Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En hydrofob vevsryddingsmetode for rottehjernevev

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/61821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

Her presenterer vi en hydrofob vevsryddingsmetode som gjør det mulig å se på målmolekyler som en del av intakte hjernestrukturer. Denne teknikken er nå validert for F344/N-kontroll og HIV-1 transgene rotter av begge kjønn.

Abstract

Hydrofobe vevsryddingsmetoder er lett justerbare, raske og rimelige prosedyrer som gjør det mulig å studere et molekyl av interesse for uendret vevsprøver. Tradisjonelle immunmerkende prosedyrer krever å kutte prøven i tynne seksjoner, noe som begrenser evnen til å merke og undersøke intakte strukturer. Men hvis hjernevev kan forbli intakt under behandling, kan strukturer og kretser forbli intakte for analysen. Tidligere etablerte clearingmetoder tar betydelig tid å fjerne vevet helt, og de harde kjemikaliene kan ofte skade følsomme antistoffer. iDISCO-metoden fjerner raskt og fullstendig vev, er kompatibel med mange antistoffer, og krever ikke noe spesielt laboratorieutstyr. Denne teknikken ble opprinnelig validert for bruk i musvev, men den nåværende protokollen tilpasser denne metoden til bildehalvdeler av kontroll og transgene rottehjerner. I tillegg til dette gjør den nåværende protokollen også flere justeringer i eksisterende protokoll for å gi klarere bilder med mindre bakgrunnsfarging. Antistoffer mot Iba-1 og tyrosinhydroksylase ble validert i HIV-1 transgen rotte og hos F344/N kontrollrotter ved hjelp av den nåværende hydrofobe vevsryddingsmetoden. Hjernen er et sammenvevd nettverk, hvor strukturer fungerer sammen oftere enn separat av hverandre. Å analysere hjernen som et helt system i motsetning til en kombinasjon av individuelle brikker er den største fordelen med hele denne hjerneryddingsmetoden.

Introduction

Flere vevsryddingsteknikker er validert for bruk i hjernen: hydrogel, hydrofil og hydrofob. Disse teknikkene tar sikte på å gjøre et vev gjennomsiktig gjennom delipidasjon, decolorization og dekalcification via administrering av løsningsmidler. Når brytningsindeksen til vevsprøven samsvarer med brytningsindeksen til det valgte bildemediet, kan et klart bilde av prøven oppnås. Hydrogelbaserte teknikker, som CLARITY, sikrer biomolekyler i vevet ved å koble dem til akrylbaserte hydrogeler, noe som forhindrer strukturell skade og tap av proteiner1. Hydrogelteknikker bruker imidlertid sterke kjemikalier enn potensialet til å skade mer skjøre vev, og tettere vevsprøver er kanskje ikke kompatible med hydrogelprotokoll. Visse hydrogelteknikker kan kreve dyrt utstyr eller føre til vevsutvidelse. Hydrofile teknikker, som CUBIC, bevarer 3D-struktur gjennom dannelsen av hydrogenbindinger i vevet2. Vevsutvidelse kan også forekomme i visse hydrofile protokoller. Clearing evnen til hydrofile teknikker samsvarer ofte ikke med evnen som hydrofobe teknikker har, noe som er viktig for tettere og tykkere vev3.

Hydrofobe teknikker er vanligvis raske, krever ikke spesialutstyr og produserer en prøve som er lett å håndtere og lagre. iDISCO er en hydrofob teknikk som eliminerer krympingen som kan forekomme i andre hydrofobe protokoller. Opprinnelig ble iDISCO vevsryddingsteknikken beskrevet av Renier et al.4 for embryoer og tette, voksne organer av mus. Denne teknikken fjerner vann fra vevet i det første dehydreringstrinnet, og reduserer dermed lysspredningen. Vev permeabiliseres under forbehandling for å tillate dyp antistoff penetrasjon. Alexa Fluor fargestoffer i det fjerne røde spekteret brukes til immunisolering for å unngå autofluorescence av vevet ved lavere bølgelengder5. Vev som har gjennomgått hydrofobe clearingprotokoller, kan håndteres enkelt og kan avbildes flere ganger på grunn av levetiden til Alexa Fluor-fargestoffene. Hvis det er riktig lagret, kan vev gi bilder i måneder til et år etter første behandling.

I den nåværende protokollen ble tyrosinhydroksylase (TH) antistoff, Iba1 antistoff og Cholera Toxin Subunit B (CTB) brukt på både mannlig og kvinnelig kontroll og HIV-1 transgene (Tg) rottehjerner. HIV-1 Tg-rotten har syv av de ni genene som utgjør HIV-1-virusgenomet, noe som fører til en ikke-smittsom modell av langsiktig HIV-1 proteineksponering6,7,8. Dopaminerge endringer har tidligere blitt demonstrert i HIV-1 Tg-rotten, og HIV-1 selv er en inflammatorisk sykdom, så antistoffvalget var relevant for eksperimentell design9,10,11,12. CTB er en tracer som festes til nevroner via ganglioside binding og kan brukes til å spore afferent projeksjoner i hjernen. CTB har tidligere blitt brukt til å studere projeksjoner fra kjernen accumbens til substantia nigra området, to områder av hjernen tungt involvert med dopaminerge veier13,14,15.

I denne protokollen vil TH fungere som en markør for dopaminproduksjon, og Iba1 vil markere aktivert mikroglia. TH-antistoffet som brukes selektivt, merker et enkelt bånd på ca. 62 kDa som tilsvarer tyrosinhydroksylase. Iba1-antistoffet tilsvarer Iba1 karboksy-terminalsekvensen. Begge antistoffene ble oppdratt hos kanin og var polyklonale. CTB vil bli brukt til retrograd sporing av nevroner fra kjernen accumbens området til substantia nigra området. Den nåværende protokollen tilbyr også en retningslinje for justering av den opprinnelige iDISCO-protokollen på to forskjellige måter: 1) total reduksjon av bakgrunnsfargingen ved å endre serumreagensene i blokkeringstrinnene, og 2) skalering av inkubasjonstiden for å være egnet for større vevsprøver. Samlet sett gir den nåværende protokollen fortsatt bevis på at hydrofobe clearing teknikker er gjennomførbare i hjernen vev av rotte, har ingen merkbar skadelig interaksjon med HIV-1 virale proteiner, og er kompatible med TH antistoff, Iba1 antistoff, og CTB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprotokoller ble gjennomgått og godkjent av Animal Care and Use Committee ved University of South Carolina.

1. Klargjøring av lagerløsning

  1. Løsning 1 (1 L): Til 900 ml deionisert H2O tilsett 100 ml 10x fosfatbufret saltvann (PBS) og 2 ml Triton X-100.
  2. Oppløsning 2 (1 L): Til 900 ml deionisert H2O, tilsett 100 ml 10x PBS, 2 ml Tween-20 og 1 ml 10 mg/ml Heparin lagerløsning.
  3. Løsning 3 (500 ml): Til 400 ml oppløsning 1 tilsettes 11,5 g glycin og 100 ml dimetylsulfoksid (DMSO).
  4. Løsning 4 (50 ml): Til 42 ml oppløsning 1 tilsetts 3 ml tilsvarende serum og 5 ml DMSO.
  5. Primær antistoffoppløsning (50 ml): Til 46 ml oppløsning 2 tilsetter du 2,5 ml DMSO og 1,5 ml tilsvarende serum.
  6. Sekundær antistoffoppløsning (50 ml): Til 48,5 ml oppløsning 2 tilsett 1,5 ml tilsvarende serum.
    MERK: For løsning 4, primærløsning og sekundær oppløsning, bruk et serum som tilsvarer det sekundære antistoffet (f.eks. geit, hest, storfe).

2. Prøvepreparering

MERK: Utfør trinn 2.1 til 2.7 i en avtrekkshette på grunn av begrensning av eksponeringen for PFA.

  1. Dypt bedøvet ung (3-6 uker) rotte ved hjelp av sevofluran; fortsett til 2,2 når rotten ikke er responsiv og ikke reagerer på tå- og haleklemme.
  2. Legg rotten i en liggende stilling og gjør et snitt gjennom bukveggen ved hjelp av et par Iris saks.
  3. Skjær opp gjennom bunnen av ribbeburet til kragebeinet på begge sider av ribbeburet ved hjelp av Mayo saks.
  4. Fest brystbenet og ribbeina vekk fra hjertet og lungene med en hemostat.
  5. Pierce venstre ventrikel med en 23 G nål festet til en perfusjonspumpe og kutt høyre atrium med Iris saks.
  6. Utfør transkardiale perfusjoner med ca. 75 ml 100 mM (1x) PBS.
  7. Fortsett transkardiale perfusjon med ca. 100 ml 4 % paraformaldehyd (PFA) bufret i 1x PBS.
  8. Fjern hjernen fra skallen ved hjelp av tang.
  9. Plasser hjernen i sagittal posisjon og skjær i 4 like deler (ca. 3 mm i bredde) ved hjelp av et barberblad og en rottehjernematrise.
  10. Fest hver seksjon i 4% PFA i 1x PBS i et forseglet plastrør på 5 ml over natten ved 4 °C på en shaker.
  11. Fortsett å fikse i 4% PFA i 1x PBS ved romtemperatur (RT) på en shaker i 1 time.
  12. Vask hver seksjon med 1x PBS på RT i 30 min, 3 ganger.

3. Dehydrering og depigmentering

  1. Inkuber prøven i en 20 % metanol/80 % avionisert vannløsning i 1 time ved RT.
  2. Inkuber prøven i en 40 % metanol/60 % avionisert vannløsning i 1 time ved RT.
  3. Inkuber prøven i en 60 % metanol/40 % avionisert vannløsning i 1 time ved RT.
  4. Inkuber prøven i en 80 % metanol/20 % avionisert vannløsning i 1 time ved RT.
  5. Inkuber prøven i 100% metanol i 1 time ved RT. Gjenta med mer 100% metanol, inkuberende i 1 time ved RT.
  6. Kjøl prøven i 100 % metanol ved 4 °C i ca. 10 minutter.
  7. Forbered en 66% dichloromethane (DCM) / 33% metanoloppløsning.
  8. Inkuber prøven over natten i DCM/metanol-løsningen ved RT, med risting.
  9. Vask med metanol på RT i 30 min, 2 ganger.
  10. Kjøl prøven i 100 % metanol ved 4 °C i ca. 10 minutter.
  11. Blekemiddel i kjølt, nylaget 5% hydrogenperoksid i metanol over natten ved 4 ° C.
  12. Inkuber prøven i en 80 % metanol/20 % avionisert vannløsning i 1 time ved RT.
  13. Inkuber prøven i en 60 % metanol/40 % avionisert vannløsning i 1 time ved RT.
  14. Inkuber prøven i en 40 % metanol/60 % avionisert vannløsning i 1 time ved RT.
  15. Inkuber prøven i en 20 % metanol/80 % avionisert vannløsning i 1 time ved RT.
  16. Inkuber prøven i 1x PBS i 1 time ved RT.
  17. Vask i oppløsning 1 i 1 time ved RT, 2 ganger.

4. Kolera toksin Subenhet B merking

  1. Sett nålespissen på 1 ml sprøyte inn i nukleus accumbens stedet.
  2. Injiser sakte 2,5 μL 1% biotin-CTB over 20 s.
  3. La nålespissen være på plass i 1 min og fjern langsomt over 10 s for å forhindre lekkasje.

5. Påføring av antistoff

  1. Inkuber prøven i løsning 3 i 2 dager ved 37 °C i et vannbad.
  2. Inkuber prøven i løsning 4 i 2 dager ved 37 °C i et vannbad.
  3. Inkuber med primært antistoff i 7 dager ved 37 °C i et vannbad.
  4. Vask i løsning 2 i 5 ganger, inkuber 1 time per vask. Oppbevars i løsning 2 på RT over natten.
  5. Inkuber med sekundært antistoff i 7 dager ved 37 °C i vannbad.
  6. Vask i løsning 2 i 5 ganger, inkuber 1 time per vask; oppbevare i løsning 2 på RT over natten.
    MERK: Alle trinn fra 5.6 og utover, inkludert endelig lagring, skal skje i svakt lys. Prøverørene kan skjermes med aluminiumsfolie. Konsentrasjonene som ble brukt til antistoffene i denne protokollen var: TH ved 1:100, Iba1 ved 1:200, og sekundært antistoff ved 1:100. Tilsett ekstra løsning 2 i trinn 5.1-5.6 for å sikre at rørene er fullstendig fylt.

6. Vevsrydding

  1. Inkuber prøven i en 20 % metanol/80 % avionisert vannløsning i 1 time ved RT.
  2. Inkuber prøven i en 40 % metanol/60 % avionisert vannløsning i 1 time ved RT.
  3. Inkuber prøven i en 60 % metanol/40 % avionisert vannløsning i 1 time ved RT.
  4. Inkuber prøven i en 80 % metanol/20 % avionisert vannløsning i 1 time ved RT.
  5. Inkuber prøven i 100% metanol i 1 time ved RT.
  6. Inkuber i fersk 100% metanol over natten på RT.
  7. Inkuber i 66% DCM / 33% metanol i 3 timer, med risting, ved romtemperatur.
  8. Inkuber i dibenzyl eter (DBE) uten risting. La prøven stå i DBE til den er klar og lagre i DBE til avbildning.

7. Montering

  1. Få et 3D-trykt kammer laget av Visijet M3 Crystal harpiks (maler tilgjengelig på nettstedet idisco.info).
  2. Fest kammeret til et mikroskopsklie ved hjelp av en epoksy.
  3. Plasser prøven i firkantrommet midt i kammeret.
  4. Fyll kammeret helt med DBE.
  5. Plasser en 0,17 mm tykk dekslerlip over kammeret og påfør trykk til dekslene har full kontakt med kammerveggene.
  6. Forsegle kantene på dekslene til kammeret ved hjelp av epoksy.
  7. Roter kammeret slik at luftbobler slipper ut fra påfyllingsinntaket.
  8. Fyll kammeret med ekstra DBE.
  9. Forsegle påfyllingsinntaket med epoksy og la det kurere.
    MERK: Overflødig DBE vil søle ut under montering.

8. Bildebehandling

  1. Bruk et konfokalt mikroskopsystem til å utføre z-skanning ved 4x forstørrelse (se den vedlagte 3D-videoen).
  2. Oppnå fluorescerende eksitasjon av prøven ved hjelp av en laser satt til å avgi ved en bølgelengde som ligner bølgelengden spesifisert av det sekundære antistoffet. TH-eksitasjon ble oppnådd ved hjelp av en HeNe laser satt til å avgi på 632 nm.
  3. Sett detektoren på en bølgelengde nær laserutslippet. For den nåværende protokollen ble detektoren for TH satt til 650 nm.
  4. Løft forsterkningen av detektoren til det er et synlig signal. 650LP-gevinsten for bilder ble satt til 7,50 B.
  5. Bruk skannealternativet i confocal imaging-programvaren, flytt mikroskopstadiet til prøven er satt i fokus.
  6. Naviger rundt i vevet i alle slettene og få enten enkeltbilder eller z-stack-bilder ved hjelp av den kondokale bildebehandlingsprogramvaren.
  7. Når bildet er fullført, fjerner du prøven fra kammeret. Plasser den tilbake i et rør helt fylt med DBE og oppbevar på RT på et mørkt sted, helst dekket av aluminiumsfolie.
    MERK: Prøver kan monteres på nytt og avbildes så lenge florescenssignalet fortsatt er sterkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Full rydding av store deler av både F344/N og HIV-1 rotte hjernevev ble oppnådd ved hjelp av denne modifiserte hydrofobe vevsryddingsprotokollen. Figur 1 viser et typisk konfokalt bilde for TH i substantia nigra-regionen. Figur 1A representerer tett, positiv farging. Tette områder som disse kan analyseres ved å fokusere gjennom "Z" -planet for å bekrefte positiv farging og riktig cellemorfologi. Figur 1B representerer sparsom positiv farging, som kan identifiseres av TH-nevronenes distinkte morfologi. Figur 1C representerer vev som ikke er positivt farget, men som fortsatt er mørkt til lyseblått på grunn av bakgrunnssignal. Områder av bildet som vises som helt svart indikerer fravær av vev i det området. Helt svarte områder i bildet kan skyldes å være på kanten av prøven, et hull som er i prøven, eller vev som er ute av fokus.

Figur 2A viser typisk morfologi av en TH-positiv nevron ved 20x forstørrelse. Riktig fargede og fokuserte konfokale bilder vil ideelt sett vise lys og skarp fluorescens mot en mørk bakgrunn. En TH positiv neuron har en stor soma (cellekropp) og flere forgreningsprosesser16. Figur 2B viser Iba1 farget mikroglia, som har små cellelegemer og kortere forlengelsesprosesser17. Bekreftelse av riktig farging og forventet cellemorfologi er det første trinnet i avbildning.

Figur 3 sammenligner et ideelt bilde (figur 3A) med tre uønskede bilder (Figur 3BD). Figur 3A viser positiv, lys farging mot en klar, mørk bakgrunn. Positiv farging kan lett skilles fra bakgrunnen. Figur 3B er et eksempel på et feilfokusert bilde med for mye fluorescerende gevinst. Figur 3C viser et falskt positivt signal. Lyse flekker som ikke er i fokus med resten av vevet er gjenstander og bør ikke betraktes som et positivt signal. Figur 3D er et eksempel på bruk av et blokkerende serum som ikke samsvarer med det sekundære antistoffet, som foreslått i den opprinnelige iDISCO-protokollen4. I dette bildet produserte bruk av eselserum for et sekundært antistoff laget i geit et bilde med høy bakgrunnsfarging, noe som skjuler evnen til å identifisere positiv farging riktig.

Figur 4A viser positiv CTB-farging i rottehjernen. De lange, tynne fibrene er afferent projeksjoner langs den dopaminerge banen. Figur 4B og figur 4C viser kolokalisering av TH og CTB. I figur 4Bkan injeksjonen ses i nukleus accumbens-området, som fremstår som en tett fluorescerende grønn sirkel. Figur 4C viser kolokalering av TH og CTB i substantia nigra-området.

Figure 1
Figur 1: Konfokalt bilde av en hydrofobt ryddet vevsprøve med markører, 4x forstørrelse. (A) Tett TH farging i substantia nigra området. (B) Sparsomme TH-nevroner ved siden av substantia nigra. (C) Vev som mangler positive TH-nevroner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Typisk morfologi av fluorescerende merket TH positive nevroner (20x forstørrelse) og Iba1 positiv mikroglia (10x forstørrelse). (A) To representative TH positive nevroner. (B) Iba1 positiv mikroglia. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Ideelle og dårlige konfokale bilder av hydrofobt renset vev, 4x forstørrelse. (A) Tett TH farging i substantia nigra området, riktig i fokus med en passende fluorescens gevinst. (B) Et feilfokusert og altfor eksponert bilde. (C) Falsk positiv farging. (D) Høy bakgrunnsfarging som et resultat av å følge den uendrete iDISCO-protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Koleratoksin B-merking langs den dopaminerge banen, 4x forstørrelse. (A) Konfokalt bilde av positiv CTB-farging. (B) Overlappet bilde av TH og CTB og nucleus accumbens injeksjonssted. (C) Colocalization av TH og CTB i substantia nigra området. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Film 1: 3D-film av z-skanning av prøven ved 4x forstørrelse. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vevsrydding tilbyr en løsning på begrensningene i tradisjonell IHC-protokoll. En gjennomsiktig prøve minimerer spredning og absorpsjon av lys, noe som gir optisk tilgang på cellenivå til intakt vev18,19. Vevsryddingsteknikker gjør et vev gjennomsiktig gjennom delipidasjon, decolorization og avkalking med administrering av løsningsmidler. Når brytningsindeksen i vevsprøven samsvarer med brytningsindeksen til det valgte bildemediet, vil prøven se helt gjennomsiktig ut og kan være riktig avbildet3. Den nåværende hydrofobe protokollen fjerner vann fra vevet i de første dehydreringstrinnene, og reduserer dermed lysspredningen. Vev permeabiliseres under forbehandling for å tillate dyp antistoff penetrasjon. Vev som har gjennomgått protokollen er i stand til å håndteres enkelt og kan avbildes flere ganger. Hvis det er riktig lagret, kan vev fortsatt gi bilder i opptil et år etter første behandling.

I den nåværende protokollen bruker vi en hydrofob vevsryddingsteknikk på F344/N og HIV-1 Tg rotte hjernevevsprøver for å fargelegge for TH, Iba1 og CTB. Etter rydding ble vevsprøvene avbildet ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Den nåværende protokollen har flere fordeler i forhold til andre hydrofobe protokoller, som iDISCO4. For det første ble den opprinnelige iDISCO-protokollen validert for bruk i musvev, mens den nåværende protokollen er levedyktig i rottehjernevev. For det andre tillater den justerte inkubasjonstiden på hvert trinn teknikken som skal brukes til større vevsseksjoner. For det tredje, inkludert det tilsvarende serumet under antistoffinkubasjon (i motsetning til bruk av et generelt serum) gir klarere bilder for analyse.

Selv om den nåværende protokollen lett kan tilpasses behovene til individuelle forskningsspørsmål, er det flere viktige hensyn. Protokollen tar minst 26 påfølgende dager fra begynnelse til slutt. Ikke la prøven stå i en løsning lenger enn nevnt ovenfor. Prøven kan imidlertid lagres i DBE på slutten av protokollen i minst 6 måneder trygt til avbildning, selv om det anbefales å bilde så snart som mulig. Bestill et 3D-trykt kammer som passer godt til prøven mellom mikroskopet og dekslene. Alle lagerløsninger, bortsett fra løsning 1, var blandet dag-av i et beløp som var passende for den dagens bruk. Prøven bør flyttes til et nytt rør når en ny løsning innføres for å forhindre krysskontaminering. Hvis mikrobiell vekst er bekymringsfull, kan natriumazid legges til løsning 2, løsning 3, løsning 4, den primære antistoffløsningen og den sekundære antistoffoppløsningen i en konsentrasjon på 0,02% i total løsning.

Totalt sett er den nåværende teknikken en ekstremt allsidig, enkel å implementere og rimelig prosedyre som er kompatibel med mange antistoffer. Med denne protokollen som er validert for å fungere i både F344/N-kontroll og HIV-1 Tg-rotter, kan mange nye undersøkende forskningsspørsmål besvares.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen av forfatterne har interessekonflikter å erklære.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av NIH-tilskudd: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & by T32 Training Grant 5T32GM081740

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 Invitrogen C34775
DBE Sigma-Aldrich 108014-1KG
DCM Sigma-Aldrich 270997-100mL
DMSO Sigma-Aldrich 472301-1L
Glycine Fisher Chemical G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 Invitrogen A32733
Goat serum Sigma Life Science G9023-10mL
Heparin Acros Organics 41121-0010
Iba1 primary antibody FUJIFILM Wako 019-19741
Kwik-sil epoxy VWR 70730-062
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1l-R
PBS Fisher Bioreagents BP2944-100
Perfusion machine VWR 70730-062 mini pump variable flow
PFA Sigma-Aldrich 158127-3KG
TH primary antibody Millipore Sigma AB152
TritonX-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Tween-20 Fisher Bioreagents BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).
  4. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  5. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  6. Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
  7. Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
  8. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
  9. Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
  10. Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).
  11. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152 (2018).
  12. Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
  13. Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
  14. Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
  15. Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
  16. Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
  17. Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  18. Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).

Tags

Nevrovitenskap utgave 166 vevsrydding immunhiistokjemi iDISCO hjerne rotte konfekt
En hydrofob vevsryddingsmetode for rottehjernevev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A.… More

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A. R., Harrod, S. B., Mactutus, C. F., Booze, R. M. A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (166), e61821, doi:10.3791/61821 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter