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Neuroscience

Une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes pour le tissu cérébral de rat

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/61821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

Nous présentons ici une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes qui permet de visualiser les molécules cibles dans le cadre de structures cérébrales intactes. Cette technique a maintenant été validée pour les rats transgéniques F344/N et le VIH-1 des deux sexes.

Abstract

Les méthodes de nettoyage des tissus hydrophobes sont des procédures facilement ajustables, rapides et peu coûteuses qui permettent l’étude d’une molécule d’intérêt dans des échantillons de tissus non inaltérables. Les procédures traditionnelles d’immunomarquage nécessitent de couper l’échantillon en sections minces, ce qui limite la capacité d’étiqueter et d’examiner les structures intactes. Cependant, si le tissu cérébral peut rester intact pendant le traitement, les structures et les circuits peuvent rester intacts pour l’analyse. Les méthodes de nettoyage précédemment établies prennent beaucoup de temps pour nettoyer complètement le tissu, et les produits chimiques agressifs peuvent souvent endommager les anticorps sensibles. La méthode iDISCO élimine rapidement et complètement les tissus, est compatible avec de nombreux anticorps et ne nécessite aucun équipement de laboratoire spécial. Cette technique a été initialement validée pour l’utilisation dans les tissus de souris, mais le protocole actuel adapte cette méthode à l’imagerie des hémisphères de contrôle et des cerveaux de rats transgéniques. En plus de cela, le protocole actuel apporte également plusieurs ajustements au protocole préexistant pour fournir des images plus claires avec moins de taches d’arrière-plan. Les anticorps dirigés contre l’Iba-1 et la tyrosine hydroxylase ont été validés chez le rat transgénique VIH-1 et chez les rats témoins F344/N en utilisant la méthode actuelle de nettoyage des tissus hydrophobes. Le cerveau est un réseau entrelacé, où les structures travaillent ensemble plus souvent que séparément les unes des autres. L’analyse du cerveau en tant que système entier par opposition à une combinaison de pièces individuelles est le plus grand avantage de cette méthode d’éclaircissement du cerveau entier.

Introduction

Plusieurs techniques de nettoyage des tissus ont été validées pour une utilisation dans le cerveau : hydrogel, hydrophile et hydrophobe. Ces techniques visent à rendre un tissu transparent par délipidation, décoloration et décalcification via l’administration de solvants. Une fois que l’indice de réfraction de l’échantillon de tissu correspond à l’indice de réfraction du milieu d’imagerie choisi, une image claire de l’échantillon peut être obtenue. Les techniques à base d’hydrogel, telles que CLARITY, sécurisent les biomolécules dans les tissus en les reliant à des hydrogels à base d’acryl, ce qui empêche les dommages structurels et la perte de protéines1. Cependant, les techniques d’hydrogel utilisent des produits chimiques agressifs qui ont le potentiel d’endommager des tissus plus fragiles, et des échantillons de tissus plus denses peuvent ne pas être compatibles avec le protocole d’hydrogel. Certaines techniques d’hydrogel peuvent nécessiter un équipement coûteux ou entraîner une expansion des tissus. Les techniques hydrophiles, comme CUBIC, préservent la structure 3D par la formation de liaisons hydrogène dans le tissu2. L’expansion tissulaire peut également se produire dans certains protocoles hydrophiles. La capacité de nettoyage des techniques hydrophiles ne correspond souvent pas à la capacité des techniques hydrophobes, ce qui est important pour les tissus plus denses et plus épais3.

Les techniques hydrophobes sont généralement rapides, ne nécessitent pas d’équipement spécial et produisent un échantillon facile à manipuler et à stocker. iDISCO est une technique hydrophobe qui élimine le retrait qui peut se produire dans d’autres protocoles hydrophobes. À l’origine, la technique de nettoyage des tissus iDISCO a été décrite par Renier et al.4 pour les embryons et les organes adultes denses de souris. Cette technique élimine l’eau du tissu lors de l’étape initiale de déshydratation, réduisant ainsi la diffusion de la lumière. Le tissu est perméabilisé pendant le prétraitement pour permettre une pénétration profonde des anticorps. Les colorants Alexa Fluor dans le spectre rouge lointain sont utilisés pour l’immunomarquage afin d’éviter l’autofluorescence du tissu à des longueurs d’onde inférieures5. Les tissus qui ont subi des protocoles de nettoyage hydrophobes peuvent être manipulés facilement et peuvent être imagés plusieurs fois en raison de la longévité des colorants Alexa Fluor. S’ils sont correctement stockés, les tissus peuvent fournir des images pendant des mois à un an après le traitement initial.

Dans le présent protocole, l’anticorps tyrosine hydroxylase (TH), l’anticorps Iba1 et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB) ont été utilisés sur les cerveaux de rats témoins masculins et féminins et transgéniques (Tg) du VIH-1. Le rat HIV-1 Tg possède sept des neuf gènes qui composent le génome viral du VIH-1, ce qui conduit à un modèle non infectieux d’exposition à long terme à la protéine VIH-16,7,8. Des altérations dopaminergiques ont déjà été démontrées chez le rat Tg VIH-1, et le VIH-1 lui-même est une maladie inflammatoire, de sorte que le choix de l’anticorps était pertinent pour le plan expérimental9,10,11,12. CTB est un traceur qui se fixe aux neurones via la liaison ganglioside et peut être utilisé pour tracer les projections afférentes dans le cerveau. CTB a déjà été utilisé pour étudier les projections du noyau accumbens à la zone substantia nigra, deux zones du cerveau fortement impliquées dans les voies dopaminergiques13,14,15.

Dans ce protocole, TH servira de marqueur pour la production de dopamine, et Iba1 marquera la microglie activée. L’anticorps TH utilisé marque sélectivement une seule bande à environ 62 kDa qui correspond à la tyrosine hydroxylase. L’anticorps Iba1 correspond à la séquence carboxy-terminale Iba1. Les deux anticorps ont été élevés chez le lapin et étaient polyclonaux. Le CTB sera utilisé pour le traçage rétrograde des neurones de la zone du noyau accumbens à la zone de la substantia nigra. Le protocole actuel offre également une ligne directrice pour l’ajustement du protocole iDISCO original de deux manières distinctes: 1) réduction globale de la coloration de fond en modifiant les réactifs sériques dans les étapes de blocage, et 2) mise à l’échelle du temps d’incubation pour convenir à des échantillons de tissus plus importants. Dans l’ensemble, le présent protocole fournit des preuves continues que les techniques de clairage hydrophobe sont réalisables dans les tissus cérébraux du rat, n’ont aucune interaction néfaste perceptible avec les protéines virales du VIH-1 et sont compatibles avec les anticorps TH, les anticorps Iba1 et le CTB.

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Protocol

Tous les protocoles animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Sud.

1. Préparation de la solution d’élevage

  1. Solution 1 (1 L) : À 900 mL de H2O désionisé, ajouter 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 2 mL de Triton X-100.
  2. Solution 2 (1 L) : À 900 mL de H2O désionisé, ajouter 100 mL de 10x PBS, 2mL de Tween-20 et 1 mL de solution mère d’héparine de 10 mg/mL.
  3. Solution 3 (500 mL) : À 400 mL de la solution 1, ajouter 11,5 g de glycine et 100 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
  4. Solution 4 (50 mL) : À 42 mL de la Solution 1, ajouter 3 mL de sérum correspondant et 5 mL de DMSO.
  5. Solution d’anticorps primaires (50 mL) : À 46 mL de la solution 2, ajouter 2,5 mL de DMSO et 1,5 mL de sérum correspondant.
  6. Solution d’anticorps secondaires (50 mL) : À 48,5 mL de la solution 2, ajouter 1,5 mL de sérum correspondant.
    REMARQUE : Pour la solution 4, la solution primaire et la solution secondaire, utilisez un sérum qui correspond à l’anticorps secondaire (p. ex. chèvre, cheval, bovin).

2. Préparation de l’échantillon

REMARQUE: Effectuer les étapes 2.1 à 2.7 dans une hotte de fumée afin de limiter l’exposition aux PFA.

  1. Anesthésier profondément les jeunes rats (3-6 semaines) à l’aide de sévoflurane; passer à 2.2 lorsque le rat ne réagit pas et ne répond pas au pincement des orteils et de la queue.
  2. Posez le rat en position couchée et faites une incision à travers la paroi abdominale à l’aide d’une paire de ciseaux Iris.
  3. Coupez à travers le fond de la cage thoracique jusqu’à la clavicule des deux côtés de la cage thoracique à l’aide de ciseaux Mayo.
  4. Apposez le sternum et les côtes loin du cœur et des poumons avec un hémostat.
  5. Percer le ventricule gauche avec une aiguille de 23 G attachée à une pompe de perfusion et couper l’oreillette droite avec des ciseaux à iris.
  6. Effectuer une perfusion transcardique avec environ 75 mL de 100 mM (1x) PBS.
  7. Poursuivre la perfusion transcardique avec environ 100 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % tamponné dans 1x PBS.
  8. Retirez le cerveau du crâne à l’aide d’une pince.
  9. Placez le cerveau en position sagittale et coupez-le en 4 sections égales (environ 3 mm de largeur) à l’aide d’une lame de rasoir et d’une matrice cérébrale de rat.
  10. Fixez chaque section dans 4% de PFA dans 1x PBS dans un tube en plastique scellé de 5 ml pendant la nuit à 4 ° C sur un agitateur.
  11. Continuer à fixer 4% PFA dans 1x PBS à température ambiante (RT) sur un agitateur pendant 1 h.
  12. Lavez chaque section avec 1x PBS à RT pendant 30 min, 3 fois.

3. Déshydratation et dépigmentation

  1. Incuber l’échantillon dans une solution à 20 % de méthanol/80 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  2. Incuber l’échantillon dans une solution à 40 % de méthanol/60 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  3. Incuber l’échantillon dans une solution à 60 % de méthanol/40 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  4. Incuber l’échantillon dans une solution à 80 % de méthanol/20 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  5. Incuber l’échantillon dans du méthanol à 100 % pendant 1 h à RT. Répéter avec plus de 100 % de méthanol, en incubant pendant 1 h à RT.
  6. Refroidir l’échantillon dans du méthanol à 100 % à 4°C pendant environ 10 min.
  7. Préparer une solution de dichlorométhane (DCM) à 66 % / méthanol à 33 %.
  8. Incuber l’échantillon pendant la nuit dans la solution de DCM/méthanol à TA, en agitant.
  9. Laver au méthanol à RT pendant 30 min, 2 fois.
  10. Refroidir l’échantillon dans du méthanol à 100 % à 4°C pendant environ 10 min.
  11. Eau de Javel dans du peroxyde d’hydrogène réfrigéré et fraîchement préparé à 5 % dans du méthanol pendant la nuit à 4 ° C.
  12. Incuber l’échantillon dans une solution à 80 % de méthanol/20 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  13. Incuber l’échantillon dans une solution à 60 % de méthanol/40 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  14. Incuber l’échantillon dans une solution à 40 % de méthanol/60 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  15. Incuber l’échantillon dans une solution à 20 % de méthanol/80 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  16. Incuber l’échantillon dans 1x PBS pendant 1 h à RT.
  17. Laver dans la solution 1 pendant 1 h à TA, 2 fois.

4. Étiquetage de la sous-unité B de la toxine cholérique

  1. Insérer l’extrémité de l’aiguille d’une seringue de 1 mL dans le site du noyau accumbens.
  2. Injecter lentement 2,5 μL de 1 % de biotine-CTB sur 20 s.
  3. Laissez la pointe de l’aiguille en place pendant 1 min et retirez-la lentement pendant 10 s pour éviter les fuites.

5. Application d’anticorps

  1. Incuber l’échantillon dans la Solution 3 pendant 2 jours à 37 °C au bain-marie.
  2. Incuber l’échantillon dans la Solution 4 pendant 2 jours à 37 °C au bain-marie.
  3. Incuber avec un anticorps primaire pendant 7 jours à 37 °C au bain-marie.
  4. Laver dans la solution 2 pendant 5 fois, incubation 1 h par lavage. Conserver dans la Solution 2 à RT pendant la nuit.
  5. Incuber avec un anticorps secondaire pendant 7 jours à 37 °C au bain-marie.
  6. Laver dans la solution 2 pendant 5 fois, incubation 1 h par lavage; stocker dans la Solution 2 à RT pendant la nuit.
    REMARQUE: Toutes les étapes à partir de la version 5.6, y compris le stockage final, doivent se produire en basse lumière. Les tubes d’échantillonnage peuvent être protégés avec du papier d’aluminium. Les concentrations utilisées pour les anticorps dans ce protocole étaient: TH à 1:100, Iba1 à 1:200 et l’anticorps secondaire à 1:100. Ajoutez la solution 2 supplémentaire aux étapes 5.1 à 5.6 pour vous assurer que les tubes sont complètement remplis.

6. Nettoyage des tissus

  1. Incuber l’échantillon dans une solution à 20 % de méthanol/80 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  2. Incuber l’échantillon dans une solution à 40 % de méthanol/60 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  3. Incuber l’échantillon dans une solution à 60 % de méthanol/40 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  4. Incuber l’échantillon dans une solution à 80 % de méthanol/20 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.
  5. Incuber l’échantillon dans du méthanol à 100% pendant 1 h à TA.
  6. Incuber dans du méthanol frais 100% pendant la nuit à RT.
  7. Incuber dans 66% de DCM/33% de méthanol pendant 3 h, avec agitation, à température ambiante.
  8. Incuber dans de l’éther dibenzylique (DBE) sans agitation. Laissez l’échantillon dans DBE jusqu’à ce qu’il soit clair et conservez-le dans DBE jusqu’à l’imagerie.

7. Montage

  1. Procurez-vous une chambre imprimée en 3D en résine Visijet M3 Crystal (modèles disponibles sur le site idisco.info).
  2. Fixez la chambre à une lame de microscope à l’aide d’un époxy.
  3. Placez l’échantillon dans l’espace carré au milieu de la chambre.
  4. Remplissez complètement la chambre avec DBE.
  5. Placez un couvercle de 0,17 mm d’épaisseur sur la chambre et appliquez une pression jusqu’à ce que le couvercle ait un contact complet avec les parois de la chambre.
  6. Scellez les bords du couvercle à la chambre à l’aide de l’époxy.
  7. Faites pivoter la chambre pour permettre aux bulles d’air de s’échapper de l’entrée de remplissage.
  8. Remplissez la chambre avec du DBE supplémentaire.
  9. Sceller l’entrée de remplissage avec de l’époxy et laisser durcir.
    REMARQUE: L’excès de DBE se répandra pendant le montage.

8. Imagerie

  1. Utilisez un système de microscope confocal pour effectuer un z-scan à un grossissement 4x (voir la vidéo 3Dci-jointe).
  2. Obtenir une excitation fluorescente de l’échantillon à l’aide d’un laser réglé pour émettre à une longueur d’onde similaire à la longueur d’onde spécifiée par l’anticorps secondaire. L’excitation TH a été réalisée à l’aide d’un laser HeNe réglé pour émettre à 632 nm.
  3. Réglez le détecteur sur une longueur d’onde proche de l’émission laser. Pour le protocole actuel, le détecteur pour TH a été réglé à 650 nm.
  4. Augmentez le gain du détecteur jusqu’à ce qu’il y ait un signal visible. Le gain de 650LP pour les images a été réglé sur 7,50 B.
  5. À l’aide de l’option Scan du logiciel d’imagerie confocale, déplacez l’étage du microscope jusqu’à ce que l’échantillon soit mis au point.
  6. Naviguez autour du tissu dans toutes les plaines et obtenez des images uniques ou des images z-stack à l’aide du logiciel d’imagerie confocale.
  7. Une fois l’imagerie terminée, retirez l’échantillon de la chambre. Replacez-le dans un tube complètement rempli de DBE et conservez-le à RT dans un endroit sombre, de préférence recouvert de papier d’aluminium.
    REMARQUE: Les échantillons peuvent être remontés et imagés tant que le signal de floraison est encore fort.

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Representative Results

L’élimination complète de grandes sections de tissu cérébral de rat F344/N et VIH-1 a été réalisée à l’aide de ce protocole modifié de nettoyage des tissus hydrophobes. La figure 1 montre une image confocale typique de TH dans la région de substantia nigra. La figure 1A représente une coloration dense et positive. Les zones denses comme celles-ci peuvent être analysées en se concentrant à travers le plan « Z » pour confirmer une coloration positive et une morphologie cellulaire appropriée. La figure 1B représente une coloration positive clairsemée, qui peut être identifiée par la morphologie distincte des neurones TH. La figure 1C représente un tissu qui n’est pas coloré positivement, mais qui est toujours sombre à bleu clair en raison du signal de fond. Les zones de l’image qui apparaissent comme complètement noires indiquent une absence de tissu dans cette zone. Les zones complètement noires de l’image peuvent être dues au fait qu’elles se trouvent sur le bord de l’échantillon, à un trou dans l’échantillon ou à un tissu flou.

La figure 2A montre la morphologie typique d’un neurone TH positif à un grossissement de 20x. Des images confocal correctement colorées et focalées montreront idéalement une fluorescence brillante et nette sur un fond sombre. Un neurone TH positif a un grand soma (corps cellulaire) et plusieurs processus de ramification16. La figure 2B montre des microglies colorées Iba1, qui ont des corps de petites cellules et des processus d’extension plus courts17. La confirmation de la coloration appropriée et de la morphologie cellulaire attendue est la première étape de l’imagerie.

La figure 3 compare une image idéale (Figure 3A) à trois images indésirables (Figure 3B-D). La figure 3A montre une coloration positive et lumineuse sur un fond clair et sombre. La coloration positive se distingue facilement de l’arrière-plan. La figure 3B est un exemple d’image mal focalée avec un gain fluorescent trop important. La figure 3C montre un signal de faux positif. Les points lumineux qui ne sont pas au centre de l’attention avec le reste du tissu sont des artefacts et ne doivent pas être considérés comme un signal positif. La figure 3D est un exemple d’utilisation d’un sérum bloquant qui ne correspond pas à l’anticorps secondaire, comme suggéré dans le protocole iDISCO original4. Dans cette image, l’utilisation de sérum d’âne pour un anticorps secondaire fabriqué chez la chèvre a produit une image avec une coloration de fond élevée, ce qui obscurcit la capacité d’identifier correctement la coloration positive.

La figure 4A montre une coloration CTB positive dans le cerveau du rat. Les fibres longues et minces sont des projections afférentes le long de la voie dopaminergique. Les figures 4B et 4C montrent la colocalisation du TH et du CTB. Dans la figure 4B, l’injection peut être vue dans la zone du noyau accumbens, qui apparaît comme un cercle vert densément fluorescent. La figure 4C montre la colocalisation de TH et CTB dans la zone substantia nigra.

Figure 1
Figure 1 : Image confocale d’un échantillon de tissu nettoyé hydrophobe avec des marqueurs, grossissement 4x. (A) Coloration dense TH dans la région de substantia nigra. (B) Neurones TH clairsemés adjacents à la substantia nigra. (C) Tissu dépourvu de neurones TH positifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Morphologie typique des neurones TH positifs marqués par fluorescence (grossissement 20x) et de la microglie positive Iba1 (grossissement 10x). (A) Deux neurones TH positifs représentatifs. (B) Microglie positive Iba1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Images confocale idéales et médiocres de tissus hydrophobes, grossissement 4x. (A) Coloration TH dense dans la zone de la substantia nigra, correctement mise au point avec un gain de fluorescence approprié. (B) Image mal focale et surexposée. (C) Coloration faussement positive. (D) Coloration de fond élevée résultant du respect du protocole iDISCO non altéré. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Étiquetage de la toxine B du choléra le long de la voie dopaminergique, grossissement 4x. (A) Image confocale de coloration CTB positive. (B) Image superposée du site d’injection de TH et CTB et de nucleus accumbens. (C) Colocalisation du TH et du CTB dans la région de la substantia nigra. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Film 1: Film 3D de z-scan de l’échantillon à un grossissement 4x. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

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Discussion

L’élimination des tissus offre une solution aux limites du protocole IHC traditionnel. Un échantillon transparent minimise la diffusion et l’absorption de la lumière, ce qui fournit un accès optique au niveau cellulaire aux tissus intacts18,19. Les techniques de nettoyage des tissus transforment un tissu transparent par délipidation, décoloration et décalcification avec l’administration de solvants. Une fois que l’indice de réfraction de l’échantillon de tissu correspond à l’indice de réfraction du milieu d’imagerie choisi, l’échantillon apparaîtra complètement transparent et pourra être correctement imagé3. Le protocole hydrophobe actuel élimine l’eau du tissu dans les étapes initiales de déshydratation, réduisant ainsi la diffusion de la lumière. Le tissu est perméabilisé pendant le prétraitement pour permettre une pénétration profonde des anticorps. Les tissus qui ont subi le protocole peuvent être manipulés facilement et peuvent être imagés plusieurs fois. S’ils sont correctement stockés, les tissus peuvent encore fournir des images jusqu’à un an après le traitement initial.

Dans le présent protocole, nous appliquons une technique de nettoyage des tissus hydrophobes aux échantillons de tissus cérébraux de rats F344/N et HIV-1 Tg pour les tacher pour le TH, l’Iba1 et le CTB. Après nettoyage, les échantillons de tissus ont été imagés à l’aide d’un microscope confocal. Le protocole actuel présente plusieurs avantages par rapport à d’autres protocoles hydrophobes, comme iDISCO4. Tout d’abord, le protocole iDISCO original a été validé pour une utilisation dans le tissu de souris, tandis que le protocole actuel est viable dans le tissu cérébral de rat. Deuxièmement, le temps d’incubation ajusté à chaque étape permet d’utiliser la technique pour des coupes de tissus plus grandes. Troisièmement, l’inclusion du sérum correspondant pendant l’incubation des anticorps (par opposition à l’utilisation d’un sérum général) fournit des images plus claires pour l’analyse.

Bien que le protocole actuel soit facilement adaptable pour répondre aux besoins des questions de recherche individuelles, il y a plusieurs considérations importantes. Le protocole prend, au minimum, 26 jours consécutifs du début à la fin. Ne laissez pas l’échantillon dans une solution plus longtemps que prévu ci-dessus. L’échantillon peut cependant être conservé dans DBE à la fin du protocole pendant au moins 6 mois en toute sécurité jusqu’à l’imagerie, bien qu’il soit conseillé d’imager dès que possible. Commandez une chambre imprimée en 3D qui s’adaptera parfaitement à l’échantillon entre la lame du microscope et le couvercle. Toutes les solutions en stock, à l’exception de la solution 1, ont été mélangées jour de jour dans une quantité appropriée pour l’utilisation de ce jour-là. L’échantillon doit être déplacé dans un nouveau tube chaque fois qu’une nouvelle solution est introduite pour éviter toute contamination croisée. Si la croissance microbienne est préoccupante, l’azide de sodium peut être ajouté à la solution 2, à la solution 3, à la solution 4, à la solution d’anticorps primaire et à la solution d’anticorps secondaire à une concentration de 0,02 % dans la solution totale.

Dans l’ensemble, la technique actuelle est une procédure extrêmement polyvalente, facile à mettre en œuvre et peu coûteuse qui est compatible avec de nombreux anticorps. Avec ce protocole qui est validé pour fonctionner à la fois chez les rats témoins F344/N et les rats HIV-1 Tg, de nombreuses nouvelles questions de recherche d’investigation peuvent être répondues.

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Disclosures

Aucun des auteurs n’a de conflits d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par des subventions des NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 et par T32 Training Grant 5T32GM081740

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 Invitrogen C34775
DBE Sigma-Aldrich 108014-1KG
DCM Sigma-Aldrich 270997-100mL
DMSO Sigma-Aldrich 472301-1L
Glycine Fisher Chemical G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 Invitrogen A32733
Goat serum Sigma Life Science G9023-10mL
Heparin Acros Organics 41121-0010
Iba1 primary antibody FUJIFILM Wako 019-19741
Kwik-sil epoxy VWR 70730-062
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1l-R
PBS Fisher Bioreagents BP2944-100
Perfusion machine VWR 70730-062 mini pump variable flow
PFA Sigma-Aldrich 158127-3KG
TH primary antibody Millipore Sigma AB152
TritonX-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Tween-20 Fisher Bioreagents BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).
  4. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  5. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  6. Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
  7. Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
  8. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
  9. Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
  10. Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).
  11. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152 (2018).
  12. Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
  13. Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
  14. Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
  15. Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
  16. Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
  17. Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  18. Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).

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Neurosciences Numéro 166 nettoyage des tissus immunohistochimie iDISCO cerveau rat confocale
Une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes pour le tissu cérébral de rat
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Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A.… More

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A. R., Harrod, S. B., Mactutus, C. F., Booze, R. M. A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (166), e61821, doi:10.3791/61821 (2020).

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