrium door met een Iris schaar.
  6. Voer transcardiale perfusie uit met ongeveer 75 ml 100 mM (1x) PBS.
  7. Ga door met transcardiale perfusie met ongeveer 100 ml 4% paraformaldehyde (PFA) gebufferd in 1x PBS.
  8. Verwijder de hersenen van de schedel met een tang.
  9. Plaats de hersenen in sagittale positie en snijd in 4 gelijke secties (ongeveer 3 mm breed) met behulp van een scheermesje en een rattenhersenmatrix.
  10. Bevestig elke sectie in 4% PFA in 1x PBS in een verzegelde, 5 ml plastic buis 's nachts bij 4 °C op een shaker.
  11. Blijf 1 uur in 4% PFA in 1x PBS bij kamertemperatuur (RT) op een shaker fixeren.
  12. Was elke sectie met 1x PBS bij RT gedurende 30 min, 3 keer.

3. Uitdroging en depigmentatie

  1. Incubeer het monster in een 20% methanol/80% gedeïoniseerde wateroplossing gedurende 1 uur bij RT.
  2. Incubeer het monster in een 40% methanol/60% gedeïoniseerde wateroplossing gedurende 1 uur bij RT.
  3. Incubeer het monster in een 60% methanol/40% gedeïoniseerde wateroplossing gedurende 1 uur bij RT.
  4. Incubeer het monster in een 80% methanol/20% gedeïoniseerde wateroplossing gedurende 1 uur bij RT.
  5. Incubeer het monster in 100% methanol gedurende 1 uur bij RT. Herhaal dit met meer dan 100% methanol en incubatie gedurende 1 uur bij RT.
  6. Koel het monster ongeveer 10 minuten in 100% methanol bij 4°C.
  7. Bereid een 66% dichloormethaan (DCM)/33% methanoloplossing.
  8. Incubeer het monster 's nachts in de DCM/methanoloplossing bij RT, met schudden.
  9. Wassen met methanol bij RT gedurende 30 min, 2 keer.
  10. Koel het monster ongeveer 10 minuten in 100% methanol bij 4°C.
  11. Bleekmiddel in gekoeld, vers bereid 5% waterstofperoxide in methanol 's nachts bij 4° C.
  12. Incubeer het monster in een 80% methanol/20% gedeïoniseerde wateroplossing gedurende 1 uur bij RT.
  13. Incubeer het monster in een 60% methanol/40% gedeïoniseerde wateroplossing gedurende 1 uur bij RT.
  14. Incubeer het monster in een 40% methanol/60% gedeïoniseerde wateroplossing gedurende 1 uur bij RT.
  15. Incubeer het monster in een 20% methanol/80% gedeïoniseerde wateroplossing gedurende 1 uur bij RT.
  16. Incubeer het monster in 1x PBS gedurende 1 uur bij RT.
  17. Was in oplossing 1 gedurende 1 uur bij RT, 2 keer.

4. Cholera Toxin Subunit B labeling

  1. Steek de naaldpunt van 1 ml spuit in de nucleus accumbens-plaats.
  2. Injecteer langzaam 2,5 μL van 1% biotine-CTB over 20 s.
  3. Laat de naaldtip 1 minuut op zijn plaats zitten en verwijder langzaam meer dan 10 s om lekkage te voorkomen.

5. Antilichaamtoepassing

  1. Incubeer het monster in oplossing 3 gedurende 2 dagen bij 37 °C in een waterbad.
  2. Incubeer het monster in oplossing 4 gedurende 2 dagen bij 37 °C in een waterbad.
  3. Incubeer met primair antilichaam gedurende 7 dagen bij 37 °C in een waterbad.
  4. Was in oplossing 2 gedurende 5 keer, incubatie 1 uur per wasbeurt. 's Nachts opslaan in oplossing 2 bij RT.
  5. Incubeer met secundair antilichaam gedurende 7 dagen bij 37 °C in het waterbad.
  6. Was in oplossing 2 gedurende 5 keer, incubatie 1 uur per wasbeurt; opslaan in Oplossing 2 bij RT 's nachts.
    OPMERKING: Alle stappen vanaf 5.6, inclusief de uiteindelijke opslag, moeten bij weinig licht plaatsvinden. De monsterbuizen kunnen worden afgeschermd met aluminiumfolie. De concentraties die werden gebruikt voor de antilichamen in dit protocol waren: TH om 1:100, Iba1 om 1:200 en het secundaire antilichaam om 1:100. Voeg extra oplossing 2 toe aan stap 5.1-5.6 om ervoor te zorgen dat de buizen volledig gevuld zijn.

6. Weefselontruiming

  1. Incubeer het monster in een 20% methanol/80% gedeïoniseerde wateroplossing gedurende 1 uur bij RT.
  2. Incubeer het monster in een 40% methanol/60% gedeïoniseerde wateroplossing gedurende 1 uur bij RT.
  3. Incubeer het monster in een 60% methanol/40% gedeïoniseerde wateroplossing gedurende 1 uur bij RT.
  4. Incubeer het monster in een 80% methanol/20% gedeïoniseerde wateroplossing gedurende 1 uur bij RT.
  5. Incubeer het monster in 100% methanol gedurende 1 uur bij RT.
  6. Incubeer 's nachts in verse 100% methanol bij RT.
  7. Incubeer in 66% DCM/33% methanol gedurende 3 uur, met schudden, bij kamertemperatuur.
  8. Incubeer in dibenzyl ether (DBE) zonder te schudden. Laat het monster in DBE tot het helder is en bewaar het in DBE tot de beeldvorming.

7. Montage

  1. Verkrijg een 3D-geprinte kamer gemaakt van Visijet M3 Crystal resin (sjablonen beschikbaar op de website van idisco.info).
  2. Bevestig de kamer aan een microscoopschuif met behulp van een epoxy.
  3. Plaats het monster in de vierkante ruimte in het midden van de kamer.
  4. Vul de kamer volledig met DBE.
  5. Plaats een 0,17 mm dikke afdeklip over de kamer en oefen druk uit totdat de afdeklip volledig contact heeft met de kamerwanden.
  6. Sluit de randen van de afdeklip af aan de kamer met behulp van de epoxy.
  7. Draai de kamer om luchtbellen uit de vulinlaat te laten ontsnappen.
  8. Vul de kamer met extra DBE.
  9. Sluit de vulinlaat af met epoxy en laat uitharden.
    OPMERKING: Overtollige DBE zal tijdens de montage uitlopen.

8. Beeldvorming

  1. Gebruik een confocale microscoop om een z-scan uit te voeren bij 4x vergroting (zie de bijgevoegde 3D-video).
  2. Bereik fluorescerende excitatie van het monster met behulp van een laserset om uit te zenden op een golflengte die vergelijkbaar is met de golflengte die is gespecificeerd door het secundaire antilichaam. TH excitatie werd bereikt met behulp van een HeNe laser set om uit te zenden op 632 nm.
  3. Stel de detector in op een golflengte dicht bij de laseremissie. Voor dit protocol werd de detector voor TH ingesteld op 650 nm.
  4. Verhoog de versterking van de detector totdat er een zichtbaar signaal is. De 650LP-versterking voor afbeeldingen was ingesteld op 7,50 B.
  5. Verplaats de microscooptrap met behulp van de scanoptie in de confocale beeldvormingssoftware totdat het monster in beeld is gebracht.
  6. Navigeer in alle vlaktes door het weefsel en verkrijg afzonderlijke afbeeldingen of z-stack-afbeeldingen met behulp van de confocale beeldvormingssoftware.
  7. Zodra de beeldvorming is voltooid, verwijdert u het monster uit de kamer. Plaats het terug in een buis volledig gevuld met DBE en bewaar bij RT op een donkere plaats, bij voorkeur bedekt met aluminiumfolie.
    OPMERKING: Monsters kunnen opnieuw worden gemonteerd en afgebeeld zolang het florescentiesignaal nog sterk is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Volledige clearing van grote delen van zowel F344/N als HIV-1 rat hersenweefsel werd bereikt met behulp van dit gemodificeerde hydrofobe weefsel clearing protocol. Figuur 1 toont een typische confocale afbeelding voor TH in het substantia nigra-gebied. Figuur 1A staat voor dichte, positieve kleuring. Dichte gebieden zoals deze kunnen worden uitgeleed door zich door het "Z"-vlak te concentreren om positieve kleuring en de juiste celmorfologie te bevestigen. Figuur 1B vertegenwoordigt schaarse positieve kleuring, die kan worden geïdentificeerd door de duidelijke morfologie van de TH-neuronen. Figuur 1C vertegenwoordigt weefsel dat niet positief gekleurd is, maar nog steeds donker tot lichtblauw is als gevolg van achtergrondsignaal. Gebieden van de afbeelding die als volledig zwart lijken, duiden op een afwezigheid van weefsel in dat gebied. Volledig zwarte gebieden in de afbeelding kunnen te wijten zijn aan het feit dat ze zich aan de rand van het monster bevinden, een gat dat zich in het monster bevindt of weefsel dat onscherpte is.

Figuur 2A toont typische morfologie van een TH positief neuron bij 20x vergroting. Goed bevlekte en gerichte confocale afbeeldingen tonen idealiter heldere en heldere fluorescentie tegen een donkere achtergrond. Een TH positief neuron heeft een grote soma (cellichaam) en verschillende vertakkingsprocessen16. Figuur 2B toont Iba1-gebeitst microglia, die kleine cellichamen en kortere uitbreidingsprocessen hebben17. Bevestiging van de juiste kleuring en verwachte celmorfologie is de eerste stap in beeldvorming.

Figuur 3 vergelijkt een ideaalbeeld (figuur 3A) met drie ongewenste beelden (figuur 3B-D). Figuur 3A toont positieve, heldere vlekken tegen een heldere, donkere achtergrond. Positieve kleuring is gemakkelijk te onderscheiden van de achtergrond. Figuur 3B is een voorbeeld van een onjuist gericht beeld met te veel fluorescerende versterking. Figuur 3C geeft een vals positief signaal weer. Heldere vlekken die niet scherp zijn op de rest van het weefsel zijn artefacten en moeten niet worden beschouwd als een positief signaal. Figuur 3D is een voorbeeld van het gebruik van een blokkerend serum dat niet overeenkomt met het secundaire antilichaam, zoals voorgesteld in het oorspronkelijke iDISCO-protocol4. In deze afbeelding produceerde het gebruik van ezelsserum voor een secundair antilichaam gemaakt bij geit een afbeelding met hoge achtergrondkleuring, wat het vermogen om positieve vlekken goed te identificeren verduistert.

Figuur 4A toont positieve CTB-kleuring in het rattenbrein. De lange, dunne vezels zijn afferente projecties langs de dopaminerge route. Figuur 4B en figuur 4C tonen colocalisatie van TH en CTB. In figuur 4Bis de injectie te zien in het nucleus accumbens-gebied, dat verschijnt als een dicht fluorescerende groene cirkel. Figuur 4C toont colocalisatie van TH en CTB in het substantia nigra gebied.

Figure 1
Figuur 1: Confocale afbeelding van een hydrofoob gewist weefselmonster met markers, 4x vergroting. (A) Dichte TH-kleuring in het substantia nigra-gebied. (B) Schaarse TH neuronen grenzend aan de substantia nigra. (C) Weefsel zonder positieve TH neuronen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Typische morfologie van fluorescerend gelabelde TH-positieve neuronen (20x vergroting) en Iba1-positieve microglia (10x vergroting). (A) Twee representatieve TH positieve neuronen. (B) Iba1 positieve microglia. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Ideale en slechte confocale beelden van hydrofoob ontruimd weefsel, 4x vergroting. (A) Dichte TH-kleuring in het substantia nigra-gebied, goed scherpstellend met een geschikte fluorescentiewinst. (B) Een onjuist gefocust en overdreven belicht beeld. (C) Vals-positieve kleuring. (D) Hoge achtergrondkleuring als gevolg van het volgen van het ongewijzigde iDISCO-protocol. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Cholera Toxine B labeling langs de dopaminerge route, 4x vergroting. (A) Confocale afbeelding van positieve CTB kleuring. (B) Overlapt beeld van TH en CTB en nucleus accumbens injectieplaats. (C) Colocalisatie van TH en CTB in het substantia nigra gebied. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Film 1: 3D film van z-scan van het monster bij 4x vergroting. Klik hier om deze video te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Weefselontruiming biedt een oplossing voor de beperkingen van het traditionele IHC-protocol. Een monster dat transparant is, minimaliseert de verstrooiing en absorptie van licht, wat optische toegang op cellulair niveau biedt tot intacte weefsels18,19. Weefselontruimingstechnieken maken een weefsel transparant door delipidatie, ontkleuring en ontkalking met de toediening van oplosmiddelen. Zodra de brekingsindex van het weefselmonster overeenkomt met de brekingsindex van het gekozen beeldvormingsmedium, zal het monster volledig transparant lijken en goed worden afgebeeld3. Het huidige hydrofobe protocol verwijdert water uit het weefsel in de eerste uitdrogingsstappen, waardoor lichtverstrooiing wordt verminderd. Weefsel wordt gepermeabiliseerd tijdens de voorbehandeling om diepe antilichaampenetratie mogelijk te maken. Weefsel dat het protocol heeft ondergaan, kan gemakkelijk worden behandeld en kan meerdere keren worden afgebeeld. Indien goed opgeslagen, kunnen weefsels nog steeds beelden leveren tot een jaar na de eerste verwerking.

In dit protocol passen we een hydrofobe weefselopruimingstechniek toe op F344/N- en HIV-1 Tg-hersenweefselmonsters van ratten om vlekken te maken voor TH, Iba1 en CTB. Na het opruimen werden de weefselmonsters in beeld brengen met behulp van een confocale microscoop. Het huidige protocol heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere hydrofobe protocollen, zoals iDISCO4. Ten eerste werd het oorspronkelijke iDISCO-protocol gevalideerd voor gebruik in muizenweefsel, terwijl het huidige protocol levensvatbaar is in hersenweefsel van ratten. Ten tweede maakt de aangepaste incubatietijd bij elke stap het mogelijk om de techniek te gebruiken voor grotere weefselsecties. Ten derde biedt het opnemen van het overeenkomstige serum tijdens de incubatie van antilichamen (in tegenstelling tot het gebruik van een algemeen serum) duidelijkere beelden voor analyse.

Hoewel het huidige protocol gemakkelijk kan worden aangepast aan de behoeften van individuele onderzoeksvragen, zijn er verschillende belangrijke overwegingen. Het protocol duurt minimaal 26 opeenvolgende dagen van begin tot eind. Laat het monster niet langer in een oplossing dan hierboven vermeld. Het monster kan echter aan het einde van het protocol ten minste 6 maanden veilig in DBE worden bewaard tot de beeldvorming, hoewel het wordt geadviseerd om zo snel mogelijk een beeld te beeldvorming. Bestel een 3D-geprinte kamer die het monster goed tussen de microscoopschuif en de hoeslip past. Alle voorraadoplossingen, afgezien van oplossing 1, werden dag-van gemengd in een hoeveelheid die geschikt was voor het gebruik van die dag. Het monster moet naar een nieuwe buis worden verplaatst wanneer een nieuwe oplossing wordt geïntroduceerd om kruisbesmetting te voorkomen. Als microbiële groei van belang is, kan natrium azide worden toegevoegd aan oplossing 2, oplossing 3, oplossing 4, de primaire antilichaamoplossing en de secundaire antilichaamoplossing bij een concentratie van 0,02% in de totale oplossing.

Over het algemeen is de huidige techniek een uiterst veelzijdige, eenvoudig te implementeren en goedkope procedure die compatibel is met veel antilichamen. Met dit protocol dat gevalideerd is om te werken in zowel F344/N-controle als HIV-1 Tg-ratten, kunnen veel nieuwe onderzoeksvragen worden beantwoord.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te verklaren.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door NIH-subsidies: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & door T32 Training Grant 5T32GM081740

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 Invitrogen C34775
DBE Sigma-Aldrich 108014-1KG
DCM Sigma-Aldrich 270997-100mL
DMSO Sigma-Aldrich 472301-1L
Glycine Fisher Chemical G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 Invitrogen A32733
Goat serum Sigma Life Science G9023-10mL
Heparin Acros Organics 41121-0010
Iba1 primary antibody FUJIFILM Wako 019-19741
Kwik-sil epoxy VWR 70730-062
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1l-R
PBS Fisher Bioreagents BP2944-100
Perfusion machine VWR 70730-062 mini pump variable flow
PFA Sigma-Aldrich 158127-3KG
TH primary antibody Millipore Sigma AB152
TritonX-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Tween-20 Fisher Bioreagents BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).
  4. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  5. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  6. Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
  7. Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
  8. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
  9. Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
  10. Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).
  11. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152 (2018).
  12. Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
  13. Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
  14. Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
  15. Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
  16. Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
  17. Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  18. Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).

Tags

Neurowetenschappen weefselopruiming immunohistochie iDISCO hersenen rat confocale
Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A.… More

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A. R., Harrod, S. B., Mactutus, C. F., Booze, R. M. A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (166), e61821, doi:10.3791/61821 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter