Summary
Aqui apresentamos um método de limpeza de tecido hidrofóbico que permite a visualização de moléculas-alvo como parte de estruturas cerebrais intactas. Esta técnica foi validada para o controle F344/N e ratos transgênicos HIV-1 de ambos os sexos.
Abstract
Os métodos de limpeza de tecidos hidrofóbicos são procedimentos facilmente ajustáveis, rápidos e de baixo custo que permitem o estudo de uma molécula de interesse em amostras de tecidos não endalterados. Os procedimentos tradicionais de imunolabelação requerem o corte da amostra em seções finas, o que restringe a capacidade de rotular e examinar estruturas intactas. No entanto, se o tecido cerebral pode permanecer intacto durante o processamento, estruturas e circuitos podem permanecer intactos para a análise. Métodos de limpeza previamente estabelecidos levam tempo significativo para limpar completamente o tecido, e os produtos químicos severos podem muitas vezes danificar anticorpos sensíveis. O método iDISCO limpa rapidamente e completamente o tecido, é compatível com muitos anticorpos e não requer nenhum equipamento de laboratório especial. Esta técnica foi inicialmente validada para o uso em tecido de camundongos, mas o protocolo atual adapta esse método a hemisférios de imagem de control e cérebros de ratos transgênicos. Além disso, o presente protocolo também faz vários ajustes no protocolo pré-existente para fornecer imagens mais claras com menor coloração de fundo. Os anticorpos para Iba-1 e hidroxilase de tyrosina foram validados no rato transgênico HIV-1 e em ratos de controle F344/N usando o presente método de limpeza de tecido hidrofóbico. O cérebro é uma rede entrelaçada, onde as estruturas trabalham juntas mais frequentemente do que separadamente umas das outras. Analisar o cérebro como um todo o sistema em oposição a uma combinação de peças individuais é o maior benefício de todo esse método de limpeza cerebral.
Introduction
Várias técnicas de limpeza tecidual foram validadas para uso no cérebro: hidrogel, hidrofílico e hidrofóbico. Essas técnicas visam tornar um tecido transparente através da delipidação, descoloração e decalcificação através da administração de solventes. Uma vez que o índice refrativo da amostra de tecido corresponda ao índice de refração do meio de imagem escolhido, uma imagem clara da amostra pode ser obtida. Técnicas baseadas em hidrogel, como clarity, protegem biomoléculas no tecido ligando-as a hidrogéis à base de acríl, o que evita danos estruturais e perda de proteínas1. No entanto, as técnicas de hidrogel utilizam produtos químicos severos do que têm o potencial de danificar tecidos mais frágeis, e amostras de tecido mais densas podem não ser compatíveis com o protocolo de hidrogel. Certas técnicas de hidrogel podem exigir equipamentos caros ou levar à expansão do tecido. Técnicas hidrofílicas, como o CUBIC, preservam a estrutura 3D através da formação de ligações de hidrogênio dentro do tecido2. A expansão tecidual também pode ocorrer em certo protocolo hidrofílico. A capacidade de compensação das técnicas hidrofílicas muitas vezes não corresponde à capacidade que as técnicas hidrofóbicas têm, o que é importante para tecidos mais densos e grossos3.
Técnicas hidrofóbicas geralmente são rápidas, não requerem equipamentos especiais e produzem uma amostra fácil de manusear e armazenar. IDISCO é uma técnica hidrofóbica que elimina o encolhimento que pode ocorrer em outro protocolo hidrofóbico. Originalmente, a técnica de limpeza de tecidos iDISCO foi descrita por Renier et al.4 para os embriões e órgãos adultos densos de camundongos. Esta técnica remove a água do tecido na etapa inicial de desidratação, reduzindo assim a dispersão da luz. O tecido é permeabilizado durante o pré-tratamento para permitir a penetração profunda de anticorpos. Os corantes de fluor alexa no espectro vermelho distante são usados para imunolabeling para evitar a autofluorescência do tecido em comprimentos de onda mais baixos5. Tecidos que passaram por protocolos de limpeza hidrofóbica são capazes de ser manuseados facilmente e podem ser imagens várias vezes devido à longevidade dos corantes Alexa Fluor. Se armazenados corretamente, os tecidos podem fornecer imagens por meses a um ano após o processamento inicial.
No presente protocolo, anticorpos tyrosine hydroxylase (TH), anticorpo Iba1 e Subunit B (CTB) de tricô de toxina de cólera e cólera foram usados em cérebros de ratos machos e femininos e transgênicos HIV-1 (Tg). O rato HIV-1 Tg possui sete dos nove genes que compõem o genoma viral hiv-1, o que leva a um modelo não infeccioso de exposição proteica hiv-1 a longo prazo6,7,8. Alterações dopaminérgicas já foram demonstradas anteriormente no rato HIV-1 Tg, e o próprio HIV-1 é uma doença inflamatória, por isso a escolha do anticorpo foi relevante para o desenho experimental9,10,11,12. CTB é um rastreador que se liga aos neurônios via ligação ganglioside e pode ser usado para traçar projeções diferentes no cérebro. A CTB tem sido usada anteriormente para estudar projeções do núcleo accumbens até a área de nigra substantia, duas áreas do cérebro fortemente envolvidas com as vias dopaminérgicas13,14,15.
Neste protocolo, o TH servirá como um marcador para a produção de dopamina, e o Iba1 marcará microglia ativada. O anticorpo TH usado rotula seletivamente uma única banda a aproximadamente 62 kDa que corresponde à hidroxilase de tirasina. O anticorpo Iba1 corresponde à sequência iba1 carboxy-terminal. Ambos os anticorpos foram criados em coelho e eram policlonais. CtB será usado para rastreamento retrógrado de neurônios da área de accumbens do núcleo até a área de nigra substantia. O protocolo atual também oferece uma diretriz para o ajuste do protocolo original iDISCO de duas maneiras distintas: 1) redução geral da coloração de fundo alterando os reagentes de soro nas etapas de bloqueio, e 2) dimensionamento do tempo de incubação para ser adequado para amostras de tecido maiores. No geral, o presente protocolo fornece evidências contínuas de que as técnicas de compensação hidrofóbica são viáveis nos tecidos cerebrais do rato, não têm interações prejudiciais perceptíveis com proteínas virais hiv-1 e são compatíveis com anticorpo TH, anticorpo Iba1 e CTB.
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Protocol
Todos os protocolos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Sul.
1. Preparação da solução de estoque
- Solução 1 (1 L): A 900 mL de H2O desionizado adicione 100 mL de salina tamponada de fosfato de 10x (PBS) e 2 mL de Triton X-100.
- Solução 2 (1 L): A 900 mL de H2O desionizado, adicione 100 mL de 10x PBS, 2mL de Tween-20 e 1 mL de solução de estoque heparin de 10 mg/mL.
- Solução 3 (500 mL): A 400 mL da Solução 1, adicione 11,5 g de glicina e 100 mL de dimetilsulfoxida (DMSO).
- Solução 4 (50 mL): A 42 mL da Solução 1, adicione 3 mL de soro correspondente e 5 mL de DMSO.
- Solução de anticorpos primários (50 mL): A 46 mL da Solução 2, adicione 2,5 mL de DMSO e 1,5 mL de soro correspondente.
- Solução secundária de anticorpos (50 mL): A 48,5 mL da Solução 2, adicione 1,5 mL de soro correspondente.
NOTA: Para a Solução 4, solução primária e solução secundária, use um soro que corresponda ao anticorpo secundário (por exemplo, cabra, cavalo, bovino).
2. Preparação da amostra
NOTA: Realize as etapas 2.1 a 2.7 em um capô de fumaça devido a limitar a exposição ao PFA.
- Anestesiar profundamente o rato jovem (3-6 semanas) usando sevoflurano; prossigam para 2.2 quando o rato não está respondendo e não responde ao dedo do dedo do dedo e da cauda.
- Coloque o rato em uma posição supina e faça uma incisão através da parede abdominal usando um par de tesouras Iris.
- Corte a parte inferior da caixa torácica até a clavícula em ambos os lados da caixa torácica usando a tesoura Mayo.
- Afixe o esterno e costelas longe do coração e pulmões com um hemostato.
- Fure o ventrículo esquerdo com uma agulha de 23 G presa a uma bomba de perfusão e corte o átrio direito com a tesoura Iris.
- Realizar perfusão transcárvia com aproximadamente 75 mL de 100 mM (1x) PBS.
- Continue a perfusão transcárvia com aproximadamente 100 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) tamponado em 1x PBS.
- Remova o cérebro do crânio usando fórceps.
- Coloque o cérebro em posição sagital e corte em 4 seções iguais (aproximadamente 3 mm de largura) usando uma lâmina de barbear e uma matriz cerebral de rato.
- Fixar cada seção em 4% de PFA em 1x PBS em um tubo de plástico selado de 5mL durante a noite a 4 °C em um agitador.
- Continue a fixar em 4% pfa em 1x PBS à temperatura ambiente (RT) em um agitador por 1 h.
- Lave cada seção com 1x PBS em RT por 30 min, 3 vezes.
3. Desidratação e despigmentação
- Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 20% de metanol/80% para 1h na RT.
- Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 40% de metanol/60% por 1h na RT.
- Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 60% de metanol/40% para 1 h na RT.
- Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 80% de metanol/20% para 1 h na RT.
- Incubar a amostra em 100% de metanol por 1 h na RT. Repita com mais 100% de metanol, incubando por 1h na RT.
- Esfrie a amostra em 100% de metanol a 4° C por aproximadamente 10 minutos.
- Prepare uma solução de 66% de diclorometano (DCM)/33% de metanol.
- Incubar a amostra durante a noite na solução DCM/metanol na RT, com agitação.
- Lave com metanol na RT por 30 minutos, 2 vezes.
- Esfrie a amostra em 100% de metanol a 4° C por aproximadamente 10 minutos.
- Alvejante em peróxido de hidrogênio refrigerado, recém-preparado 5% em metanol durante a noite a 4° C.
- Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 80% de metanol/20% para 1 h na RT.
- Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 60% de metanol/40% para 1 h na RT.
- Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 40% de metanol/60% por 1h na RT.
- Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 20% de metanol/80% para 1h na RT.
- Incubar a amostra em 1x PBS por 1 h na RT.
- Lave a solução 1 por 1h no RT, 2 vezes.
4. Rotulagem de Subunidade de Toxina de Cólera B
- Insira a ponta da agulha de 1 mL de seringa no local do núcleo accumbens.
- Injete lentamente 2,5 μL de 1% de biotina-CTB acima de 20 s.
- Deixe a ponta da agulha no lugar por 1 min e remova lentamente mais de 10 s para evitar vazamentos.
5. Aplicação de anticorpos
- Incubar a amostra na Solução 3 por 2 dias a 37 °C em um banho de água.
- Incubar a amostra na Solução 4 por 2 dias a 37 °C em banho-maria.
- Incubar com anticorpo primário por 7 dias a 37 °C em um banho de água.
- Lave a Solução 2 por 5 vezes, incubando 1h por lavagem. Armazene na Solução 2 na RT durante a noite.
- Incubar com anticorpo secundário por 7 dias a 37 °C no banho de água.
- Lave na Solução 2 por 5 vezes, incubando 1h por lavagem; armazenar na Solução 2 na RT durante a noite.
NOTA: Todas as etapas a partir de 5,6 em diante, incluindo o armazenamento final, devem ocorrer com pouca luz. Os tubos de amostra podem ser protegidos com papel alumínio. As concentrações utilizadas para os anticorpos neste protocolo foram: TH às 1:100, Iba1 às 1:200, e o anticorpo secundário às 1:100. Adicione solução adicional 2 às etapas 5.1-5.6 para garantir que os tubos estejam completamente preenchidos.
6. Limpeza de tecidos
- Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 20% de metanol/80% para 1h na RT.
- Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 40% de metanol/60% por 1h na RT.
- Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 60% de metanol/40% para 1 h na RT.
- Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 80% de metanol/20% para 1 h na RT.
- Incubar a amostra em 100% de metanol por 1h na RT.
- Incubar em fresco 100% metanol durante a noite na RT.
- Incubar em 66% DCM/33% de metanol por 3h, com agitação, à temperatura ambiente.
- Incubar em éter dibenzyl (DBE) sem tremer. Deixe a amostra em DBE até limpar e armazene em DBE até a imagem.
7. Montagem
- Obtenha uma câmara impressa em 3D feita de resina Visijet M3 Crystal (modelos disponíveis no site da idisco.info).
- Fixar a câmara em um slide de microscópio usando um epóxi.
- Coloque a amostra no espaço quadrado no meio da câmara.
- Encha a câmara completamente com DBE.
- Coloque uma tampa de 0,17 mm de espessura sobre a câmara e aplique pressão até que o deslizamento tenha contato total com as paredes da câmara.
- Sele as bordas da tampa para a câmara usando o epóxi.
- Gire a câmara para permitir que bolhas de ar escapem da entrada de enchimento.
- Encha a câmara com DBE adicional.
- Sele a entrada de enchimento com epóxi e deixe a cura.
NOTA: O excesso de DBE derramará durante a montagem.
8. Imagem
- Use um sistema de microscópio confocal para realizar z-scan na ampliação de 4x (veja o vídeo 3Danexado ).
- Obtenha excitação fluorescente da amostra usando um conjunto de laser para emitir em um comprimento de onda semelhante ao comprimento de onda especificado pelo anticorpo secundário. A excitação th foi alcançada utilizando um conjunto laser HeNe para emitir a 632 nm.
- Coloque o detector em um comprimento de onda perto da emissão de laser. Para o presente protocolo, o detector de TH foi fixado em 650 nm.
- Levante o ganho do detector até que haja um sinal visível. O ganho de 650LP para imagens foi definido como 7,50 B.
- Usando a opção Digitalizar no software de imagem confocal, mova o estágio do microscópio até que a amostra seja colocada em foco.
- Navegue ao redor do tecido em todas as planícies e obtenha imagens únicas ou z-stack usando o software de imagem confocal.
- Uma vez concluída a imagem, remova a amostra da câmara. Coloque-o de volta em um tubo completamente cheio de DBE e armazene no RT em um lugar escuro, de preferência coberto de papel alumínio.
NOTA: As amostras podem ser remontadas e imagens desde que o sinal de floresnce ainda esteja forte.
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Representative Results
A limpeza completa de grandes seções do tecido cerebral de rato F344/N e HIV-1 foi alcançada usando este protocolo de limpeza de tecido hidrofóbico modificado. A Figura 1 exibe uma imagem confocal típica para TH na região de nigra substantia. A Figura 1A representa uma mancha densa e positiva. Áreas densas como essas podem ser analisadas focando-se através do plano "Z" para confirmar a coloração positiva e a morfologia celular adequada. A Figura 1B representa uma coloração positiva esparsa, que pode ser identificada pela morfologia distinta dos neurônios TH. A Figura 1C representa tecido que não está manchado positivamente, mas ainda é escuro para azul claro devido ao sinal de fundo. Áreas da imagem que aparecem completamente pretas indicam ausência de tecido nessa área. Áreas completamente negras na imagem podem ser devido a estar na borda da amostra, um buraco que está na amostra, ou tecido que está fora de foco.
A Figura 2A mostra morfologia típica de um neurônio TH positivo em ampliação de 20x. Imagens confocal devidamente manchadas e focadas mostrarão o ideal e a fluorescência nítida contra um fundo escuro. Um neurônio TH positivo tem uma grande soma (corpo celular) e vários processos de ramificação16. A Figura 2B mostra a microglia manchada Iba1, que tem corpos de células pequenas e processos de extensão maiscurtos 17. A confirmação da coloração adequada e da morfologia celular esperada é o primeiro passo na imagem.
A Figura 3 compara uma imagem ideal(Figura 3A) a três imagens indesejáveis(Figura 3B-D). A Figura 3A mostra manchas positivas e brilhantes contra um fundo claro e escuro. A coloração positiva é facilmente distinguível a partir do fundo. A Figura 3B é um exemplo de uma imagem inadequadamente focada com muito ganho fluorescente. A figura 3C mostra um sinal falso positivo. Pontos brilhantes que não estão em foco com o resto do tecido são artefatos e não devem ser considerados como um sinal positivo. A Figura 3D é um exemplo de uso de um soro de bloqueio que não corresponde ao anticorpo secundário, como sugerido no protocolo iDISCO original4. Nesta imagem, o uso de soro de burro para um anticorpo secundário feito em cabra produziu uma imagem com alta coloração de fundo, o que obscurece a capacidade de identificar adequadamente a coloração positiva.
A figura 4A mostra uma mancha positiva de CTB no cérebro do rato. As fibras longas e finas são projeções diferentes ao longo da via dopaminergica. Figura 4B e Figura 4C mostram colocalização de TH e CTB. Na Figura 4B,a injeção pode ser vista na área do núcleo accumbens, que aparece como um círculo verde densamente fluorescente. A Figura 4C exibe colocalização de TH e CTB na área de nigra substantia.
Figura 1: Imagem confocal de uma amostra de tecido hidrofobicamente limpa com marcadores, ampliação de 4x. (A) Mancha de TH densa na área de nigra substantia. (B) Neurônios TH esparsos adjacentes à substantia nigra. (C) Tecido sem neurônios TH positivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Morfologia típica de neurônios th positivos fluorescentes rotulados (ampliação de 20x) e microglia positiva Iba1 (ampliação de 10x). (A) Dois neurônios th positivos representativos. (B) Microglia positiva Iba1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens confocal ideais e pobres de tecido hidrofobicamente limpo, ampliação de 4x. (A) Mancha de TH densa na área de nigra substantia, adequadamente em foco com um ganho adequado de fluorescência. (B) Uma imagem inadequadamente focada e excessivamente exposta. (C) Mancha falsa positiva. (D) Coloração de fundo alta como resultado da seguir o protocolo iDISCO não substituído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Rotulagem da toxina de cólera B ao longo da via dopaminérgica, ampliação de 4x. (A) Imagem confocal da coloração positiva da CTB. (B) Imagem sobreposta de TH e CTB e local de injeção de núcleo accumbens. (C) Colocalização de TH e CTB na área de nigra substantia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: filme 3D de z-scan da amostra em 4x de ampliação. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
A limpeza de tecidos oferece uma solução para as limitações do protocolo IHC tradicional. Uma amostra transparente minimiza a dispersão e absorção da luz, que fornece acesso óptico de nível celular a tecidos intactos18,19. As técnicas de limpeza de tecidos tornam um tecido transparente através da delipidação, descoloração e decalcificação com a administração de solventes. Uma vez que o índice refrativo da amostra de tecido corresponda ao índice de refração do meio de imagem escolhido, a amostra parecerá completamente transparente e poderá ser adequadamente imageda3. O presente protocolo hidrofóbico remove a água do tecido nas etapas iniciais de desidratação, reduzindo assim a dispersão da luz. O tecido é permeabilizado durante o pré-tratamento para permitir a penetração profunda de anticorpos. O tecido que passou pelo protocolo é capaz de ser manuseado facilmente e pode ser imageado várias vezes. Se armazenados corretamente, os tecidos ainda podem fornecer imagens por até um ano após o processamento inicial.
No presente protocolo, aplicamos uma técnica de limpeza de tecido hidrofóbico às amostras de tecido cerebral de rato F344/N e HIV-1 Tg para colorir para TH, Iba1 e CTB. Após a limpeza, as amostras de tecido foram imagens usando um microscópio confocal. O presente protocolo tem várias vantagens sobre outros protocolos hidrofóbicos, como o iDISCO4. Primeiro, o protocolo original iDISCO foi validado para o uso em tecido mice, enquanto o presente protocolo é viável no tecido cerebral de rato. Em segundo lugar, o tempo de incubação ajustado em cada etapa permite que a técnica seja usada para seções de tecido maiores. Em terceiro lugar, incluindo o soro correspondente durante a incubação de anticorpos (em oposição ao uso de um soro geral) fornece imagens mais claras para análise.
Embora o presente protocolo seja facilmente adaptável para atender às necessidades de questões individuais de pesquisa, existem várias considerações importantes. O protocolo leva, no mínimo, 26 dias consecutivos do início ao fim. Não deixe a amostra em uma solução por mais tempo do que o indicado acima. A amostra pode, no entanto, ser armazenada em DBE no final do protocolo por pelo menos 6 meses com segurança até a imagem, embora seja aconselhável a imagem o mais rápido possível. Peça uma câmara impressa em 3D que se encaixe na amostra entre o deslizamento do microscópio e o deslizamento de tampas. Todas as soluções de estoque, além da Solução 1, foram mistas no dia-a-dia de uma quantidade que foi apropriada para o uso daquele dia. A amostra deve ser movida para um novo tubo sempre que uma nova solução for introduzida para evitar contaminação cruzada. Se o crescimento microbiano for preocupante, o azida de sódio pode ser adicionado à Solução 2, Solução 3, Solução 4, a solução primária de anticorpos e à solução de anticorpos secundários em uma concentração de 0,02% na solução total.
No geral, a técnica atual é um procedimento extremamente versátil, fácil de implementar e de baixo custo compatível com muitos anticorpos. Com este protocolo validado para funcionar tanto no controle F344/N quanto em ratos Tg HIV-1, muitas novas perguntas de pesquisa investigativa podem ser respondidas.
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Disclosures
Nenhum dos autores tem conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por subvenções nih: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & por T32 Training Grant 5T32GM081740
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | C34775 | |
| DBE | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| DCM | Sigma-Aldrich | 270997-100mL | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-1L | |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-500 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Goat serum | Sigma Life Science | G9023-10mL | |
| Heparin | Acros Organics | 41121-0010 | |
| Iba1 primary antibody | FUJIFILM Wako | 019-19741 | |
| Kwik-sil epoxy | VWR | 70730-062 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1l-R | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP2944-100 | |
| Perfusion machine | VWR | 70730-062 | mini pump variable flow |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-3KG | |
| TH primary antibody | Millipore Sigma | AB152 | |
| TritonX-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Tween-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
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