Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/61821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

כאן אנו מציגים שיטת ניקוי רקמות הידרופובית המאפשרת צפייה במולקולות יעד כחלק ממבני מוח שלמים. טכניקה זו אומתה כעת לשליטה F344/N ו- HIV-1 חולדות מהונדסות משני המינים.

Abstract

שיטות ניקוי רקמות הידרופוביות ניתנות להתאמה בקלות, מהירות ובעלות נמוכה המאפשרות לחקור מולקולה של עניין בדגימות רקמות ללא לשינוי. הליכי אימונולאבלילינג מסורתיים דורשים חיתוך המדגם לחלקים דקים, מה שמגביל את היכולת לתייג ולבחון מבנים שלמים. עם זאת, אם רקמת המוח יכולה להישאר שלמה במהלך העיבוד, מבנים ומעגלים יכולים להישאר שלמים לניתוח. שיטות הסליקה שנקבעו בעבר לוקחות זמן משמעותי לנקות את הרקמה לחלוטין, והכימיקלים הקשים יכולים לעתים קרובות לפגוע בנוגדנים רגישים. שיטת iDISCO מנקה רקמות במהירות ובצורה מלאה, תואמת לנוגדנים רבים, ואינו דורש ציוד מעבדה מיוחד. טכניקה זו אומתה בתחילה לשימוש ברקמת עכברים, אך הפרוטוקול הנוכחי מתאים שיטה זו לחצי הכדורים של שליטה ומוחות חולדה מהונדסים. בנוסף לכך, הפרוטוקול הנוכחי מבצע גם מספר התאמות לפרוטוקול הקיים כדי לספק תמונות ברורות יותר עם פחות כתמי רקע. נוגדנים עבור איבה-1 ו טירוצין הידרוקסילאז אומתו בחולדה מהונדסת HIV-1 ובחולדות בקרה F344/N בשיטת ניקוי הרקמות ההידרופובית הנוכחית. המוח הוא רשת שזורה, שבה מבנים פועלים יחד לעתים קרובות יותר מאשר בנפרד זה מזה. ניתוח המוח כמערכת שלמה בניגוד לשילוב של חלקים בודדים הוא היתרון הגדול ביותר של כל שיטת ניקוי המוח הזו.

Introduction

מספר טכניקות לניקוי רקמות אומתו לשימוש במוח: הידרוג'ל, הידרופילי והידרופובי. טכניקות אלה שואפות להפוך רקמה לשקופה באמצעות התלזות, דה-צבע ופירוק באמצעות ניהול ממסים. לאחר אינדקס שבירה של דגימת הרקמה תואם את האינדקס שבירה של מדיום ההדמיה שנבחר, ניתן להשיג תמונה ברורה של המדגם. טכניקות מבוססות הידרוג'ל, כגון CLARITY, ביומולקולים מאובטחים ברקמה על ידי קישורם הידרוג'לים מבוססי אקריל, המונע נזק מבני ואובדן חלבונים1. עם זאת, טכניקות הידרוג'ל להשתמש כימיקלים קשים מאשר יש פוטנציאל לפגוע רקמות שבירות יותר, ודגימות רקמות צפופות יותר לא יכול להיות תואם פרוטוקול הידרוג'ל. טכניקות הידרוג'ל מסוימות עשויות לדרוש ציוד יקר או להוביל להרחבת רקמות. טכניקות הידרופיליות, כמו CUBIC, לשמר מבנה 3D באמצעות היווצרות של קשרי מימן בתוך הרקמה2. הרחבת רקמות יכולה להתרחש גם בפרוטוקול הידרופילי מסוים. יכולת הסליקה של טכניקות הידרופיליות לעתים קרובות אינה תואמת את היכולת שיש לטכניקות הידרופוביות, החשובה לרקמות צפופות ועבות יותר3.

טכניקות הידרופוביות הן בדרך כלל מהירות, אינן דורשות ציוד מיוחד, ומייצרות מדגם שקל לטפל בו ולאחסן. iDISCO היא טכניקה הידרופובית שמבטלת את ההתכווצות שיכולה להתרחש בפרוטוקול הידרופובי אחר. במקור, טכניקת ניקוי הרקמות iDISCO תוארה על ידי Renier et al.4 עבור העוברים ואיברים צפופים, מבוגרים של עכברים. טכניקה זו מסירה מים מהרקמה בשלב ההתייבשות הראשוני, ובכך מפחיתה את פיזור האור. הרקמה מחלחלת במהלך טיפול מקדים כדי לאפשר חדירת נוגדנים עמוקה. אלכסה פלור צבעים בספקטרום האדום הרחוק משמשים אימונולאבלינג כדי למנוע autofluorescence של הרקמה באורכי גל נמוכיםיותר 5. רקמה שעברה פרוטוקולי סליקה הידרופוביים ניתן לטפל בקלות וניתן לדמיין מספר פעמים בשל אריכות הימים של צבעי Alexa Fluor. אם מאוחסן כראוי, רקמות יכול לספק תמונות במשך חודשים עד שנה לאחר העיבוד הראשוני.

בפרוטוקול הנוכחי, נוגדן טירוסין הידרוקסילאז (TH), נוגדן Iba1, ו Cholera רעלן Subunit B (CTB) שימשו הן על שליטה זכרית ונקבה והן HIV-1 מהונדס (Tg) מוחות חולדה. חולדת HIV-1 Tg מחזיקה בשבעה מתוך תשעת הגנים המרכיבים את הגנום הנגיפי HIV-1, מה שמוביל למודל לא זיהומי של חשיפה ארוכת טווח לחלבון HIV-16,7,8. שינויים דופאמין הוכחו בעבר בחולדה HIV-1 Tg, ו- HIV-1 עצמו היא מחלה דלקתית, ולכן בחירת הנוגדנים הייתה רלוונטית לעיצוב הניסיוני9,10,11,12. CTB הוא נותב המתחבר לנוירונים באמצעות כריכת גנגליוסיד וניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תחזיות חיוביות במוח. CTB שימש בעבר כדי ללמוד תחזיות מגרעין האקומבנס לאזור הסובסטנציה ניגרה, שני אזורים במוח המעורבים בכבדות עם מסלולים דופאמין13,14,15.

בפרוטוקול זה, TH ישמש סמן לייצור דופמין, ו Iba1 יסמן מיקרוגליה פעילה. נוגדן TH המשמש באופן סלקטיבי תוויות רצועה אחת בכ 62 kDa התואם טירוצין הידרוקסילאז. הנוגדן Iba1 מתאים לרצף מסוף קרבוקסי Iba1. שני הנוגדנים גדלו בארנב והיו פוליקלונליים. CTB ישמש למעקב מדרדר של נוירונים מאזור גרעין האקומבנס לאזור הסובסטנציה ניגרה. הפרוטוקול הנוכחי מציע גם קו מנחה להתאמת פרוטוקול iDISCO המקורי בשתי דרכים נפרדות: 1) הפחתה כוללת של כתמי הרקע על ידי שינוי ריאגנטים בסרום בשלבי החסימה, ו -2) שינוי קנה המידה של זמן הדגירה כך שיתאימו לדגימות רקמות גדולות יותר. בסך הכל, הפרוטוקול הנוכחי מספק ראיות מתמשכות לכך שטכניקות סליקה הידרופוביות אפשריות ברקמות המוח של החולדה, אין להן אינטראקציות מזיקות ניכרות עם חלבונים ויראליים HIV-1, והן תואמות לנוגדן TH, נוגדן Iba1 ו- CTB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת דרום קרוליינה.

1. הכנת פתרון מלאי

  1. פתרון 1 (1 ליטר): ל 900 מ"ל של H2O deionized להוסיף 100 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט 10x (PBS) ו 2 מ"ל של טריטון X-100.
  2. פתרון 2 (1 ליטר): ל 900 מ"ל של H2O deionized, להוסיף 100 מ"ל של 10x PBS, 2mL של Tween-20 ו 1 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל פתרון מלאי הפרין.
  3. פתרון 3 (500 מ"ל): ל-400 מ"ל של פתרון 1, הוסף 11.5 גרם של גליצין ו-100 מ"ל של דימתילסולפוקס (DMSO).
  4. פתרון 4 (50 מ"ל): ל 42 מ"ל של פתרון 1, להוסיף 3 מ"ל של סרום מתאים ו 5 מ"ל של DMSO.
  5. פתרון נוגדנים ראשי (50 מ"ל): ל 46 מ"ל של פתרון 2, להוסיף 2.5 מ"ל של DMSO ו 1.5 מ"ל של סרום מתאים.
  6. פתרון נוגדנים משני (50 מ"ל): ל 48.5 מ"ל של פתרון 2, להוסיף 1.5 מ"ל של סרום מתאים.
    הערה: עבור פתרון 4, פתרון ראשוני, פתרון משני, להשתמש בסרום המתאים עם הנוגדן המשני (למשל, עז, סוס, שור).

2. הכנת מדגם

הערה: בצע שלבים 2.1 עד 2.7 במכסה המנוע של אדים עקב הגבלת החשיפה ל- PFA.

  1. עכברוש צעיר מאוד (3-6 שבועות) באמצעות סבופלורן; המשך ל 2.2 כאשר חולדה אינה מגיבה ואינה מגיבה לצביטת בוהן וזנב.
  2. מניחים את החולדה בתנוחה על-חניכית וגורמים חתכים דרך דופן הבטן באמצעות זוג מספריים של איריס.
  3. חותכים דרך החלק התחתון של כלוב הצלעות לעצם הבריח משני צידי כלוב הצלעות באמצעות מספריים מאיו.
  4. מדביק את החזה והצלעות הרחק מהלב והריאות עם hemostat.
  5. לנקב את החדר השמאלי עם מחט 23 G מחובר משאבת זלוף לחתוך את האטריום הימני עם מספריים איריס.
  6. בצע זלוף עירוי עם כ 75 מ"ל של 100 mM (1x) PBS.
  7. המשך זלוף עירוי קרדית עם כ 100 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) חוצץ ב 1x PBS.
  8. הסר את המוח מהגולגולת באמצעות מלקחיים.
  9. מניחים את המוח במצב קשת ופורסים ל-4 חלקים שווים (ברוחב של כ-3 מ"מ) באמצעות סכין גילוח ומטריצת מוח חולדה.
  10. תקן כל סעיף ב- 4% PFA ב- 1x PBS בצינור פלסטיק אטום, 5 מ"ל למשך הלילה ב 4 °C (70 °F) על שייקר.
  11. המשך לתקן ב 4% PFA ב 1x PBS בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר עבור 1 שעה.
  12. לשטוף כל סעיף עם 1x PBS ב RT במשך 30 דקות, 3 פעמים.

3. התייבשות ודפיגמנטציה

  1. לדגור על המדגם בתמיסת מים דו-שנתית של 20% מתנול/80% למשך שעה אחת ב-RT.
  2. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 40% מתנול / 60% עבור 1 שעה ב RT.
  3. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 60% מתנול / 40% עבור 1 שעה ב RT.
  4. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 80% מתנול / 20% עבור 1 שעה ב RT.
  5. לדגור על המדגם ב 100% מתנול במשך 1 שעה ב RT. חזור עם יותר 100% מתנול, דגירה במשך 1 שעה ב RT.
  6. מצננים את המדגם ב 100% מתנול ב 4° C במשך כ 10 דקות.
  7. הכן פתרון מתנול 66%./33%.
  8. לדגור את המדגם לילה בתמיסת DCM / מתנול ב RT, עם רועד.
  9. לשטוף עם מתנול ב RT במשך 30 דקות, 2 פעמים.
  10. מצננים את המדגם ב 100% מתנול ב 4° C במשך כ 10 דקות.
  11. אקונומיקה במצנן, מוכן טרי 5% מי חמצן במתנול לילה ב 4° C.
  12. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 80% מתנול / 20% עבור 1 שעה ב RT.
  13. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 60% מתנול / 40% עבור 1 שעה ב RT.
  14. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 40% מתנול / 60% עבור 1 שעה ב RT.
  15. לדגור על המדגם בתמיסת מים דו-שנתית של 20% מתנול/80% למשך שעה אחת ב-RT.
  16. לדגור על המדגם ב 1x PBS עבור 1 שעה ב RT.
  17. יש לשטוף בפתרון 1 למשך שעה אחת ב-RT, פעמיים.

4. כולרה רעלן Subunit B תיוג

  1. הכנס קצה מחט של מזרק 1 מ"ל לתוך אתר גרעין accumbens.
  2. להזריק לאט 2.5 μL של 1% ביוטין-CTB מעל 20 s.
  3. השאירו את קצה המחט במקום במשך 1 דקות ולהסיר לאט מעל 10 s כדי למנוע דליפה.

5. יישום נוגדנים

  1. לדגור על המדגם בפתרון 3 במשך יומיים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.
  2. לדגור על המדגם בפתרון 4 במשך יומיים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.
  3. דגירה עם נוגדן ראשוני במשך 7 ימים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.
  4. יש לשטוף בתמיסה 2 למשך 5 פעמים, תוך כדי הדגירה של שעה אחת לכביסה. יש לאחסן בפתרון 2 ב-RT למשך הלילה.
  5. דגירה עם נוגדן משני במשך 7 ימים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.
  6. לשטוף בתמיסה 2 במשך 5 פעמים, דגירה 1 שעה לכל לשטוף; יש לאחסן בפתרון 2 ב-RT למשך הלילה.
    הערה: כל השלבים מ- 5.6 ואילך, כולל אחסון סופי, צריכים להתרחש באור נמוך. צינורות מדגם ניתן להגן עם רדיד אלומיניום. הריכוזים המשמשים לנוגדנים בפרוטוקול זה היו: TH בשעה 1: 100, איבה1 בשעה 1: 200, ואת הנוגדן המשני בשעה 1: 100. הוסף פתרון נוסף 2 לשלבים 5.1-5.6 כדי להבטיח שצינורות מלאים לחלוטין.

6. ניקוי רקמות

  1. לדגור על המדגם בתמיסת מים דו-שנתית של 20% מתנול/80% למשך שעה אחת ב-RT.
  2. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 40% מתנול / 60% עבור 1 שעה ב RT.
  3. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 60% מתנול / 40% עבור 1 שעה ב RT.
  4. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 80% מתנול / 20% עבור 1 שעה ב RT.
  5. לדגור על המדגם ב 100% מתנול עבור 1 שעה ב RT.
  6. דגירה טרי 100% מתנול לילה ב RT.
  7. דגירה ב 66% DCM / 33% מתנול במשך 3 שעות, עם רועד, בטמפרטורת החדר.
  8. דגירה באתר דיבנזיל (DBE) מבלי לרעוד. השאר את המדגם ב- DBE עד ניקוי ולאחסן ב- DBE עד הדמיה.

7. הרכבה

  1. קבל תא מודפס בתלת-ממד העשוי משרף קריסטל Visijet M3 (תבניות הזמינות באתר האינטרנט idisco.info).
  2. אבטחו את התא לשקופית מיקרוסקופ באמצעות אפוקסי.
  3. מניחים את הדגימה בחלל המרובע באמצע התא.
  4. מלא את התא לחלוטין עם DBE.
  5. מניחים כיסוי בעובי 0.17 מ"מ מעל התא ומפעילים לחץ עד שלכיסוי יש מגע מלא עם קירות התא.
  6. אוטמים את קצות כיסויי הכיסוי לתא באמצעות האפוקסי.
  7. סובבו את התא כדי לאפשר לבועות אוויר לברוח ממפרצון המילוי.
  8. מלא את התא ב- DBE נוסף.
  9. לאטום את מפרצון המילוי עם אפוקסי ולאפשר לרפא.
    הערה: עודף DBE יישפך במהלך הרכבה.

8. הדמיה

  1. השתמש במערכת מיקרוסקופ קונפוקלית כדי לבצע סריקת z בהגדלה פי 4 (ראה וידאו תלת-ממדיהמצורף ).
  2. להשיג עירור פלואורסצנטי של המדגם באמצעות ערכת לייזר לפלוט אורך גל דומה לאורך הגל שצוין על ידי הנוגדן המשני. עירור TH הושג תוך שימוש בערכת לייזר HeNe לפלוט ב 632 ננומטר.
  3. הגדר את הגלאי אורך גל קרוב לפליטת הלייזר. עבור הפרוטוקול הנוכחי, הגלאי עבור TH הוגדר 650 ננומטר.
  4. להעלות את הרווח של הגלאי עד שיש אות גלוי. הרווח של 650LP לתמונות נקבע על 7.50 B.
  5. באמצעות האפשרות סריקה בתוכנת ההדמיה הקונפוקלית, הזז את שלב המיקרוסקופ עד שהדגימה מובאת למוקד.
  6. נווט סביב הרקמה בכל המישורים וקבל תמונות בודדות או תמונות z-stack באמצעות תוכנת ההדמיה הקונפוקלית.
  7. לאחר השלמת ההדמיה, הסר את הדגימה מהתא. מניחים אותו בחזרה לתוך צינור מלא לחלוטין עם DBE ולאחסן ב RT במקום חשוך, רצוי מכוסה בנייר אלומיניום.
    הערה: ניתן טען מחדש ותמונה של דגימות כל עוד אות פלורסנס עדיין חזק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניקוי מלא של חלקים גדולים של F344/N ו- HIV-1 רקמת מוח חולדה הושג באמצעות פרוטוקול ניקוי רקמות הידרופוביות זה שונה. איור 1 מציג תמונה קונפוקלית טיפוסית עבור TH באזור הסובסטנציה ניגרה. איור 1A מייצג כתמים צפופים וחיוביים. אזורים צפופים כגון אלה ניתן לנתח על ידי התמקדות דרך מישור "Z" כדי לאשר כתמים חיוביים מורפולוגיה תאים נכונה. איור 1B מייצג כתמים חיוביים דלילים, שניתן לזהותם על ידי המורפולוגיה הייחודית של תאי העצב TH. איור 1C מייצג רקמה שאינה מוכתמת באופן חיובי אך עדיין כהה עד בהירה עקב אות רקע. אזורים בתמונה המופיעים כשחרוקים לחלוטין מצביעים על היעדר רקמה באזור זה. אזורים שחורים לחלוטין בתמונה יכולים להיות על קצה המדגם, חור שנמצא במדגם, או רקמה כי הוא מחוץ לפוקוס.

איור 2A מראה מורפולוגיה אופיינית של נוירון חיובי TH בהגדלה של פי 20. תמונות קונפוקליות מוכתמות וממוקדות כראוי יציגו באופן אידיאלי פלואורסצנטיות בהירה ופריכה על רקע כהה. נוירון חיובי TH יש סומה גדולה (גוף התא) וכמה תהליכי הסתעפות16. איור 2B מציג מיקרוגליה מוכתמת של Iba1, שיש בה גופים של תאים קטנים ותהליכי הארכה קצרים יותר17. אישור של כתמים נאותים ומורפולוגיה של תאים צפויים הוא הצעד הראשון בהדמיה.

איור 3 משווה תמונה אידיאלית(איור 3A)לשלוש תמונות לא רצויות (איור 3B-D). איור 3A מראה כתמים חיוביים ובהירים על רקע בהיר וחשוך. ניתן להבחין בקלות בין כתמים חיוביים לרקע. איור 3B הוא דוגמה לתמונה ממוקדת בצורה לא נכונה עם יותר מדי רווח פלואורסצנטי. איור 3C מראה אות חיובי כוזב. כתמים בהירים שאינם בפוקוס עם שאר הרקמה הם חפצים ואין לראותם כאות חיובי. איור 3D הוא דוגמה לשימוש בסרום חסימה שאינו תואם לנוגדן המשני, כפי שהוצע בפרוטוקול iDISCO המקורי4. בתמונה זו, השימוש בסרום חמור לנוגדן משני המיוצר בעז יצר תמונה עם כתמי רקע גבוהים, אשר מטשטש את היכולת לזהות כראוי כתמים חיוביים.

איור 4A מראה כתמי CTB חיוביים במוח החולדה. הסיבים הארוכים והדקים הם תחזיות חיוביות לאורך המסלול הדופאמין. איור 4B ואיור 4C מראים colocalization של TH ו- CTB. באיור 4Bניתן לראות את ההזרקה באזור גרעין האקומבנס, המופיע כעיגול ירוק פלואורסצנטי בצפיפות. איור 4C מציג קולוקליזציה של TH ו-CTB באזור הסובסטנציה ניגרה.

Figure 1
איור 1: תמונה קונפוצלית של דגימת רקמה מנוקה הידרופובית עם סמנים, הגדלה פי 4. (A)כתמי TH צפופים באזור הסובסטנציה ניגרה. (B)נוירוני TH דלילות הסמוכים לסובסטנציה ניגרה. (C)רקמה חסרה נוירוני TH חיוביים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מורפולוגיה אופיינית של נוירונים חיוביים TH (הגדלה של פי 20) ו-Iba1 positive microglia (הגדלה של פי 10). (A)שני נוירונים חיוביים TH מייצגים. (B)איבא1 מיקרוגליה חיובית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונות קונפוקליות אידיאליות ועניות של רקמה מנוקה הידרופובית, הגדלה פי 4. (A)כתמי TH צפופים באזור הסובסטנציה ניגרה, בפוקוס נכון עם רווח פלואורסצנטי מתאים. (ב)תמונה ממוקדת וחשופה יתר על המידה. (ג)כתמים חיוביים כוזבים. (D)כתמי רקע גבוהים כתוצאה מציות לפרוטוקול iDISCO ללא משתנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: כולרה רעלן B תיוג לאורך המסלול דופאמין, הגדלה 4x. (A)תמונה קונפוצלית של כתמי CTB חיוביים. (B)תמונה חופפת של TH ו- CTB וגרעין accumbens הזרקת אתר. (C)Colocalization של TH ו- CTB באזור הסובסטנציה ניגרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

סרט 1: סרט תלת-ממדי של z-סריקה של המדגם בהגדלה 4x. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניקוי רקמות מציע פתרון למגבלות של פרוטוקול IHC המסורתי. מדגם שקוף ממזער את הפיזור והספיגה של האור, המספק גישה אופטית ברמה התאית לרקמות שלמות18,19. טכניקות ניקוי רקמות הופכות רקמה לשקופה באמצעות התלזות, דה-צבע ופירוק הסתיידות עם ניהול ממסים. לאחר אינדקס שבירה של דגימת הרקמה תואם את האינדקס שבירה של מדיום ההדמיה שנבחר, המדגם ייראה שקוף לחלוטין וניתן לדמיין כראוי3. הפרוטוקול ההידרופובי הנוכחי מסיר מים מהרקמה בשלבי ההתייבשות הראשוניים, ובכך מפחית את פיזור האור. הרקמה מחלחלת במהלך טיפול מקדים כדי לאפשר חדירת נוגדנים עמוקה. רקמה שעברה את הפרוטוקול ניתן לטפל בקלות וניתן לדמיין אותה מספר פעמים. אם מאוחסן כראוי, רקמות עדיין יכול לספק תמונות עד שנה לאחר העיבוד הראשוני.

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מיישמים טכניקת ניקוי רקמות הידרופובית על דגימות רקמת מוח של עכברוש F344/N ו- HIV-1 Tg כדי להכתים עבור TH, Iba1 ו- CTB. לאחר הסליקה, דגימות הרקמה צולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. לפרוטוקול הנוכחי יש מספר יתרונות על פני פרוטוקול הידרופובי אחר, כמו iDISCO4. ראשית, פרוטוקול iDISCO המקורי אומת לשימוש ברקמת עכברים, בעוד הפרוטוקול הנוכחי הוא קיימא ברקמת המוח חולדה. שנית, זמן הדגירה המותאם בכל שלב מאפשר להשתמש בטכניקה עבור מקטעי רקמות גדולים יותר. שלישית, כולל הסרום המתאים במהלך דגירה נוגדנים (בניגוד לשימוש בסרום כללי) מספק תמונות ברורות יותר לניתוח.

בעוד הפרוטוקול הנוכחי ניתן להתאמה בקלות כדי להתאים את הצרכים של שאלות מחקר בודדות, ישנם מספר שיקולים חשובים. הפרוטוקול לוקח, לכל הפחות, 26 ימים רצופים מתחילתם ועד סופם. אין להשאיר את המדגם בפתרון למשך זמן רב יותר ממה שצוין לעיל. המדגם יכול, עם זאת, להיות מאוחסן DBE בסוף הפרוטוקול לפחות 6 חודשים בבטחה עד הדמיה, אם כי מומלץ לדמיין בהקדם האפשרי. הזמינו תא מודפס בתלת-ממד שיתאים לדגימה בצורה נוחה בין שקופית המיקרוסקופ לכיסוי. כל פתרונות המלאי, מלבד פתרון 1, היו מעורבים יום של סכום שהיה מתאים לשימוש באותו יום. המדגם צריך להיות מועבר צינור חדש בכל פעם פתרון חדש הוא הציג כדי למנוע זיהום צולב. אם הצמיחה המיקרוביאלית מדאיגה, ניתן להוסיף נתרן אזיד לפתרון 2, פתרון 3, פתרון 4, פתרון הנוגדנים העיקרי, ולתמיסת הנוגדנים המשנית בריכוז של 0.02% בתמיסה הכוללת.

בסך הכל, הטכניקה הנוכחית היא הליך רב-תכליתי, קל מאוד ליישום ובעלות נמוכה התואם נוגדנים רבים. עם פרוטוקול זה כי הוא מאומת לעבוד הן F344 / N שליטה ו- HIV-1 Tg חולדות, שאלות מחקר חקירה חדשות רבות ניתן לענות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לאף אחד מהמחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 &32 הכשרה גרנט 5T32GM081740

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 Invitrogen C34775
DBE Sigma-Aldrich 108014-1KG
DCM Sigma-Aldrich 270997-100mL
DMSO Sigma-Aldrich 472301-1L
Glycine Fisher Chemical G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 Invitrogen A32733
Goat serum Sigma Life Science G9023-10mL
Heparin Acros Organics 41121-0010
Iba1 primary antibody FUJIFILM Wako 019-19741
Kwik-sil epoxy VWR 70730-062
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1l-R
PBS Fisher Bioreagents BP2944-100
Perfusion machine VWR 70730-062 mini pump variable flow
PFA Sigma-Aldrich 158127-3KG
TH primary antibody Millipore Sigma AB152
TritonX-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Tween-20 Fisher Bioreagents BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).
  4. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  5. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  6. Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
  7. Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
  8. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
  9. Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
  10. Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).
  11. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152 (2018).
  12. Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
  13. Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
  14. Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
  15. Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
  16. Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
  17. Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  18. Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).

Tags

מדעי המוח גיליון 166 ניקוי רקמות אימונוהיסטוכימיה iDISCO מוח חולדה קונפוקלי
שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A.… More

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A. R., Harrod, S. B., Mactutus, C. F., Booze, R. M. A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (166), e61821, doi:10.3791/61821 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter