ラット脳組織の疎水性組織除去法

Summary

ここでは、インタクトな脳構造の一部として標的分子を観察することを可能にする疎水性組織クリアリング法を提示する。この技術は現在、両方の男女のF344/ NコントロールおよびHIV-1トランスジェニックラットについて検証されている。

Abstract

疎水性組織のクリアリング方法は、容易に調整可能で、速く、そして、不変の組織サンプルの目的の分子の研究を可能にする低コストのプロシージャである。従来の免疫標識法では、サンプルを薄い部分に切断する必要があり、無傷の構造にラベルを付け、検査する能力が制限されます。しかし、処理中に脳組織がそのまま残る場合、構造や回路は解析のためにそのまま残ることができます。以前に確立された清算方法は、組織を完全にクリアするのにかなりの時間がかかり、過酷な化学物質はしばしば敏感な抗体を損傷する可能性があります。iDISCO法は、組織を迅速かつ完全にクリアし、多くの抗体と互換性があり、特別なラボ機器を必要としません。この技術は、マウス組織での使用のために最初に検証されたが、現在のプロトコルは、制御およびトランスジェニックラット脳の半球を画像化するためにこの方法を適応させる。これに加えて、本プロトコルは、より少ない背景染色でより鮮明な画像を提供するために、既存のプロトコルにいくつかの調整を行います。Iba-1およびチロシンヒドロキシラーゼに対する抗体は、本疎水性組織除去法を用いてHIV-1トランスジェニックラット及びF344/N対照ラットで検証された。脳は、構造が互いに別々よりも頻繁に一緒に働く織り交ぜられたネットワークです。個々の部分の組み合わせとは対照的に、システム全体として脳を分析することは、この脳全体のクリアリング方法の最大の利点です。

Introduction

いくつかの組織クリアリング技術は、脳内での使用のために検証されている:ヒドロゲル、親水性、および疎水性。これらの技術は、溶媒の投与を介して脱脂、脱色、および脱灰を通じて組織を透明にすることを目指しています。組織試料の屈折率が選択した撮像媒体の屈折率と一致すると、サンプルの鮮明な画像が得られる。CLARITYなどのヒドロゲルベースの技術は、それらをアクリルベースのヒドロゲルにリンクすることによって組織中の生体分子を固定し、タンパク質^の構造的損傷および損失を防ぐ。しかし、ヒドロゲル技術は、より脆弱な組織を損傷する可能性を持つよりも過酷な化学物質を利用し、より密度の高い組織サンプルはヒドロゲルプロトコルと互換性がない可能性があります。ある種のヒドロゲル技術は、高価な機器を必要とするか、組織の膨張につながる可能性があります。親水性の技術は、CUBICのような、組織内の水素結合の形成を通じて3D構造を保存^する2。組織の膨張はまた、特定の親水性プロトコルで起こり得る。親水性技術のクリア能は、疎水性技術が有する能力と一致しないことが多く、これはより密度が高く、より厚い組織³にとって重要である。

疎水性の技術は、通常、高速で、特別な機器を必要とせず、取り扱い、保管が容易なサンプルを製造します。iDISCOは、他の疎水性プロトコルで起こり得る収縮を排除する疎水性技術です。もともと、iDISCO組織除去技術は、マウスの胚および緻密な成人器官に対するRenier et⁴ によって記述された。この技術は、初期脱水工程で組織から水分を除去し、光散乱を低減させる。組織は、深い抗体の浸透を可能にするために、前処理中に透過化されます。遠赤色スペクトルのアレクサ蛍光色素は、低波長⁵で組織の自己蛍光を避けるために免疫標識に使用される。疎水性のクリアリングプロトコルを受けた組織は容易に扱うことができる、Alexa Fluor染料の長寿のために数回イメージすることができる。適切に保存されていれば、組織は初期処理後数ヶ月から1年の画像を提供することができます。

本プロトコルにおいて、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体、Iba1抗体、およびコレラ毒素サブユニットB(CTB)は、男性および女性の両方のコントロールおよびHIV-1トランスジェニック(Tg)ラット脳に使用された。HIV-1 Tgラットは、HIV-1ウイルスゲノムを構成する9つの遺伝子のうち7個を有し、これは長期HIV-1タンパク質暴露^6、7、8の非感染モデルをもたらす。ドーパミン作動性変化は、HIV-1 Tgラットで以前に実証されており、HIV-1自体は炎症性疾患であるため、抗体選択は実験計画^{9、10、11、12}に関連していた。CTBは、神経節側結合を介してニューロンに付着し、脳内の発泡性突起を追跡するために使用することができるトレーサーです。CTBは以前、副坐核から実質的なニグラ領域への突起を研究するために使用されてきたが、ドーパミン作動経路^13、14、15に深く関与する脳の2つの領域。

このプロトコルでは、THはドーパミン産生のマーカーとして機能し、Iba1は活性化ミクログリアをマークします。TH抗体は、チロシンヒドロキシラーゼに対応する約62kDaで単一のバンドを選択的に標識します。Iba1抗体は、Iba1カルボキシ末端配列に対応します。両方の抗体はウサギで育てられ、ポリクローナルであった。CTBは、核accumbens領域から実質的なニグラ領域へのニューロンの逆行トレースに使用されます。現在のプロトコルはまた、2つの異なる方法で元のiDISCOプロトコルの調整のためのガイドラインを提供しています:1)ブロッキングステップで血清試薬を変更することによってバックグラウンド染色の全体的な減少、および2)より大きな組織サンプルに適したインキュベーション時間のスケーリング。全体として、本プロトコルは、疎水性除去技術がラットの脳組織において実現可能であり、HIV-1ウイルスタンパク質との識別可能な有害相互作用を有せず、TH抗体、Iba1抗体およびCTBと互換性があるという継続的な証拠を提供する。

Protocol

すべての動物のプロトコルは、サウスカロライナ大学の動物ケアと使用委員会によって見直され、承認されました。

1. ストックソリューションの準備

1. 溶液1(1 L):900mLの脱イオン化_H2Oは、100mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と2mLのトリトンX-100を加える。
2. 溶液2(1 L):脱イオン化_H2Oの900mLに、10x PBSの100mL、Tween-20の2mL、10mg/mLヘパリンストック溶液の1mLを加える。
3. 溶液3(500mL):溶液1の400mLに、グリシン11.5gとジメチルスルホキシド(DMSO)100mLを加える。
4. 溶液4(50mL):溶液1の42mLに、対応する血清3 mLとDMSOの5 mLを加える。
5. 一次抗体溶液(50 mL):溶液2の46mLに、DMSOの2.5mLおよび1.5mLの対応する血清を加える。
6. 二次抗体溶液(50 mL):溶液2の48.5mLに、対応する血清1.5mLを加える。
   注:溶液4、一次溶液、および二次溶液については、二次抗体(例えば、ヤギ、馬、ウシ)に対応する血清を使用してください。

2. サンプル準備

注:PFAへの露出を制限するため、ヒュームフードでステップ2.1〜2.7を実行してください。

1. セボフルランを使用して若い(3-6週間)ラットを深く麻酔します。ラットが応答せず、つま先と尾のピンチに応答しない場合は2.2に進みます。
2. ラットを仰向けの位置に置き、アイリスはさみを使用して腹壁を切開します。
3. マヨはさみを使用して、リブケージの両側の鎖骨にリブケージの底を切り抜きます。
4. 胸骨と肋骨を心臓と肺から離し、止まり止めをします。
5. 灌流ポンプに取り付けられた23G針で左心室を突き刺し、アイリスハサミで右心房を切ります。
6. 約75mLの100mM(1x)PBSで経心面灌流を行います。
7. 1x PBSで約100mLのパラホルムアルデヒド(PFA)緩衝を行い、経心透交を続けます。
8. 鉗子を使用して頭蓋骨から脳を取り除く。
9. 脳を矢状位置に置き、カミソリの刃とラットの脳マトリックスを使用して4等分(幅約3mm)にスライスします。
10. 各セクションを1x PBSで4%PFAで密閉し、5mLプラスチックチューブを4°Cで一晩シェーカーで固定します。
11. シェーカー上で1時間、室温(RT)で1x PBSで4%PFAで1時間固定を続けます。
12. RTで各セクションを1x PBSで30分間3回洗浄します。

3. 脱水・脱色

1. 試料を20%メタノール/80%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間たたきます。
2. サンプルを40%メタノール/60%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間行います。
3. サンプルを60%メタノール/40%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間たたきます。
4. サンプルを80%メタノール/20%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間培養します。
5. RTで100%メタノールで100%メタノールでサンプルをインキュベートし、100%メタノール以上で繰り返し、RTで1時間インキュベートする。
6. サンプルを4°Cで100%メタノールで約10分間冷やします。
7. 66%ジクロロメタン(DCM)/33%メタノール溶液を調製します。
8. サンプルをDCM/メタノール溶液に一晩RTでインキュベートし、振盪します。
9. RTでメタノールを30分、2回洗浄します。
10. サンプルを4°Cで100%メタノールで約10分間冷やします。
11. 冷蔵し、4°Cで一晩メタノール中に5%過酸化水素を調製した漂白剤。
12. サンプルを80%メタノール/20%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間培養します。
13. サンプルを60%メタノール/40%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間たたきます。
14. サンプルを40%メタノール/60%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間行います。
15. 試料を20%メタノール/80%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間たたきます。
16. サンプルを1x PBSで1時間RTでインキュベートする。
17. 溶液1をRTで1時間、2回洗浄する。

4. コレラ毒素サブユニットBラベル

1. 1 mL シリンジの針先を、直腸核部位に挿入します。
2. 20秒以上の1%ビオチン-CTBの2.5 μLをゆっくりと注入する。
3. 針先を1分間所定の位置に置き、漏れを防ぐために10s以上ゆっくりと取り外します。

5. 抗体アプリケーション

1. 溶液3のサンプルを水浴中の37°Cで2日間インキュベートする。
2. 溶液4のサンプルを水浴中の37°Cで2日間インキュベートする。
3. 一次抗体を水浴中の37°Cで7日間インキュベートする。
4. 溶液2で5回洗浄し、1回の洗浄につき1時間インキュベートする。一晩RTでソリューション2に保存します。
5. 二次抗体を水浴中の37°Cで7日間インキュベートする。
6. 溶液2で5回洗浄し、1回の洗浄につき1時間のインキュベート。一晩RTでソリューション2に保管してください。
   注: 5.6 以降のすべてのステップ (最終ストレージを含む) は、低照度で行う必要があります。サンプル管はアルミニウムホイルによって保護することができる。このプロトコルで抗体に使用された濃度は、TH 1:100、Iba1 1:200、2次抗体1:100でした。手順 5.1 ~ 5.6 にソリューション 2 を追加して、チューブが完全に充填されるようにします。

6. 組織のクリアリング

1. 試料を20%メタノール/80%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間たたきます。
2. サンプルを40%メタノール/60%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間行います。
3. サンプルを60%メタノール/40%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間たたきます。
4. サンプルを80%メタノール/20%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間培養します。
5. 試料を100%メタノールで1時間RTでインキュベートする。
6. RTで一晩新鮮な100%メタノールでインキュベート。
7. 66%DCM/33%メタノールで3時間、振動しながら室温でインキュベートする。
8. ジベンジルエーテル(DBE)を振らずにインキュベートする。透明になるまでサンプルを DBE に残し、イメージングまで DBE に保存します。

7. 取り付け

1. Visijet M3クリスタル樹脂(idisco.info のウェブサイトで入手可能なテンプレート)で作られた3Dプリントチャンバーを入手してください。
2. エポキシを使用して顕微鏡スライドにチャンバーを固定します。
3. チャンバーの中央にある正方形のスペースにサンプルを置きます。
4. チャンバーをDBEで完全に充填します。
5. 厚さ0.17mmのカバースリップをチャンバーの上に置き、カバースリップがチャンバーの壁に完全に接触するまで圧力を加えます。
6. エポキシを使用して、カバースリップの端をチャンバーに密封します。
7. チャンバーを回転させて、気泡が充填入口から抜け出せるようにします。
8. 追加のDBEでチャンバーを充填します。
9. 充填インレットをエポキシで密封し、治癒を許可します。
   メモ:マウント中に余分なDBEがこぼれます。

8. イメージング

1. 共焦点顕微鏡システムを使用して、4倍の倍率でZスキャンを実行します(付属の 3Dビデオを参照)。
2. 二次抗体で指定された波長と同様の波長で発光するレーザーセットを用いて、試料の蛍光励起を実現します。TH励起は、632nmで発光するように設定されたHeNeレーザーを利用して達成された。
3. 検出器をレーザー放射に近い波長に設定します。本プロトコルについては、THの検出器を650nmに設定した。
4. 目に見える信号が出るまで検出器のゲインを上げます。画像の650LPゲインは7.50 Bに設定されました。
5. 共焦点イメージングソフトウェアの スキャン オプションを使用して、サンプルが焦点になるまで顕微鏡のステージを移動します。
6. すべての平野の組織を移動し、共焦点イメージングソフトウェアを使用して単一の画像またはZスタック画像を取得します。
7. イメージングが完了したら、チャンバーからサンプルを取り出します。DBEで完全に充填されたチューブに戻し、RTで暗い場所に保管し、好ましくはアルミホイルで覆います。
   注: サンプルは、蛍光信号が依然として強い場合に限り、再マウントおよびイメージ化できます。

Representative Results

F344/NおよびHIV-1ラットの両方の脳組織の大きなセクションの完全なクリアは、この修飾された疎水性組織クリアリングプロトコルを使用して達成された。 図1 は、立証ニグラ領域におけるTHの典型的な共焦点像を示す。 図1Aは 、密な正の染色を示す。このような密集した領域は、正の染色と適切な細胞形態を確認するために「Z」平面を通して焦点を合わせると解析することができます。 図1B は、THニューロンの明確な形態によって同定することができる疎な陽性染色を表す。 図1C は、積極的に染色されていないが、バックグラウンド信号のためにまだ濃い青色の組織を表しています。完全に黒く表示される画像の領域は、その領域に組織が存在しなくなることを示しています。画像内の完全に黒い領域は、サンプルの端にあるか、サンプル内にある穴、または焦点が合っていない組織に起因する可能性があります。

図2A は、20倍倍の倍率でTH陽性ニューロンの典型的な形態を示す。適切に染色され、焦点を合わせる共焦点画像は、理想的には暗い背景に対して明るく鮮明な蛍光を示します。TH陽性ニューロンは、大きなソーマ(細胞体)といくつかの分岐プロセス¹⁶を有する。 図2B は、小細胞体と短い拡張プロセス¹⁷を有するIba1染色ミクログリアを示す。適切な染色と期待される細胞形態の確認は、イメージングの最初のステップです。

図3 は、理想的な画像(図3A)を3つの望ましくない画像(図3B-D)と比較します。 図3Aは 、明瞭で暗い背景に対する正の明るい染色を示しています。正の染色は、背景と容易に区別可能である。 図3B は、蛍光利得が多すぎる不適切に焦点を合わせる画像の一例である。 図3C は、偽陽性信号を示す。組織の残りの部分と焦点を合っていない明るいスポットは、アーティファクトであり、肯定的な信号として考慮されるべきではありません。 図3D は、元のiDISCOプロトコル⁴で示唆されているように、二次抗体と一致しないブロッキング血清を用いた例である。この画像では、ヤギで作られた二次抗体にロバ血清を使用すると、高いバックグラウンド染色を有する画像が生成され、陽性染色を適切に識別する能力が不明瞭になります。

図4Aは 、ラット脳における陽性CTB染色を示す。長く、薄い繊維はドーパミン作動性経路に沿って無フェレント突起である。 図4B および 図4C は、THおよびCTBの共局在化を示す。 図4Bでは、噴射は、高い蛍光性緑色の円として現れる付着核領域で見ることができる。 図4C は、立証ニグラ領域におけるTH及びCTBの共局在化を示す。

図1:マーカーを用いて疎水的にクリアされた組織試料の共焦点像、4倍の倍率。(A)立体ニグラ領域での密TH染色。(B)立証ニグラに隣接するスパースTHニューロン。(C) 陽性THニューロンを欠いている組織。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:蛍光標識TH陽性ニューロン(20倍倍)およびIba1陽性ミクログリア(10倍倍)の典型的な形態。(A) 2つの代表的なTH陽性ニューロン。(B) Iba1陽性ミクログリア この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:疎水性クリア組織の理想的で貧弱な共焦点画像、4倍の倍率。(A)立体ニグラ領域での密TH染色は、適切な蛍光ゲインで適切に焦点を合わせる。(B) 不適切に焦点を合わせ、過度に露出した画像。(C)偽陽性染色。(D) 変更されていない iDISCO プロトコルに従った結果として高いバックグラウンド染色。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:コレラ毒素Bはドーパミン作動性経路に沿って標識し、4倍の倍率を示す。(A) 陽性CTB染色の共焦点像。(B) THとCTBと核accumbens注射部位の重なり画像。(C)立証ニグラ領域におけるTHとCTBの共局在化 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

動画1:4倍倍率でサンプルのZスキャンの3Dムービー。こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。

Discussion

組織のクリアリングは、従来のIHCプロトコルの限界に対するソリューションを提供します。透明な試料は、光の散乱および吸収を最小限に抑え、無傷の組織^18,19への細胞レベルの光学的アクセスを提供する。組織クリア技術は、脱脂、脱色、および溶媒の投与による脱灰によって組織を透明にする。組織試料の屈折率が選択した撮像媒体の屈折率と一致すると、サンプルは完全に透明に見え、適切に画像化できる^3。本疎水性プロトコルは、初期脱水工程で組織から水を除去し、光散乱を低減させる。組織は、深い抗体の浸透を可能にするために、前処理中に透過化されます。プロトコルを受けた組織は容易に扱うことができるし、数回イメージすることができる。適切に保存されていれば、組織は初期処理後1年間まで画像を提供することができます。

本プロトコルでは、Th、Iba1、CTBの染色にF344/NおよびHIV-1 Tgラット脳組織サンプルに疎水性組織除去技術を適用する。クリア後、組織試料を共焦点顕微鏡を用いて画像化した。本プロトコルには、iDISCO⁴のような他の疎水性プロトコルに対していくつかの利点があります。まず、元のiDISCOプロトコルをマウス組織で使用することが検証され、本プロトコルはラットの脳組織で実行可能である。第二に、各ステップで調整されたインキュベーション時間は、より大きな組織切片に使用される技術を可能にする。第3に、抗体インキュベーション中の対応する血清を含む(一般的な血清の使用とは対照的に)分析のためのより鮮明な画像を提供する。

本プロトコルは、個々の研究課題のニーズに合わせて容易に適応可能であるが、いくつかの重要な考慮事項がある。このプロトコルは、開始から終了まで、最低でも 26 日間連続します。上記よりも長い間、サンプルをソリューションに残さないで下さい。しかし、このサンプルは、できるだけ早く画像化することが推奨されるが、イメージングまで少なくとも6ヶ月間、プロトコルの最後にDBEに保存することができる。顕微鏡スライドとカバースリップの間にぴったりとサンプルを収める3Dプリントチャンバーを注文します。ソリューション 1 を除くすべてのストック ソリューションは、その日の使用に適した量で日を混合しました。クロス汚染を防ぐために新しい溶液が導入されるたびに、サンプルを新しいチューブに移動する必要があります。微生物の増殖が懸念される場合、溶液2、溶液3、溶液4、一次抗体溶液、および二次抗体溶液を全溶液中の0.02%の濃度で添加することができる。

全体的に見て、本技術は、多くの抗体と互換性のある非常に汎用性の高い、実装が容易で、低コストの手順です。F344/NコントロールとHIV-1 Tgラットの両方で動作することが検証されたこのプロトコルを使用すると、多くの新しい調査研究の質問に答えることができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Goat serum	Sigma Life Science	G9023-10mL
Heparin	Acros Organics	41121-0010
Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil epoxy	VWR	70730-062
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Fisher Bioreagents	BP2944-100
Perfusion machine	VWR	70730-062	mini pump variable flow
PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH primary antibody	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Tween-20	Fisher Bioreagents	BP337-500