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Neuroscience

चूहा मस्तिष्क ऊतक के लिए एक हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन विधि

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/61821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

यहां हम एक हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन विधि पेश करते हैं जो अक्षुण्ण मस्तिष्क संरचनाओं के हिस्से के रूप में लक्ष्य अणुओं को देखने की अनुमति देता है। इस तकनीक को अब F344/N नियंत्रण और एचआईवी-1 दोनों लिंगों के ट्रांसजेनिक चूहों के लिए मान्य किया गया है ।

Abstract

हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन विधियां आसानी से समायोज्य, तेज और कम लागत वाली प्रक्रियाएं हैं जो अनछुए ऊतक नमूनों में रुचि के अणु के अध्ययन के लिए अनुमति देती हैं। पारंपरिक इम्यूनोलाबेलिंग प्रक्रियाओं को नमूने को पतले वर्गों में काटने की आवश्यकता होती है, जो अक्षुण्ण संरचनाओं को लेबल और जांच करने की क्षमता को प्रतिबंधित करता है। हालांकि, यदि प्रसंस्करण के दौरान मस्तिष्क के ऊतक बरकरार रह सकते हैं, तो विश्लेषण के लिए संरचनाएं और सर्किट बरकरार रह सकते हैं। पहले स्थापित समाशोधन विधियों को ऊतक को पूरी तरह से साफ करने में महत्वपूर्ण समय जाता है, और कठोर रसायन अक्सर संवेदनशील एंटीबॉडी को नुकसान पहुंचा सकते हैं। iDISCO विधि जल्दी से और पूरी तरह से ऊतक को साफ करता है, कई एंटीबॉडी के साथ संगत है, और कोई विशेष प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता है। इस तकनीक को शुरू में चूहों के ऊतकों में उपयोग के लिए मान्य किया गया था, लेकिन वर्तमान प्रोटोकॉल इस विधि को नियंत्रण और ट्रांसजेनिक चूहे के दिमाग के छवि गोलार्द्धों के लिए अनुकूलित करता है। इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल कम पृष्ठभूमि धुंधला के साथ स्पष्ट छवियों को प्रदान करने के लिए पहले से मौजूद प्रोटोकॉल के लिए कई समायोजन भी करता है। वर्तमान हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन विधि का उपयोग करके एचआईवी-1 ट्रांसजेनिक चूहे में और F344/N नियंत्रण चूहों में आईबीए-1 और टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज के लिए एंटीबॉडी मान्य थे । मस्तिष्क एक इंटरबुने नेटवर्क है, जहां संरचनाएं एक दूसरे के अलग से अधिक बार एक साथ काम करती हैं। व्यक्तिगत टुकड़ों के संयोजन के विपरीत एक पूरी प्रणाली के रूप में मस्तिष्क का विश्लेषण करना इस पूरे मस्तिष्क समाशोधन विधि का सबसे बड़ा लाभ है।

Introduction

हाइड्रोजेल, हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक: मस्तिष्क में उपयोग के लिए कई ऊतक समाशोधन तकनीकों को मान्य किया गया है। इन तकनीकों का उद्देश्य सॉल्वैंट्स के प्रशासन के माध्यम से परिसीमन, विच्छेदन और डिक्लेरेशन के माध्यम से एक ऊतक को पारदर्शी बनाना है। एक बार जब ऊतक नमूने का अपवर्तक सूचकांक चुने गए इमेजिंग माध्यम के अपवर्तक सूचकांक से मेल खाता है, तो नमूने की एक स्पष्ट छवि प्राप्त की जा सकती है। स्पष्टता जैसी हाइड्रोगेल आधारित तकनीकें ऊतक में एक्रिल-आधारित हाइड्रोगेल से जोड़कर जैव अणुओं को सुरक्षित करती हैं, जो संरचनात्मक क्षति और प्रोटीन की हानि को रोकती है1। हालांकि, हाइड्रोगेल तकनीक कठोर रसायनों का उपयोग अधिक नाजुक ऊतकों को नुकसान पहुंचाने की क्षमता से होती है, और डेंजर ऊतक नमूने हाइड्रोगेल प्रोटोकॉल के साथ संगत नहीं हो सकते हैं। कुछ हाइड्रोगेल तकनीकों को महंगे उपकरणों की आवश्यकता हो सकती है या ऊतक विस्तार का कारण बन सकता है। क्यूबिक जैसी हाइड्रोफिलिक तकनीकें ऊतक 2 के भीतर हाइड्रोजन बांड के गठन के माध्यम से 3 डी संरचना कोसंरक्षितकरते हैं। ऊतक विस्तार भी कुछ हाइड्रोफिलिक प्रोटोकॉल में हो सकता है। हाइड्रोफिलिक तकनीकों की समाशोधन क्षमता अक्सर हाइड्रोफोबिक तकनीकों की क्षमता से मेल नहीं खाती है, जो डेंजर और मोटे ऊतकों के लिए महत्वपूर्ण है3।

हाइड्रोफोबिक तकनीक आमतौर पर तेज होती है, विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है, और एक नमूना पेश करती है जिसे संभालना और स्टोर करना आसान होता है। आईआईडस्को एक हाइड्रोफोबिक तकनीक है जो अन्य हाइड्रोफोबिक प्रोटोकॉल में होने वाली सिकुड़न को समाप्त करती है। मूल रूप से, iDISCO ऊतक समाशोधन तकनीक Renier एट अल द्वारा वर्णित किया गया था4 भ्रूण और घने, चूहों के वयस्क अंगों के लिए । यह तकनीक शुरुआती डिहाइड्रेशन स्टेप में टिश्यू से पानी निकालती है, जिससे लाइट स्कैटर कम हो जाती है। ऊतक को प्रीट्रीटमेंट के दौरान गहरे एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति देने के लिए पार किया जाता है। सुदूर लाल स्पेक्ट्रम में एलेक्सा फ्लोर रंगों का उपयोग कम तरंगदैर्ध्य 5 पर ऊतक के ऑटोफ्लोरेसेंस से बचने के लिए इम्यूनोलबेलिंग के लिए कियाजाताहै। ऊतक जो हाइड्रोफोबिक समाशोधन प्रोटोकॉल से गुजरा है, आसानी से संभाला जा सकता है और एलेक्सा फ्लोर रंगों की दीर्घायु के कारण कई बार इमेज किया जा सकता है। यदि ठीक से संग्रहीत किया जाता है, तो ऊतक प्रारंभिक प्रसंस्करण के बाद महीनों से एक साल तक छवियां प्रदान कर सकते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल में नर और महिला नियंत्रण और एचआईवी-1 ट्रांसजेनिक (टीजी) चूहे के दिमाग पर टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (टीएच) एंटीबॉडी, आईबीए1 एंटीबॉडी और हैजा टॉक्सिन सबयूनिट बी (सीटीबी) का इस्तेमाल किया गया । एचआईवी-1 टीजी चूहे में नौ जीन में से सात होते हैं जिनमें एचआईवी-1 वायरल जीनोम शामिल होता है, जो लंबे समय तक एचआईवी-1 प्रोटीन एक्सपोजर6, 7, 8के गैर-संक्रामक मॉडल की ओरजाताहै। डोपामिनेर्गिक परिवर्तन पहले एचआईवी-1 टीजी चूहे में प्रदर्शित किए गए हैं, और एचआईवी-1 अपने आप में एक भड़काऊ बीमारी है, इसलिए एंटीबॉडी विकल्प प्रायोगिक डिजाइन9,10, 11,12के लिए प्रासंगिक था। सीटीबी एक ट्रेसर है जो गैंगलियोसाइड बाइंडिंग के माध्यम से न्यूरॉन्स को देता है और मस्तिष्क में अफरेंट अनुमानों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सीटीबी का उपयोग पहले नाभिक एकुम्बेंस से लेकर सबस्टेंटिया निगरा क्षेत्र तक के अनुमानों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, मस्तिष्क के दो क्षेत्र 13 ,14,15के साथ भारी रूप से शामिल होते हैं।

इस प्रोटोकॉल में, TH डोपामाइन उत्पादन के लिए एक मार्कर के रूप में काम करेगा, और Iba1 सक्रिय माइक्रोग्लिया को चिह्नित करेगा। टीएच एंटीबॉडी का उपयोग लगभग 62 केडीए पर एक बैंड को चुनिंदा रूप से लेबल करता है जो टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज से मेल खाता है। Iba1 एंटीबॉडी Iba1 कार्बोक्सी-टर्मिनल अनुक्रम से मेल खाती है। दोनों एंटीबॉडी खरगोश में उठाए गए थे और पॉलीक्लोनल थे। सीटीबी का उपयोग नाभिक एक्यूबेन्स क्षेत्र से सबस्टेंटिया निगरा क्षेत्र तक न्यूरॉन्स के प्रतिगामी ट्रेसिंग के लिए किया जाएगा। वर्तमान प्रोटोकॉल दो अलग-अलग तरीकों से मूल पहचानो प्रोटोकॉल के समायोजन के लिए एक दिशानिर्देश भी प्रदान करता है: 1) अवरुद्ध चरणों में सीरम अभिकर् म को बदलकर पृष्ठभूमि धुंधला की समग्र कमी, और 2) बड़े ऊतक नमूनों के लिए उपयुक्त होने के लिए इनक्यूबेशन समय की स्केलिंग। कुल मिलाकर, वर्तमान प्रोटोकॉल निरंतर सबूत प्रदान करता है कि हाइड्रोफोबिक समाशोधन तकनीक चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों में संभव है, एचआईवी-1 वायरल प्रोटीन के साथ कोई प्रत्यक्ष हानिकारक बातचीत नहीं है, और टीएच एंटीबॉडी, Iba1 एंटीबॉडी और सीटीबी के साथ संगत हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल की समीक्षा की और दक्षिण कैरोलिना विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. स्टॉक समाधान तैयारी

  1. समाधान 1 (1 एल): डिओनाइज्ड एच2ओ के 900 एमएल में 10x फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) के 100 एमएल और ट्राइटन एक्स-100 के 2 एमएल जोड़ें।
  2. समाधान 2 (1 एल): डिओनाइज्ड एच2ओ के 900 एमएल तक, 10x पीबीएस के 100 एमएल, ट्वीन-20 के 2mL और 10 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन स्टॉक सॉल्यूशन के 1 एमएल जोड़ें।
  3. समाधान 3 (500 एमएल): समाधान 1 के 400 एमएल तक, 11.5 ग्राम ग्लाइसिन और 100 एमएल डिमेथाइल्सुमोक्साइड (डीएमएसओ) जोड़ें।
  4. समाधान 4 (50 एमएल): समाधान 1 के 42 एमएल तक, संबंधित सीरम के 3 एमएल और डीएमएसओ के 5 एमएल जोड़ें।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (50 एमएल): समाधान 2 के 46 एमएल तक, डीएमएसओ के 2.5 एमएल और संबंधित सीरम के 1.5 एमएल जोड़ें।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (50 एमएल): समाधान 2 के 48.5 एमएल तक, संबंधित सीरम का 1.5 एमएल जोड़ें।
    नोट: समाधान 4, प्राथमिक समाधान और माध्यमिक समाधान के लिए, एक सीरम का उपयोग करें जो माध्यमिक एंटीबॉडी (जैसे, बकरी, घोड़ा, गोजातीय) से मेल खाती है।

2. नमूना तैयार करना

नोट: पीएफए के संपर्क को सीमित करने के कारण धूम हुड में 2.1 से 2.7 चरण करें।

  1. सेवोफ्लुरन का उपयोग करके युवा (3-6 सप्ताह) चूहे को गहराई से एनेस्थेटाइज करें; चूहा उत्तरदायी नहीं होने पर 2.2 पर आगे बढ़ें और उंगलियों और पूंछ चुटकी का जवाब देने में विफल रहता है।
  2. चूहे को एक रीढ़ की स्थिति में रखें और आइरिस कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके पेट की दीवार के माध्यम से चीरा बनाएं।
  3. रिब पिंजरे के नीचे के माध्यम से रिब पिंजरे के दोनों किनारों पर हंसली मेयो कैंची का उपयोग कर काट ।
  4. एक हीमोस्टेट के साथ दिल और फेफड़ों से दूर उरोस्थि और पसलियों प्रत्यय।
  5. एक परफ्यूजन पंप से जुड़ी 23 जी सुई के साथ बाएं वेंट्रिकल को छेदें और आईरिस कैंची के साथ सही एट्रियम को काटें।
  6. 100 mm (1x) पीबीएस के लगभग 75 एमएल के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन करें।
  7. 1x पीबीएस में बफर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के लगभग 100 मिलीएल के साथ ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन जारी रखें।
  8. संदंश का उपयोग कर खोपड़ी से मस्तिष्क को हटा दें।
  9. एक रेजर ब्लेड और एक चूहा मस्तिष्क मैट्रिक्स का उपयोग करके मस्तिष्क को धनु स्थिति में रखें और 4 बराबर वर्गों (चौड़ाई में लगभग 3 मिमी) में टुकड़ा करें।
  10. एक शक्तिकर्ता पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक सील, 5mL प्लास्टिक ट्यूब में 1x PBS में 4% पीएफए में प्रत्येक अनुभाग को ठीक करें।
  11. 1 घंटे के लिए एक शेखर पर कमरे के तापमान (आरटी) पर 1x PBS में 4% पीएफए में ठीक करने के लिए जारी रखें ।
  12. 30 मिनट, 3 बार के लिए आरटी पर 1x PBS के साथ प्रत्येक अनुभाग धोलें ।

3. निर्जलीकरण और विकृति

  1. आरटी में 1 एच के लिए 20% मेथनॉल/80% डिएकोन्ड वॉटर सॉल्यूशन में सैंपल को इनक्यूबेट करें ।
  2. आरटी में 1 एच के लिए 40% मेथनॉल/60% डिएकोन्ड वॉटर सॉल्यूशन में सैंपल को इनक्यूबेट करें।
  3. आरटी में 1 एच के लिए 60% मेथनॉल/40% डिएकोन्ड वॉटर सॉल्यूशन में सैंपल को इनक्यूबेट करें।
  4. आरटी में 1 एच के लिए 80% मेथनॉल/20% डिएकोन्ड वॉटर सॉल्यूशन में सैंपल को इनक्यूबेट करें।
  5. आरटी में 1 घंटे के लिए 100% मेथनॉल में नमूना इनक्यूबेट करें। 100% मेथनॉल के साथ दोहराएं, आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटिंग करें।
  6. लगभग 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 100% मेथनॉल में नमूना ठंडा करें।
  7. 66% डाइक्लोरोमेथेन (डीसीएम) /33% मेथनॉल समाधान तैयार करें।
  8. आरटी में डीसीएम/मेथनॉल सॉल्यूशन में रात भर सैंपल को इनक्यूबेट करते हैं, जिसमें मिलाते हुए ।
  9. 30 मिनट, 2 बार के लिए आरटी पर मेथनॉल के साथ धोएं।
  10. लगभग 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 100% मेथनॉल में नमूना ठंडा करें।
  11. ठंडा में ब्लीच, हौसले से तैयार 5% हाइड्रोजन पेरोक्साइड मेथनॉल में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  12. आरटी में 1 एच के लिए 80% मेथनॉल/20% डिएकोन्ड वॉटर सॉल्यूशन में सैंपल को इनक्यूबेट करें।
  13. आरटी में 1 एच के लिए 60% मेथनॉल/40% डिएकोन्ड वॉटर सॉल्यूशन में सैंपल को इनक्यूबेट करें।
  14. आरटी में 1 एच के लिए 40% मेथनॉल/60% डिएकोन्ड वॉटर सॉल्यूशन में सैंपल को इनक्यूबेट करें।
  15. आरटी में 1 एच के लिए 20% मेथनॉल/80% डिएकोन्ड वॉटर सॉल्यूशन में सैंपल को इनक्यूबेट करें ।
  16. आरटी में 1 घंटे के लिए 1x पीबीएस में नमूना इनक्यूबेट।
  17. समाधान 1 में आरटी में 1 घंटे के लिए धोएं, 2 बार।

4. हैजा टॉक्सिन सबयूनिट बी लेबलिंग

  1. नाभिक एक्यूबेन साइट में 1 एमएल सिरिंज की सुई टिप डालें।
  2. धीरे-धीरे 20 एस से अधिक 1% बायोटिन-सीटीबी के 2.5 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
  3. सुई टिप को 1 मिनट के लिए छोड़ दें और रिसाव को रोकने के लिए धीरे-धीरे 10 एस से अधिक निकालें।

5. एंटीबॉडी आवेदन

  1. समाधान 3 में नमूने को 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान में इनक्यूबेट करें।
  2. समाधान 4 में 2 दिनों के लिए पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट करें।
  3. पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट।
  4. समाधान 2 में 5 बार के लिए धोएं, प्रति वॉश 1 घंटे इनक्यूबेटिंग करें। रात भर आरटी में समाधान 2 में स्टोर करें।
  5. पानी स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट।
  6. समाधान 2 में 5 बार के लिए धोएं, प्रति वॉश 1 घंटे इनक्यूबेटिंग; रात भर आरटी में समाधान 2 में स्टोर करें।
    नोट: अंतिम भंडारण सहित 5.6 के बाद से सभी कदम कम रोशनी में होने चाहिए। नमूना ट्यूबों एल्यूमीनियम पन्नी के साथ परिरक्षित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में एंटीबॉडी के लिए उपयोग की जाने वाली सांद्रता थी: 1:100 पर TH, 1:200 पर Iba1, और 1:100 पर माध्यमिक एंटीबॉडी। ट्यूब पूरी तरह से भरे हुए हैं सुनिश्चित करने के लिए कदम 5.1-5.6 के लिए अतिरिक्त समाधान 2 जोड़ें ।

6. ऊतक समाशोधन

  1. आरटी में 1 एच के लिए 20% मेथनॉल/80% डिएकोन्ड वॉटर सॉल्यूशन में सैंपल को इनक्यूबेट करें ।
  2. आरटी में 1 एच के लिए 40% मेथनॉल/60% डिएकोन्ड वॉटर सॉल्यूशन में सैंपल को इनक्यूबेट करें।
  3. आरटी में 1 एच के लिए 60% मेथनॉल/40% डिएकोन्ड वॉटर सॉल्यूशन में सैंपल को इनक्यूबेट करें।
  4. आरटी में 1 एच के लिए 80% मेथनॉल/20% डिएकोन्ड वॉटर सॉल्यूशन में सैंपल को इनक्यूबेट करें।
  5. आरटी में 1 घंटे के लिए 100% मेथनॉल में नमूना इनक्यूबेट करें।
  6. आरटी में रात भर ताजा 100% मेथनॉल में इनक्यूबेट।
  7. 3 घंटे के लिए 66% डीसीएम/33% मेथनॉल में इनक्यूबेट, मिलाते हुए, कमरे के तापमान पर।
  8. बिना झटकों के डिबेंज़िल ईथर (डीबीई) में इनक्यूबेट। स्पष्ट होने तक डीबीई में नमूना छोड़ दें और इमेजिंग तक डीबीई में स्टोर करें।

7. बढ़ते

  1. विजिजेट एम 3 क्रिस्टल राल (idisco.info वेबसाइट पर उपलब्ध टेम्पलेट्स) से बना 3डी प्रिंटेड चैंबर प्राप्त करें।
  2. एपॉक्सी का उपयोग करके कक्ष को माइक्रोस्कोप स्लाइड में सुरक्षित करें।
  3. नमूना को कक्ष के बीच में स्क्वायर स्पेस में रखें।
  4. पूरी तरह से डीबीई के साथ चैंबर भरें।
  5. कक्ष के ऊपर 0.17 मिमी मोटी कवरलिप रखें और तब तक दबाव लागू करें जब तक कि कवरस्लिप का कक्ष दीवारों के साथ पूर्ण संपर्क न हो।
  6. एपॉक्सी का उपयोग करके कवर्लिप के किनारों को कक्ष में सील करें।
  7. भरने वाले इनलेट से बचने के लिए हवा के बुलबुले की अनुमति देने के लिए कक्ष घुमाएं।
  8. अतिरिक्त डीबीई के साथ चैंबर भरें।
  9. एपॉक्सी के साथ फिलिंग इनलेट को सील करें और इलाज करने की अनुमति दें।
    नोट: अतिरिक्त DBE बढ़ते के दौरान बाहर फैल जाएगा ।

8. इमेजिंग

  1. 4x आवर्धन पर जेड-स्कैन करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम का उपयोग करें (संलग्न 3D वीडियोदेखें)।
  2. माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा निर्दिष्ट तरंगदैर्ध्य के समान तरंगदैर्ध्य पर उत्सर्जित करने के लिए लेजर सेट का उपयोग करके नमूने का फ्लोरोसेंट उत्तेजन प्राप्त करें। TH उत्तेजन 632 एनएम पर उत्सर्जन करने के लिए एक हेन लेजर सेट का उपयोग करने के लिए प्राप्त किया गया था।
  3. लेजर उत्सर्जन के करीब एक तरंगदैर्ध्य के लिए डिटेक्टर सेट करें। वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए टीएच के लिए डिटेक्टर 650 एनएम निर्धारित किया गया था।
  4. डिटेक्टर का लाभ तब तक उठाएं जब तक कि कोई दृश्यमान संकेत न हो जाए। छवियों के लिए 650LP लाभ 7.50 बी करने के लिए सेट किया गया था।
  5. कॉन्फोकल इमेजिंग सॉफ्टवेयर में स्कैन विकल्प का उपयोग करके, माइक्रोस्कोप चरण को तब तक स्थानांतरित करें जब तक कि नमूना ध्यान में न लाया जाए।
  6. सभी मैदानों में ऊतक के चारों ओर नेविगेट करें और कॉन्फोकल इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके या तो एकल छवियां या जेड-स्टैक छवियां प्राप्त करें।
  7. इमेजिंग पूरी हो जाने के बाद, चेंबर से नमूना निकाल दें। इसे वापस एक ट्यूब में पूरी तरह से DBE से भरा है और एक अंधेरे जगह में आर टी में स्टोर, अधिमानतः एल्यूमीनियम पन्नी में कवर में रखें ।
    नोट: जब तक फ्लोरोसेंस सिग्नल अभी भी मजबूत है तब तक नमूनों को फिर से और इमेज किया जा सकता है।

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Representative Results

F344/N और एचआईवी-1 चूहा मस्तिष्क ऊतक दोनों के बड़े वर्गों की पूर्ण समाशोधन इस संशोधित हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया गया था । चित्रा 1 सब्स्टाटिया निग्रा क्षेत्र में टीएच के लिए एक विशिष्ट कॉन्फोकल छवि प्रदर्शित करता है। चित्रा 1A घने, सकारात्मक धुंधला का प्रतिनिधित्व करता है। सकारात्मक धुंधला और उचित सेल आकृति विज्ञान की पुष्टि करने के लिए "जेड" विमान के माध्यम से ध्यान केंद्रित करके इन जैसे घने क्षेत्रों को पार्स किया जा सकता है। चित्रा 1B विरल सकारात्मक धुंधला है, जो TH न्यूरॉन्स ' अलग आकृति विज्ञान द्वारा पहचाना जा सकता है का प्रतिनिधित्व करता है । चित्रा 1C ऊतक है कि सकारात्मक दाग नहीं है, लेकिन अभी भी पृष्ठभूमि संकेत के कारण हल्के नीले रंग के लिए गहरा है का प्रतिनिधित्व करता है । छवि के क्षेत्र जो पूरी तरह से काले दिखाई देते हैं, उस क्षेत्र में ऊतक की अनुपस्थिति का संकेत देते हैं। छवि में पूरी तरह से काले क्षेत्रों के नमूने के किनारे पर होने के कारण हो सकता है, एक छेद है कि नमूना में है, या ऊतक है कि ध्यान से बाहर है ।

चित्रा 2A 20x आवर्धन पर एक TH सकारात्मक न्यूरॉन की विशिष्ट आकृति विज्ञान से पता चलता है। ठीक से दाग और केंद्रित कॉन्फोकल छवियां आदर्श रूप से अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ उज्ज्वल और कुरकुरा फ्लोरेसेंस दिखाएंगी। एक टीएच पॉजिटिव न्यूरॉन में एक बड़ा सोमा (सेल बॉडी) और कई ब्रांचिंग प्रक्रियाएं16होती हैं। चित्रा 2B Iba1 दाग माइक्रोग्लिया, जो छोटे सेल निकायों और छोटे विस्तार प्रक्रियाओं17है दिखाता है । उचित धुंधला और अपेक्षित सेल आकृति विज्ञान की पुष्टि इमेजिंग में पहला कदम है।

चित्रा 3 एक आदर्श छवि(चित्रा 3 ए)की तुलना तीन अवांछनीय छवियों(चित्रा 3बी-डी)से करता है। चित्रा 3A एक स्पष्ट, अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ सकारात्मक, उज्ज्वल धुंधला दिखाता है । सकारात्मक धुंधला आसानी से पृष्ठभूमि से अलग है। चित्रा 3B बहुत अधिक फ्लोरोसेंट लाभ के साथ एक अनुचित रूप से केंद्रित छवि का एक उदाहरण है। चित्रा 3C एक झूठी सकारात्मक संकेत दिखाता है। चमकीले धब्बे जो बाकी ऊतकों के साथ ध्यान में नहीं हैं, कलाकृतियां हैं और उन्हें सकारात्मक संकेत नहीं माना जाना चाहिए। चित्रा 3 डी एक अवरुद्ध सीरम का उपयोग करने का एक उदाहरण है जो माध्यमिक एंटीबॉडी से मेल नहीं खाती है, जैसा कि मूल iDISCO प्रोटोकॉल4में सुझाव दिया गया है। इस छवि में, बकरी में बने एक माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए गधे सीरम के उपयोग ने उच्च पृष्ठभूमि धुंधला के साथ एक छवि का उत्पादन किया, जो सकारात्मक धुंधला को ठीक से पहचानने की क्षमता को अस्पष्ट करता है।

चित्रा 4A चूहे के मस्तिष्क में सकारात्मक सीटीबी धुंधला दिखाता है । लंबे, पतले फाइबर डोपामिनेर्गिक मार्ग के साथ अफरेंट अनुमान हैं। चित्रा 4B और चित्रा 4C टीएच और सीटीबी का कोलोकैलाइजेशन दिखाते हैं। चित्रा 4 बीमें, इंजेक्शन नाभिक एक्यूबेन्स क्षेत्र में देखा जा सकता है, जो घनी फ्लोरोसेंट ग्रीन सर्कल के रूप में दिखाई देता है। चित्रा 4सी सब्सटेंटिया निगरा क्षेत्र में टीएच और सीटीबी का कोलोकैलाइजेशन प्रदर्शित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: मार्कर, 4x आवर्धन के साथ एक हाइड्रोफोबिकली रूप से साफ किए गए ऊतक नमूने की कॉन्फोकल छवि। }सब्स्तानटिया निगरा क्षेत्र में घना टीएच धुंधला। (ख)सब्सटेंटिया निगरा से सटे विरल टीएच न्यूरॉन्स। (C)ऊतक सकारात्मक TH न्यूरॉन्स की कमी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरोसेंटली लेबल TH सकारात्मक न्यूरॉन्स (20x आवर्धन) और Iba1 सकारात्मक माइक्रोग्लिया (10x आवर्धन) की विशिष्ट आकृति विज्ञान। (A)दो प्रतिनिधि टीएच पॉजिटिव न्यूरॉन्स। (ख)Iba1 सकारात्मक माइक्रोग्लिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: हाइड्रोफोबिकली रूप से साफ किए गए ऊतक, 4x आवर्धन की आदर्श और खराब कॉन्फोकल छवियां। (A)सब्स्टाटिया निगरा क्षेत्र में घने टीएच धुंधला, एक उपयुक्त फ्लोरेसेंस लाभ के साथ ठीक से ध्यान में । (ख)एक अनुचित रूप से केंद्रित और पीढ़ी उजागर छवि । (ग)झूठी सकारात्मक धुंधला । (घ)अनछुए आईडिस्को प्रोटोकॉल का पालन करने के परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि धुंधला हो रही है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: डोपामिनेर्गिक मार्ग, 4x आवर्धन के साथ हैजा टॉक्सिन बी लेबलिंग। (A)सकारात्मक सीटीबी धुंधला की कॉन्फोकल छवि । (ख)टीएच और सीटीबी और न्यूक्लियस एक्यूबेन्स इंजेक्शन साइट की ओवरलैप इमेज । }सब्स्टेंटिया निगरा क्षेत्र में टीएच और सीटीबी का कोलोकलाइजेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

मूवी 1: 4x आवर्धन पर नमूने के जेड-स्कैन की 3डी फिल्म। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ऊतक समाशोधन पारंपरिक आईएचसी प्रोटोकॉल की सीमाओं का समाधान प्रदान करता है। एक नमूना जो पारदर्शी होता है, प्रकाश के बिखरने और अवशोषण को कम करता है, जो18,19को अक्षुण्ण ऊतकों तक सेलुलर स्तर ऑप्टिकल पहुंच प्रदान करता है। ऊतक समाशोधन तकनीक एक ऊतक को सॉल्वैंट्स के प्रशासन के साथ परिसीमन, विच्छेदन और विसुत्व के माध्यम से पारदर्शी बनाता है। एक बार जब ऊतक नमूने का अपवर्तक सूचकांक चुने हुए इमेजिंग माध्यम के अपवर्तक सूचकांक से मेल खाता है, तो नमूना पूरी तरह से पारदर्शी दिखाई देगा और ठीक से3इमेज किया जा सकता है। वर्तमान हाइड्रोफोबिक प्रोटोकॉल प्रारंभिक निर्जलीकरण चरणों में ऊतक से पानी निकालता है, इस प्रकार प्रकाश बिखराव को कम करता है। ऊतक को प्रीट्रीटमेंट के दौरान गहरे एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति देने के लिए पार किया जाता है। ऊतक जो प्रोटोकॉल से गुजरा है, आसानी से संभाला जा सकता है और कई बार इमेज किया जा सकता है। यदि ठीक से संग्रहीत किया जाता है, तो ऊतक अभी भी प्रारंभिक प्रसंस्करण के बाद एक साल तक छवियां प्रदान कर सकते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम F344/N और एचआईवी-1 टीजी चूहा मस्तिष्क ऊतक नमूनों के लिए एक हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन तकनीक लागू करने के लिए TH, Iba1, और CTB के लिए दाग । समाशोधन के बाद, ऊतक के नमूनों को एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल में अन्य हाइड्रोफोबिक प्रोटोकॉल पर कई फायदे हैं, जैसे iDISCO4। सबसे पहले, मूल iDISCO प्रोटोकॉल चूहों के ऊतकों में उपयोग के लिए मान्य किया गया था, जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल चूहे मस्तिष्क ऊतक में व्यवहार्य है। दूसरा, प्रत्येक चरण पर समायोजित इनक्यूबेशन बार तकनीक को बड़े ऊतक वर्गों के लिए उपयोग करने की अनुमति देता है। तीसरा, एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के दौरान इसी सीरम सहित (जैसा कि एक सामान्य सीरम के उपयोग के विपरीत) विश्लेषण के लिए स्पष्ट छवियां प्रदान करता है।

जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल व्यक्तिगत अनुसंधान प्रश्नों की जरूरतों के अनुरूप आसानी से अनुकूलनीय है, कई महत्वपूर्ण विचार हैं। प्रोटोकॉल शुरू से अंत तक लगातार 26 दिन लेता है । ऊपर बताए गए से अधिक समय तक समाधान में नमूना न छोड़ें। नमूना, हालांकि, इमेजिंग तक सुरक्षित रूप से कम से कम 6 महीने के लिए प्रोटोकॉल के अंत में डीबीई में संग्रहीत किया जा सकता है, हालांकि इसे जितनी जल्दी हो सके छवि की सलाह दी जाती है। एक 3 डी मुद्रित कक्ष ऑर्डर करें जो माइक्रोस्कोप स्लाइड और कवरलिप के बीच नमूने को चुस्त रूप से फिट करेगा। समाधान 1 के अलावा सभी स्टॉक समाधान, उस दिन के उपयोग के लिए उपयुक्त राशि में दिन-ब-दिन मिश्रित थे। जब भी क्रॉस संदूषण को रोकने के लिए नया समाधान पेश किया जाता है तो नमूने को एक नई ट्यूब में ले जाया जाना चाहिए। यदि माइक्रोबियल विकास चिंता का विषय है, तो सोडियम एजाइड को समाधान 2, समाधान 3, समाधान 4, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान और कुल समाधान में 0.02% की एकाग्रता पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में जोड़ा जा सकता है।

कुल मिलाकर, वर्तमान तकनीक एक बेहद बहुमुखी, लागू करने में आसान और कम लागत वाली प्रक्रिया है जो कई एंटीबॉडी के साथ संगत है। इस प्रोटोकॉल के साथ कि दोनों F344/N नियंत्रण और एचआईवी-1 टीजी चूहों में काम करने के लिए मांय है, कई नए खोजी अनुसंधान सवालों के जवाब दिया जा सकता है ।

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Disclosures

किसी भी लेखक के पास घोषित करने के लिए हितों के टकराव नहीं हैं ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 और T32 प्रशिक्षण अनुदान द्वारा 5T32GM081740

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 Invitrogen C34775
DBE Sigma-Aldrich 108014-1KG
DCM Sigma-Aldrich 270997-100mL
DMSO Sigma-Aldrich 472301-1L
Glycine Fisher Chemical G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 Invitrogen A32733
Goat serum Sigma Life Science G9023-10mL
Heparin Acros Organics 41121-0010
Iba1 primary antibody FUJIFILM Wako 019-19741
Kwik-sil epoxy VWR 70730-062
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1l-R
PBS Fisher Bioreagents BP2944-100
Perfusion machine VWR 70730-062 mini pump variable flow
PFA Sigma-Aldrich 158127-3KG
TH primary antibody Millipore Sigma AB152
TritonX-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Tween-20 Fisher Bioreagents BP337-500

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 166 ऊतक समाशोधन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री आईडिको मस्तिष्क चूहा कॉन्फोकल
चूहा मस्तिष्क ऊतक के लिए एक हाइड्रोफोबिक ऊतक समाशोधन विधि
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Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A.… More

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A. R., Harrod, S. B., Mactutus, C. F., Booze, R. M. A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (166), e61821, doi:10.3791/61821 (2020).

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