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Neuroscience

Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/61821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

Hier stellen wir eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode vor, die es ermöglicht, Zielmoleküle als Teil intakter Gehirnstrukturen zu betrachten. Diese Technik wurde nun für die F344/N-Kontrolle und HIV-1 transgene Ratten beiderlei Geschlechts validiert.

Abstract

Hydrophobe Gewebereinigungsmethoden sind leicht einstellbare, schnelle und kostengünstige Verfahren, die die Untersuchung eines Moleküls von Interesse in unveränderten Gewebeproben ermöglichen. Herkömmliche Immunmarkierungsverfahren erfordern das Schneiden der Probe in dünne Abschnitte, was die Fähigkeit einschränkt, intakte Strukturen zu kennzeichnen und zu untersuchen. Wenn jedoch Hirngewebe während der Verarbeitung intakt bleiben kann, können Strukturen und Schaltkreise für die Analyse intakt bleiben. Zuvor etablierte Clearing-Methoden brauchen viel Zeit, um das Gewebe vollständig zu reinigen, und die aggressiven Chemikalien können oft empfindliche Antikörper schädigen. Die iDISCO-Methode räumt Gewebe schnell und vollständig, ist mit vielen Antikörpern kompatibel und erfordert keine spezielle Laborausrüstung. Diese Technik wurde ursprünglich für den Einsatz in Mäusegewebe validiert, aber das aktuelle Protokoll passt diese Methode an die Abbildung von Hemisphären von Kontroll- und transgenen Rattengehirnen an. Darüber hinaus nimmt das vorliegende Protokoll auch mehrere Anpassungen am bereits vorhandenen Protokoll vor, um klarere Bilder mit weniger Hintergrundflecken zu liefern. Antikörper gegen Iba-1 und Tyrosinhydroxylase wurden bei der transgenen HIV-1-Ratte und bei F344/N-Kontrollratten mit der vorliegenden hydrophoben Gewebereinigungsmethode validiert. Das Gehirn ist ein verwobenes Netzwerk, in dem Strukturen häufiger zusammenarbeiten als getrennt voneinander. Die Analyse des Gehirns als Gesamtsystem im Gegensatz zu einer Kombination einzelner Teile ist der größte Vorteil dieser gesamten Gehirnreinigungsmethode.

Introduction

Mehrere Gewebereinigungstechniken wurden für den Einsatz im Gehirn validiert: Hydrogel, hydrophil und hydrophob. Diese Techniken zielen darauf ab, ein Gewebe durch Entgiftung, Entfärbung und Entkalkung durch die Verabreichung von Lösungsmitteln transparent zu machen. Sobald der Brechungsindex der Gewebeprobe mit dem Brechungsindex des gewählten Bildgebungsmediums übereinstimmt, kann ein klares Bild der Probe erhalten werden. Hydrogel-basierte Techniken wie CLARITY sichern Biomoleküle im Gewebe, indem sie mit Hydrogelen auf Acrylbasis verbunden werden, was strukturelle Schäden und den Verlust von Proteinen verhindert1. Hydrogel-Techniken verwenden jedoch aggressive Chemikalien, die das Potenzial haben, zerbrechlichere Gewebe zu schädigen, und dichtere Gewebeproben sind möglicherweise nicht mit dem Hydrogel-Protokoll kompatibel. Bestimmte Hydrogeltechniken können teure Geräte erfordern oder zu einer Gewebeausdehnung führen. Hydrophile Techniken, wie CUBIC, bewahren die 3D-Struktur durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen im Gewebe2. Gewebeerweiterung kann auch in bestimmten hydrophilen Protokollen auftreten. Die Clearingfähigkeit hydrophiler Techniken entspricht oft nicht der Fähigkeit hydrophober Techniken, die für dichtere und dickere Gewebe wichtig ist3.

Hydrophobe Techniken sind in der Regel schnell, erfordern keine spezielle Ausrüstung und produzieren eine Probe, die einfach zu handhaben und zu lagern ist. iDISCO ist eine hydrophobe Technik, die die Schrumpfung beseitigt, die in anderen hydrophoben Protokollen auftreten kann. Ursprünglich wurde die iDISCO Gewebereinigungstechnik von Renier et al.4 für die Embryonen und dichten, adulten Organe von Mäusen beschrieben. Diese Technik entfernt dem Gewebe im ersten Austrocknungsschritt Wasser und reduziert so die Lichtstreuung. Gewebe wird während der Vorbehandlung permeabilisiert, um eine tiefe Antikörperpenetration zu ermöglichen. Alexa Fluor Farbstoffe im fernroten Spektrum werden zur Immunmarkierung verwendet, um autofluoreszenz des Gewebes bei niedrigeren Wellenlängen zu vermeiden5. Gewebe, das hydrophoben Clearing-Protokollen unterzogen wurde, kann leicht gehandhabt und aufgrund der Langlebigkeit der Alexa Fluor-Farbstoffe mehrmals abgebildet werden. Bei richtiger Lagerung können Gewebe nach der ersten Verarbeitung Monate bis zu einem Jahr lang Bilder liefern.

Im vorliegenden Protokoll wurden Tyrosinhydroxylase (TH) Antikörper, Iba1 Antikörper und Cholera Toxin Subunit B (CTB) sowohl bei männlichen und weiblichen Kontroll- als auch bei HIV-1 transgenen (Tg) Rattengehirnen eingesetzt. Die HIV-1 Tg-Ratte besitzt sieben der neun Gene, aus denen das HIV-1-Virusgenom besteht, was zu einem nicht-infektiösen Modell der langfristigen HIV-1-Proteinexposition führt6,7,8. Dopaminerge Veränderungen wurden zuvor bei der HIV-1 Tg-Ratte nachgewiesen, und HIV-1 selbst ist eine entzündliche Erkrankung, so dass die Antikörperwahl für das experimentelle Design relevant war9,10,11,12. CTB ist ein Tracer, der über Gangliosidbindung an Neuronen bindet und verwendet werden kann, um affelinete Projektionen im Gehirn zu verfolgen. CTB wurde zuvor verwendet, um Projektionen vom Nucleus accumbens bis zum Substantia nigra-Bereich zu untersuchen, zwei Bereichen des Gehirns, die stark an dopaminergen Signalwegen beteiligt sind13,14,15.

In diesem Protokoll wird TH als Marker für die Dopaminproduktion dienen, und Iba1 wird aktivierte Mikroglia markieren. Der verwendete TH-Antikörper kennzeichnet selektiv ein einzelnes Band bei etwa 62 kDa, das der Tyrosinhydroxylase entspricht. Der Iba1-Antikörper entspricht der Iba1-Carboxy-terminalen Sequenz. Beide Antikörper wurden bei Kaninchen aufgezogen und waren polyklonal. CTB wird zur retrograden Rückverfolgung von Neuronen vom Nucleus accumbens-Bereich bis zum Substantia nigra-Bereich verwendet. Das aktuelle Protokoll bietet auch eine Richtlinie für die Anpassung des ursprünglichen iDISCO-Protokolls auf zwei verschiedene Arten: 1) Gesamtreduktion der Hintergrundfärbung durch Änderung der Serumreagenzien in den Blockierungsschritten und 2) Skalierung der Inkubationszeit, um für größere Gewebeproben geeignet zu sein. Insgesamt liefert das vorliegende Protokoll weiterhin Beweise dafür, dass hydrophobe Clearing-Techniken im Gehirngewebe der Ratte durchführbar sind, keine erkennbaren schädlichen Wechselwirkungen mit HIV-1-Virusproteinen aufweisen und mit TH-Antikörpern, Iba1-Antikörpern und CTB kompatibel sind.

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Protocol

Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of South Carolina überprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung der Lagerlösung

  1. Lösung 1 (1 L): Zu 900 ml entionisiertemH2Owerden 100 mL 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 2 ml Triton X-100 hinzugefügt.
  2. Lösung 2 (1 L): Zu 900 ml entionisiertemH2Owerden 100 ml 10x PBS, 2 ml Tween-20 und 1 ml 10 mg/ml Heparin-Stammlösung hinzugefügt.
  3. Lösung 3 (500 ml): Zu 400 ml Lösung 11,5 g Glycin und 100 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzufügen.
  4. Lösung 4 (50 ml): Zu 42 ml Lösung 1 werden 3 ml entsprechendes Serum und 5 ml DMSO hinzugefügt.
  5. Primäre Antikörperlösung (50 ml): Zu 46 ml Lösung 2 werden 2,5 ml DMSO und 1,5 ml entsprechendes Serum hinzugefügt.
  6. Sekundäre Antikörperlösung (50 ml): Zu 48,5 ml Lösung 2 werden 1,5 ml entsprechendes Serum hinzugefügt.
    HINWEIS: Verwenden Sie für Lösung 4, Primärlösung und Sekundärlösung ein Serum, das dem sekundären Antikörper (z. B. Ziege, Pferd, Rind) entspricht.

2. Probenvorbereitung

HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.1 bis 2.7 in einem Abzug aus, um die Exposition gegenüber PFA zu begrenzen.

  1. Junge (3-6 Wochen) Ratten mit Sevofluran tief betäuben; Fahren Sie mit 2.2 fort, wenn die Ratte nicht anspricht und nicht auf Zehen- und Schwanzklemmen reagiert.
  2. Legen Sie die Ratte in Rückenlage und machen Sie mit einer Irisschere einen Schnitt durch die Bauchdecke.
  3. Schneiden Sie mit einer Mayo-Schere durch den Boden des Brustkorbs bis zum Schlüsselbein auf beiden Seiten des Brustkorbs.
  4. Befestigen Sie das Brustbein und die Rippen weg vom Herzen und der Lunge mit einem Hämostat.
  5. Durchbohren Sie den linken Ventrikel mit einer 23 G Nadel, die an einer Perfusionspumpe befestigt ist, und schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer Irisschere.
  6. Führen Sie eine transkardiale Perfusion mit ca. 75 ml 100 mM (1x) PBS durch.
  7. Setzen Sie die transkardiale Perfusion mit etwa 100 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) fort, das in 1x PBS gepuffert ist.
  8. Entfernen Sie das Gehirn mit einer Pinzette vom Schädel.
  9. Legen Sie das Gehirn in sagittale Position und schneiden Sie es mit einer Rasierklinge und einer Rattenhirnmatrix in 4 gleiche Abschnitte (ca. 3 mm breit).
  10. Fixieren Sie jeden Abschnitt in 4% PFA in 1x PBS in einem versiegelten, 5mL Kunststoffrohr über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker.
  11. Fixieren Sie weiterhin 4% PFA in 1x PBS bei Raumtemperatur (RT) auf einem Shaker für 1 h.
  12. Waschen Sie jeden Abschnitt mit 1x PBS bei RT für 30 min, 3 mal.

3. Dehydrierung und Depigmentierung

  1. Inkubieren Sie die Probe in einer 20% igen Methanol/ 80% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.
  2. Inkubieren Sie die Probe in einer 40% Methanol / 60% entionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.
  3. Inkubieren Sie die Probe in einer 60% Methanol / 40% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.
  4. Inkubieren Sie die Probe in einer 80% Methanol / 20% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.
  5. Inkubieren Sie die Probe in 100% Methanol für 1 h bei RT. Wiederholen Sie mit mehr 100% Methanol und inkubieren Sie für 1 h bei RT.
  6. Kühlen Sie die Probe in 100% Methanol bei 4° C für ca. 10 min.
  7. Bereiten Sie eine 66% ige Dichlormethan (DCM)/33% ige Methanollösung vor.
  8. Inkubieren Sie die Probe über Nacht in der DCM/Methanol-Lösung bei RT unter Schütteln.
  9. Mit Methanol bei RT 30 min, 2 mal waschen.
  10. Kühlen Sie die Probe in 100% Methanol bei 4° C für ca. 10 min.
  11. Bleiche in gekühltem, frisch zubereitetem 5% Wasserstoffperoxid in Methanol über Nacht bei 4° C.
  12. Inkubieren Sie die Probe in einer 80% Methanol / 20% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.
  13. Inkubieren Sie die Probe in einer 60% Methanol / 40% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.
  14. Inkubieren Sie die Probe in einer 40% Methanol / 60% entionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.
  15. Inkubieren Sie die Probe in einer 20% igen Methanol/ 80% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.
  16. Inkubieren Sie die Probe in 1x PBS für 1 h bei RT.
  17. In Lösung 1 für 1 h bei RT 2 mal waschen.

4. Choleratoxin-Untereinheit B-Kennzeichnung

  1. Führen Sie die Nadelspitze der 1 ml Spritze in die Nucleus accumbens-Stelle ein.
  2. Langsam 2,5 μL 1% Biotin-CTB über 20 s injizieren.
  3. Lassen Sie die Nadelspitze für 1 Minute an Ort und Stelle und entfernen Sie langsam über 10 s, um ein Auslaufen zu vermeiden.

5. Antikörper-Anwendung

  1. Die Probe in Lösung 3 für 2 Tage bei 37 °C in einem Wasserbad inkubieren.
  2. Die Probe in Lösung 4 für 2 Tage bei 37 °C in einem Wasserbad inkubieren.
  3. Mit primärem Antikörper 7 Tage bei 37 °C in einem Wasserbad inkubieren.
  4. In Lösung 2 5 mal waschen und 1 h pro Waschgang inkubieren. Speichern Sie lösungsweise in Lösung 2 bei RT.
  5. Mit sekundären Antikörpern 7 Tage bei 37 °C im Wasserbad inkubieren.
  6. In Lösung 2 5 Mal waschen und 1 h pro Waschgang inkubieren; über Nacht in Lösung 2 bei RT speichern.
    HINWEIS: Alle Schritte ab 5.6, einschließlich der Endlagerung, sollten bei schlechten Lichtverhältnissen erfolgen. Die Probenröhrchen können mit Aluminiumfolie abgeschirmt werden. Die für die Antikörper in diesem Protokoll verwendeten Konzentrationen waren: TH bei 1:100, Iba1 bei 1:200 und der sekundäre Antikörper bei 1:100. Fügen Sie den Schritten 5.1-5.6 zusätzliche Lösung 2 hinzu, um sicherzustellen, dass die Röhrchen vollständig gefüllt sind.

6. Gewebereinigung

  1. Inkubieren Sie die Probe in einer 20% igen Methanol/ 80% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.
  2. Inkubieren Sie die Probe in einer 40% Methanol / 60% entionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.
  3. Inkubieren Sie die Probe in einer 60% Methanol / 40% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.
  4. Inkubieren Sie die Probe in einer 80% Methanol / 20% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.
  5. Inkubieren Sie die Probe in 100% Methanol für 1 h bei RT.
  6. Inkubieren Sie in frischem 100% Methanol über Nacht bei RT.
  7. Inkubieren Sie in 66% DCM / 33% Methanol für 3 h, mit Schütteln, bei Raumtemperatur.
  8. Inkubieren Sie dibenzylether (DBE) ohne zu schütteln. Lassen Sie das Beispiel in DBE, bis es klar ist, und speichern Sie es in DBE bis zur Bildgebung.

7. Montage

  1. Erhalten Sie eine 3D-gedruckte Kammer aus Visijet M3 Crystal Harz (Vorlagen auf der idisco.info Website verfügbar).
  2. Befestigen Sie die Kammer mit einem Epoxidharz an einem Objektträger.
  3. Platzieren Sie die Probe in dem quadratischen Raum in der Mitte der Kammer.
  4. Füllen Sie die Kammer vollständig mit DBE.
  5. Legen Sie einen 0,17 mm dicken Abdeckrlip über die Kammer und drücken Sie Druck aus, bis der Abdeckripp vollen Kontakt mit den Kammerwänden hat.
  6. Versiegeln Sie die Kanten des Abdecklippes mit dem Epoxidharz zur Kammer.
  7. Drehen Sie die Kammer, damit Luftblasen aus dem Fülleinlass entweichen können.
  8. Füllen Sie die Kammer mit zusätzlichem DBE.
  9. Den Fülleinlass mit Epoxidharz verschließen und aushärten lassen.
    HINWEIS: Überschüssiges DBE wird während der Montage auslaufen.

8. Bildgebung

  1. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskopsystem, um einen Z-Scan mit 4-facher Vergrößerung durchzuführen (siehe das beigefügte 3D-Video).
  2. Erreichen Sie eine fluoreszierende Anregung der Probe mit einem Lasersatz, der bei einer Wellenlänge emittiert, die der vom sekundären Antikörper angegebenen Wellenlänge ähnelt. Die TH-Anregung wurde mit einem HeNe-Lasersatz erreicht, der bei 632 nm emittiert.
  3. Stellen Sie den Detektor auf eine Wellenlänge in der Nähe der Laseremission ein. Für das vorliegende Protokoll wurde der Detektor für TH auf 650 nm eingestellt.
  4. Erhöhen Sie die Verstärkung des Detektors, bis ein sichtbares Signal vorhanden ist. Die Verstärkung von 650LP für Bilder wurde auf 7,50 B eingestellt.
  5. Bewegen Sie mit der Scan-Option in der konfokalen Bildgebungssoftware den Mikroskopstand, bis die Probe in den Fokus gehoben wird.
  6. Navigieren Sie in allen Ebenen durch das Gewebe und erhalten Sie entweder Einzelbilder oder Z-Stack-Bilder mit der konfokalen Bildgebungssoftware.
  7. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe aus der Kammer. Legen Sie es wieder in ein vollständig mit DBE gefülltes Rohr und lagern Sie es bei RT an einem dunklen Ort, vorzugsweise mit Aluminiumfolie bedeckt.
    HINWEIS: Proben können wieder montiert und abgebildet werden, solange das Blütenstandssignal noch stark ist.

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Representative Results

Die vollständige Beseitigung großer Abschnitte von F344/N- und HIV-1-Rattenhirngewebe wurde mit diesem modifizierten hydrophoben Gewebereinigungsprotokoll erreicht. Abbildung 1 zeigt ein typisches konfokales Bild für TH im Bereich substantia nigra. Abbildung 1A stellt eine dichte, positive Färbung dar. Dichte Bereiche wie diese können durch Fokussierung durch die "Z" -Ebene analysiert werden, um eine positive Färbung und die richtige Zellmorphologie zu bestätigen. Abbildung 1B stellt eine spärliche positive Färbung dar, die durch die ausgeprägte Morphologie der TH-Neuronen identifiziert werden kann. Abbildung 1C stellt Gewebe dar, das nicht positiv gefärbt ist, aber aufgrund des Hintergrundsignals dennoch dunkel bis hellblau ist. Bereiche des Bildes, die vollständig schwarz erscheinen, weisen auf ein Fehlen von Gewebe in diesem Bereich hin. Vollständig schwarze Bereiche im Bild können darauf zurückzuführen sein, dass sie sich am Rand der Probe befinden, ein Loch, das sich in der Probe befindet, oder Gewebe, das unschreckt ist.

Abbildung 2A zeigt die typische Morphologie eines TH-positiven Neurons bei 20-facher Vergrößerung. Richtig gefärbte und fokussierte konfokale Bilder zeigen idealerweise helle und scharfe Fluoreszenz vor dunklem Hintergrund. Ein TH-positives Neuron hat ein großes Soma (Zellkörper) und mehrere Verzweigungsprozesse16. Abbildung 2B zeigt Iba1-gefärbte Mikroglia, die kleine Zellkörper und kürzere ausdehnende Prozesseaufweisen 17. Die Bestätigung der richtigen Färbung und der erwarteten Zellmorphologie ist der erste Schritt in der Bildgebung.

Abbildung 3 vergleicht ein ideales Bild (Abbildung 3A) mit drei unerwünschten Bildern (Abbildung 3B-D). Abbildung 3A zeigt positive, helle Flecken vor einem klaren, dunklen Hintergrund. Positive Flecken sind leicht vom Hintergrund zu unterscheiden. Abbildung 3B ist ein Beispiel für ein falsch fokussiertes Bild mit zu viel Fluoreszenzverstärkung. Abbildung 3C zeigt ein falsch positives Signal. Helle Flecken, die nicht im Fokus mit dem Rest des Gewebes stehen, sind Artefakte und sollten nicht als positives Signal betrachtet werden. Abbildung 3D ist ein Beispiel für die Verwendung eines blockierenden Serums, das nicht mit dem sekundären Antikörper übereinstimmt, wie im ursprünglichen iDISCO-Protokoll4vorgeschlagen. In diesem Bild erzeugte die Verwendung von Eselserum für einen sekundären Antikörper aus Ziegen ein Bild mit hoher Hintergrundfärbung, das die Fähigkeit verdeckt, positive Färbungen richtig zu identifizieren.

Abbildung 4A zeigt eine positive CTB-Färbung im Rattengehirn. Die langen, dünnen Fasern sind affekante Projektionen entlang des dopaminergen Weges. Abbildung 4B und Abbildung 4C zeigen die Kolokalisierung von TH und CTB. In Abbildung 4Bist die Injektion im Bereich des Nucleus accumbens zu sehen, der als dicht fluoreszierender grüner Kreis erscheint. Abbildung 4C zeigt die Kolokalisierung von TH und CTB im Bereich substantia nigra.

Figure 1
Abbildung 1: Konfokale Aufnahme einer hydrophob gereinigten Gewebeprobe mit Markern, 4-fache Vergrößerung. (A) Dichte TH-Färbung im Bereich substantia nigra. (B) Spärliche TH-Neuronen, die an die Substantia nigra angrenzen. (C) Gewebe ohne positive TH-Neuronen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Typische Morphologie fluoreszierend markierter TH-positiver Neuronen (20-fache Vergrößerung) und Iba1-positiver Mikroglia (10-fache Vergrößerung). (A) Zwei repräsentative TH-positive Neuronen. (B) Iba1 positive Mikroglia. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Ideale und schlechte konfokale Bilder von hydrophob gereinigtem Gewebe, 4-fache Vergrößerung. (A) Dichte TH-Färbung im Bereich der Substantia nigra, richtig fokussiert mit einer geeigneten Fluoreszenzverstärkung. (B) Ein falsch fokussiertes und übermäßig belichtetes Bild. (C) Falsch positive Färbung. (D) Hohe Hintergrundfärbung infolge der Befolkung des unveränderten iDISCO-Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Choleratoxin B-Markierung entlang des dopaminergen Weges, 4-fache Vergrößerung. (A) Konfokales Bild einer positiven CTB-Färbung. (B) Überlappentes Bild von TH und CTB und Nucleus accumbens Injektionsstelle. (C) Kolokalisation von TH und CTB im Bereich substantia nigra. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Film 1: 3D-Film des Z-Scans der Probe bei 4-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

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Discussion

Tissue Clearing bietet eine Lösung für die Einschränkungen des traditionellen IHC-Protokolls. Eine transparente Probe minimiert die Streuung und Absorption von Licht, was auf zellulärer Ebene einen optischen Zugang zu intaktem Gewebebietet 18,19. Gewebereinigungstechniken machen ein Gewebe durch Entgiftung, Entfärbung und Entkalkung mit der Verabreichung von Lösungsmitteln transparent. Sobald der Brechungsindex der Gewebeprobe mit dem Brechungsindex des gewählten Bildgebungsmediums übereinstimmt, erscheint die Probe vollständig transparent und kann ordnungsgemäß abgebildet werden3. Das vorliegende hydrophobe Protokoll entfernt dem Gewebe in den ersten Dehydratisierungsschritten Wasser und reduziert so die Lichtstreuung. Gewebe wird während der Vorbehandlung permeabilisiert, um eine tiefe Antikörperpenetration zu ermöglichen. Gewebe, das das Protokoll durchlaufen hat, kann leicht gehandhabt und mehrmals abgebildet werden. Bei richtiger Lagerung können Gewebe noch bis zu einem Jahr nach der ersten Verarbeitung Bilder liefern.

Im vorliegenden Protokoll wenden wir eine hydrophobe Gewebereinigungstechnik auf F344 / N- und HIV-1 Tg-Rattengehirngewebeproben an, um sie für TH, Iba1 und CTB zu färben. Nach der Entreinigung wurden die Gewebeproben mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Das vorliegende Protokoll hat mehrere Vorteile gegenüber anderen hydrophoben Protokollen, wie iDISCO4. Erstens wurde das ursprüngliche iDISCO-Protokoll für die Verwendung in Mäusegewebe validiert, während das vorliegende Protokoll im Gehirngewebe von Ratten lebensfähig ist. Zweitens ermöglicht die angepasste Inkubationszeit bei jedem Schritt die Verwendung der Technik für größere Gewebeschnitte. Drittens liefert die Einbeziehung des entsprechenden Serums während der Antikörperinkubation (im Gegensatz zur Verwendung eines allgemeinen Serums) klarere Bilder für die Analyse.

Während das vorliegende Protokoll leicht an die Bedürfnisse einzelner Forschungsfragen angepasst werden kann, gibt es mehrere wichtige Überlegungen. Das Protokoll dauert mindestens 26 aufeinanderfolgende Tage von Anfang bis Ende. Lassen Sie die Probe nicht länger als oben angegeben in einer Lösung. Die Probe kann jedoch am Ende des Protokolls mindestens 6 Monate sicher bis zur Bildgebung in DBE gespeichert werden, obwohl es ratsam ist, so schnell wie möglich zu bebildern. Bestellen Sie eine 3D-gedruckte Kammer, die die Probe eng zwischen objektträger und Abdeckdeckel passt. Alle Lagerlösungen, mit Ausnahme von Lösung 1, wurden Tag für Tag in einer Menge gemischt, die für den Einsatz an diesem Tag geeignet war. Die Probe sollte bei jedem Einführt einer neuen Lösung in ein neues Röhrchen gebracht werden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Wenn das mikrobielle Wachstum von Belang ist, kann Natriumazid zu Lösung 2, Lösung 3, Lösung 4, der primären Antikörperlösung und der sekundären Antikörperlösung in einer Konzentration von 0,02% in der Gesamtlösung hinzugefügt werden.

Insgesamt ist die vorliegende Technik ein äußerst vielseitiges, einfach zu implementierender und kostengünstiges Verfahren, das mit vielen Antikörpern kompatibel ist. Mit diesem Protokoll, das sowohl bei F344/ N-Kontroll- als auch bei HIV-1-Tg-Ratten validiert wurde, können viele neue investigative Forschungsfragen beantwortet werden.

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Disclosures

Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse finanziert: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & durch T32 Training Grant 5T32GM081740

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 Invitrogen C34775
DBE Sigma-Aldrich 108014-1KG
DCM Sigma-Aldrich 270997-100mL
DMSO Sigma-Aldrich 472301-1L
Glycine Fisher Chemical G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 Invitrogen A32733
Goat serum Sigma Life Science G9023-10mL
Heparin Acros Organics 41121-0010
Iba1 primary antibody FUJIFILM Wako 019-19741
Kwik-sil epoxy VWR 70730-062
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1l-R
PBS Fisher Bioreagents BP2944-100
Perfusion machine VWR 70730-062 mini pump variable flow
PFA Sigma-Aldrich 158127-3KG
TH primary antibody Millipore Sigma AB152
TritonX-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Tween-20 Fisher Bioreagents BP337-500

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References

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