Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Гидрофобный метод очистки тканей для ткани мозга крыс

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/61821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

Здесь мы представляем гидрофобный метод очистки тканей, который позволяет рассматривать молекулы-мишени как часть неповрежденных структур мозга. Этот метод в настоящее время подтвержден для борьбы с F344/N и трансгенных крыс с ВИЧ-1 обоих полов.

Abstract

Гидрофобные методы очистки тканей — это легко регулируемые, быстрые и недорогие процедуры, которые позволяют изучать интересующую молекулу в неизмененных образцах тканей. Традиционные процедуры иммуномаркировки требуют разрезания образца на тонкие срезы, что ограничивает возможность маркировки и изучения неповрежденных структур. Однако, если ткань мозга может оставаться неповрежденной во время обработки, структуры и схемы могут оставаться нетронутыми для анализа. Ранее установленные методы очистки занимают значительное время, чтобы полностью очистить ткани, а агрессивные химические вещества часто могут повредить чувствительные антитела. Метод iDISCO быстро и полностью очищает ткани, совместим со многими антителами и не требует специального лабораторного оборудования. Этот метод был первоначально одобрен для использования в тканях мышей, но текущий протокол адаптирует этот метод к изображению полушарий контроля и трансгенного мозга крыс. В дополнение к этому, настоящий протокол также вносит несколько корректировок в ранее существовавающий протокол, чтобы обеспечить более четкие изображения с меньшим фоновым окрашиванием. Антитела к Iba-1 и тирозингидрилазе были подтверждены у трансгенных крыс с ВИЧ-1 и у контрольных крыс F344/N с использованием настоящего гидрофобного метода очистки тканей. Мозг представляет собой переплетеную сеть, где структуры работают вместе чаще, чем по отдельности друг от друга. Анализ мозга как целой системы в отличие от комбинации отдельных частей является наибольшим преимуществом этого метода очистки всего мозга.

Introduction

Несколько методов очистки тканей были проверены для использования в головном мозге: гидрогелевые, гидрофильные и гидрофобные. Эти методы направлены на то, чтобы сделать ткань прозрачной путем делипидации, обесцвечивания и декальцирования путем введения растворителей. Как только показатель преломления образца ткани соответствует индексу преломления выбранной среды визуализации, может быть получено четкое изображение образца. Методы на основе гидрогеля, такие как CLARITY, защищают биомолекулы в ткани, связывая их с гидрогелями на основе акрилов, что предотвращает структурное повреждение и потерю белков1. Тем не менее, методы гидрогеля используют агрессивные химические вещества, которые могут повредить более хрупкие ткани, и более плотные образцы тканей могут быть несовместимы с протоколом гидрогеля. Некоторые методы гидрогеля могут потребовать дорогостоящего оборудования или привести к расширению тканей. Гидрофильные методы, такие как CUBIC, сохраняют 3D-структуру путем образования водородных связей внутриткани 2. Расширение тканей также может происходить в определенном гидрофильном протоколе. Очищающая способность гидрофильных методов часто не соответствует способности, которой обладают гидрофобные методы, что важно для более плотных и толстых тканей3.

Гидрофобные методы, как правило, быстрые, не требуют специального оборудования и производят образец, который прост в обращении и хранении. iDISCO - это гидрофобный метод, который устраняет усадку, которая может возникнуть в другом гидрофобном протоколе. Первоначально метод очистки тканей iDISCO был описан Renier et al.4 для эмбрионов и плотных взрослых органов мышей. Этот метод удаляет воду из ткани на начальной ступени обезвоживания, тем самым уменьшая рассеяние света. Ткань проницаема во время предварительной обработки, чтобы обеспечить глубокое проникновение антител. Красители Alexa Fluor в дальне-красном спектре используются для иммуномаркировки, чтобы избежать автофлуоресценции ткани на более низких длинах волн5. Ткани, прошедшие гидрофобные протоколы очистки, могут легко обрабатываться и могут быть изображены несколько раз благодаря долговечности красителей Alexa Fluor. При правильном хранении ткани могут предоставлять изображения в течение нескольких месяцев до года после первоначальной обработки.

В настоящем протоколе антитело к тирозингидроксилазе (TH), антитело Iba1 и субъединица токсина холеры B (CTB) использовались как на мужском, так и на женском контроле и трансгенном (Tg) мозге крыс с ВИЧ-1. Крыса ВИЧ-1 Tg обладает семью из девяти генов, составляющих вирусный геном ВИЧ-1, что приводит к неинфекционной модели длительного воздействия белка ВИЧ-16,7,8. Дофаминергические изменения ранее были продемонстрированы у крысы с ВИЧ-1 Tg, а сам ПОИВ-ВИЧ-1 является воспалительным заболеванием, поэтому выбор антител был актуален для экспериментальной конструкции9,10,11,12. CTB - это индикатор, который прикрепляется к нейронам через связывание ганглиозидов и может быть использован для отслеживания афферентных проекций в мозге. CTB ранее использовался для изучения проекций от прилежания ядра к области нигры субстанции, двух областей мозга, сильно связанных с дофаминергическими путями13,14,15.

В этом протоколе TH будет служить маркером для выработки дофамина, а Iba1 будет маркивать активированную микроглию. Используемое антитело TH избирательно маркирует одну полосу при приблизительно 62 кДа, что соответствует тирозинде гидроксилазе. Антитело Iba1 соответствует карбокси-терминальной последовательности Iba1. Оба антитела были выращенные у кролика и были поликлональными. CTB будет использоваться для ретроградного отслеживания нейронов от области прилежащих ядер до области substantia nigra. Текущий протокол также предлагает руководство по корректировке оригинального протокола iDISCO двумя различными способами: 1) общее уменьшение фонового окрашивания путем изменения реагентов сыворотки на этапах блокировки и 2) масштабирование времени инкубации, чтобы быть пригодным для более крупных образцов тканей. В целом, настоящий протокол предоставляет постоянные доказательства того, что методы гидрофобной очистки возможны в тканях мозга крысы, не имеют заметных вредных взаимодействий с вирусными белками ВИЧ-1 и совместимы с антителами TH, антителами Iba1 и CTB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Южной Каролины.

1. Приготовление раствора на складе

  1. Раствор 1 (1 л): К 900 мл деионизированногоH2O добавляют 100 мл 10x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и 2 мл Triton X-100.
  2. Раствор 2 (1 л): К 900 мл деионизированногоH2O добавляют 100 мл 10x PBS, 2 мл Tween-20 и 1 мл 10 мг/мл раствора Гепарина.
  3. Раствор 3 (500 мл): К 400 мл раствора 1 добавляют 11,5 г г глицина и 100 мл диметилсульфоксида (ДМСО).
  4. Раствор 4 (50 мл): К 42 мл раствора 1 добавляют 3 мл соответствующей сыворотки и 5 мл ДМСО.
  5. Первичный раствор антител (50 мл): К 46 мл раствора 2 добавляют 2,5 мл ДМСО и 1,5 мл соответствующей сыворотки.
  6. Вторичный раствор антител (50 мл): К 48,5 мл раствора 2 добавляют 1,5 мл соответствующей сыворотки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для раствора 4, первичного раствора, и вторичного раствора используют сыворотку, которая соответствует вторичным антителам (например, козьему, лошадиной, бытовой).

2. Пробоподготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги с 2.1 по 2.7 в вытяжном капюшоне из-за ограничения воздействия ПФА.

  1. Глубоко обезболивают молодняк (3-6 недель) крыс с помощью севофлурана; перейти к 2.2, когда крыса не реагирует и не реагирует на защемление нога и хвоста.
  2. Уложите крысу в положение лежа на спине и сделайте разрез через брюшную стенку с помощью ножниц радужной оболочки глаза.
  3. Прорежьте дно грудной клетки до ключицы с обеих сторон грудной клетки ножницами Майо.
  4. Прикрепите грудину и ребра подальше от сердца и легких гемостатом.
  5. Проткните левый желудочек иглой 23 Г, прикрепленной к перфузионному насосу, и разрезайте правое предсердие ножницами Iris.
  6. Выполните транскардиальную перфузию примерно 75 мл 100 мМ (1x) PBS.
  7. Продолжают транскардиальную перфузию примерно 100 мл 4% параформальдегида (PFA), буферизованным в 1x PBS.
  8. Удалите мозг из черепа с помощью щипцов.
  9. Поместите мозг в сагиттальное положение и нарежьте на 4 равных участка (примерно 3 мм в ширину) с помощью лезвия бритвы и матрицы мозга крысы.
  10. Зафиксируйте каждую секцию в 4% PFA в 1x PBS в герметичной пластиковой трубке объемом 5 мл на ночь при 4 °C на шейкере.
  11. Продолжают фиксировать в 4% PFA в 1x PBS при комнатной температуре (RT) на шейкере в течение 1 ч.
  12. Вымойте каждую секцию с 1x PBS на RT в течение 30 мин, 3 раза.

3. Обезвоживание и депигментация

  1. Инкубировать образец в 20% метаноле/80% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
  2. Инкубировать образец в 40% метаноле/60% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
  3. Инкубировать образец в 60% метаноле/40% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
  4. Инкубировать образец в 80% метаноле/20% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
  5. Инкубировать образец в 100% метаноле в течение 1 ч при РТ. Повторить с более чем 100% метанолом, инкубируя в течение 1 ч при РТ.
  6. Охладите образец в 100% метаноле при 4°С в течение приблизительно 10 мин.
  7. Приготовьте 66% раствор дихлорметана (DCM)/33% метанола.
  8. Инкубировать образец в течение ночи в растворе DCM/метанола на RT, встряхивая.
  9. Промыть метанолом на RT в течение 30 мин, 2 раза.
  10. Охладите образец в 100% метаноле при 4°С в течение приблизительно 10 мин.
  11. Отбеливатель в охлажденный, свежеприготовленный 5% перекись водорода в метаноле на ночь при 4°С.
  12. Инкубировать образец в 80% метаноле/20% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
  13. Инкубировать образец в 60% метаноле/40% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
  14. Инкубировать образец в 40% метаноле/60% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
  15. Инкубировать образец в 20% метаноле/80% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
  16. Инкубировать образец в 1x PBS в течение 1 ч на RT.
  17. Промыть раствором 1 в течение 1 ч при РТ, 2 раза.

4. Маркировка субъединицы B холеротоксина

  1. Вставьте кончик иглы из шприца 1 мл в участок прилежания ядра.
  2. Медленно вводят 2,5 мкл 1% биотина-CTB в течение 20 с.
  3. Оставьте наконечник иглы на месте в течение 1 мин и медленно снимайте в течение 10 с, чтобы предотвратить утечку.

5. Применение антител

  1. Инкубировать образец в растворе 3 в течение 2 дней при 37 °С на водяной бане.
  2. Инкубировать образец в растворе 4 в течение 2 дней при 37 °C на водяной бане.
  3. Инкубировать с первичным антителом в течение 7 дней при 37 °С на водяной бане.
  4. Промыть раствором 2 по 5 раз, инкубируя 1 ч на стирку. Хранить в растворе 2 в RT на ночь.
  5. Инкубировать с вторичными антителами в течение 7 дней при 37 °C на водяной бане.
  6. промыть в растворе 2 по 5 раз, инкубируя 1 ч на промывку; хранить в Растворе 2 на RT на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы, начиная с 5.6, включая конечное хранение, должны происходить при слабом освещении. Пробоотборники могут быть экранированы алюминиевой фольгой. Концентрации, используемые для антител в этом протоколе, были: TH в 1:100, Iba1 в 1:200 и вторичное антитело в 1:100. Добавьте дополнительный раствор 2 к шагам 5.1-5.6, чтобы обеспечить полное заполнение трубок.

6. Очистка тканей

  1. Инкубировать образец в 20% метаноле/80% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
  2. Инкубировать образец в 40% метаноле/60% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
  3. Инкубировать образец в 60% метаноле/40% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
  4. Инкубировать образец в 80% метаноле/20% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
  5. Инкубировать образец в 100% метаноле в течение 1 ч на РТ.
  6. Инкубировать в свежем 100% метаноле в течение ночи на РТ.
  7. Инкубировать в 66% DCM/33% метаноле в течение 3 ч, при встряхивании, при комнатной температуре.
  8. Инкубировать в дибензиловом эфире (ДБЭ) без встряхивания. Оставьте образец в DBE до очистки и храните в DBE до тех пор, пока не будете визуализии.

7. Монтаж

  1. Получите 3D-печатную камеру из кристаллической смолы Visijet M3 (шаблоны доступны на веб-сайте idisco.info).
  2. Закрепите камеру на слайде микроскопа с помощью эпоксидной смолы.
  3. Поместите образец в квадратное пространство в середине камеры.
  4. Заполните камеру полностью DBE.
  5. Поместите крышку толщиной 0,17 мм на камеру и применяйте давление до тех пор, пока крышка не полностью соприкосется со стенками камеры.
  6. Запечатайте края крышки к камере с помощью эпоксидной смолы.
  7. Поверните камеру, чтобы пузырьки воздуха вытегали из заполнения.
  8. Заполните камеру дополнительным DBE.
  9. Запечатайте заливное отверстие эпоксидной смолой и дайте отверждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избыток DBE будет выплескиваться во время монтажа.

8. Визуализация

  1. Используйте систему конфокального микроскопа для выполнения z-сканирования с 4-кратным увеличением (см. прилагаемое 3D-видео).
  2. Достигайте флуоресцентного возбуждения образца с помощью лазерного набора для излучения на длине волны, аналогичной длине волны, заданной вторичным антителом. Возбуждение TH было достигнуто с использованием лазерного набора HeNe для испускания на 632 нм.
  3. Установите детектор на длину волны, близкую к лазерному излучению. Для настоящего протокола детектор для TH был установлен на 650 нм.
  4. Повышайте коэффициент усиления детектора до тех пор, пока не появится видимый сигнал. Коэффициент усиления 650LP для изображений был установлен на 7,50 B.
  5. Используя опцию «Сканирование» в программном обеспечении для конфокальной визуализации, перемещайте стадию микроскопа до тех пор, пока образец не будет сфокусирован.
  6. Перемещайтесь по ткани на всех равнинах и получайте либо одиночные изображения, либо изображения z-стека с помощью программного обеспечения для конфокальной визуализации.
  7. После завершения визуализации извлеките образец из камеры. Поместите его обратно в трубку, полностью заполненную DBE, и храните в RT в темном месте, предпочтительно покрытом алюминиевой фольгой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть повторно смонтированы и отображены до тех пор, пока сигнал флуоресценции все еще силен.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Полная очистка больших участков ткани мозга крыс f344/N и ВИЧ-1 была достигнута с использованием этого модифицированного протокола очистки гидрофобной ткани. На рисунке 1 показано типичное конфокальное изображение для TH в области черновой субстанции. Рисунок 1А представляет собой плотное, положительное окрашивание. Плотные области, такие как эти, могут быть проанализированы путем фокусировки через плоскость «Z», чтобы подтвердить положительное окрашивание и правильную морфологию клеток. Рисунок 1B представляет собой разреженное положительное окрашивание, которое может быть идентифицировано по различной морфологии нейронов TH. Рисунок 1C представляет ткань, которая не окрашена положительно, но все еще от темного до светло-синего цвета из-за фонового сигнала. Области изображения, которые выглядят как полностью черные, указывают на отсутствие ткани в этой области. Полностью черные области на изображении могут быть связаны с тем, что они находятся на краю образца, отверстием, которое находится в образце, или тканью, которая находится вне фокуса.

На рисунке 2A показана типичная морфология TH-положительного нейрона при 20-кратном увеличении. Правильно окрашенные и сфокусированные конфокальные изображения идеально покажут яркую и четкую флуоресценцию на темном фоне. TH-положительный нейрон имеет большую сому (тело клетки) и несколько ветвящихся процессов16. На фиг.2В показана окрашенная микроглия Iba1, которая имеет мелкие клеточные тела и более короткие расширяющиеся процессы17. Подтверждение правильного окрашивания и ожидаемой морфологии клеток является первым шагом в визуализации.

На рисунке 3 сравнивается идеальное изображение(рисунок 3A)с тремя нежелательными изображениями(рисунок 3B-D). На рисунке 3А показано положительное, яркое окрашивание на ясном, темном фоне. Положительное окрашивание легко отличить от фона. Рисунок 3B является примером неправильно сфокусированного изображения со слишком большим флуоресцентным усилением. На рисунке 3C показан сигнал ложного срабатывания. Яркие пятна, которые не находятся в фокусе с остальной частью ткани, являются артефактами и не должны рассматриваться как положительный сигнал. Рисунок 3D является примером использования блокирующей сыворотки, которая не соответствует вторичному антителу, как предложено в оригинальном протоколе iDISCO4. На этом изображении использование ослиной сыворотки для вторичного антитела, изготовленного у козла, дало изображение с высоким фоновым окрашиванием, которое скрывает способность правильно идентифицировать положительное окрашивание.

На рисунке 4А показано положительное окрашивание CTB в мозге крысы. Длинные тонкие волокна являются афферентными проекциями вдоль дофаминергического пути. На рисунке 4B и рисунке 4C показана колокализация TH и CTB. На рисунке 4Bинъекцию можно увидеть в области прилежащего ядра, которая выглядит как густо флуоресцентный зеленый круг. На рисунке 4С показана колокализация TH и CTB в области черновой субстанции.

Figure 1
Рисунок 1: Конфокальное изображение гидрофобно очищенного образца ткани с маркерами, 4-кратное увеличение. (A) Плотное окрашивание TH в области черной субстанции. (B) Разреженные нейроны TH, прилегающие к нигре субстанции. (C) В ткани отсутствуют положительные нейроны TH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Типичная морфология флуоресцентно меченых TH-положительных нейронов (20-кратное увеличение) и Iba1-положительной микроглии (10-кратное увеличение). (A) Два репрезентативных TH-положительных нейрона. (B) Iba1 положительная микроглия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Идеальные и плохие конфокальные изображения гидрофобно очищенной ткани, 4-кратное увеличение. (A) Плотное окрашивание TH в области черной субстанции, правильно в фокусе с подходящим усилением флуоресценции. (B) Неправильно сфокусированное и чрезмерно экспонируемое изображение. (C) Ложноположительное окрашивание. (D)Высокое окрашивание фона в результате следования неимеленного протокола iDISCO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Маркировка холеройного токсина В вдоль дофаминергического пути, 4-кратное увеличение. (A)Конфокальное изображение положительного окрашивания ДВЗЯИ. (B) Перекрывающееся изображение места инъекции TH и CTB и прилежания ядра. (C)Колокализация TH и CTB в области черновой субстанции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Фильм 1: 3D-фильм z-сканирования образца с 4-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Очистка тканей предлагает решение ограничений традиционного протокола IHC. Прозрачный образец минимизирует рассеяние и поглощение света, что обеспечивает оптический доступ на клеточном уровне к неповрежденным тканям18,19. Методы очистки тканей превращают ткань в прозрачную посредством делипидации, обесцвечивания и декальценции с введением растворителей. Как только показатель преломления образца ткани соответствует индексу преломления выбранной среды визуализации, образец будет казаться полностью прозрачным и может быть правильно изображен3. Настоящий гидрофобный протокол удаляет воду из ткани на начальных этапах обезвоживания, тем самым уменьшая рассеяние света. Ткань проницаема во время предварительной обработки, чтобы обеспечить глубокое проникновение антител. Ткань, которая прошла протокол, может быть легко обработана и может быть изображена несколько раз. При правильном хранении ткани могут по-прежнему предоставлять изображения в течение года после первоначальной обработки.

В настоящем протоколе мы применяем технику гидрофобной очистки тканей к образцам мозговой ткани крыс F344/N и ВИЧ-1 Tg для окрашивания для TH, Iba1 и CTB. После очистки образцы тканей были визуалированы с помощью конфокального микроскопа. Настоящий протокол имеет ряд преимуществ перед другими гидрофобными протоколами, такими как iDISCO4. Во-первых, оригинальный протокол iDISCO был одобрен для использования в тканях мышей, в то время как настоящий протокол является жизнеспособным в ткани мозга крыс. Во-вторых, скорректированное время инкубации на каждом этапе позволяет использовать технику для больших участков ткани. В-третьих, включение соответствующей сыворотки во время инкубации антител (в отличие от использования общей сыворотки) обеспечивает более четкие изображения для анализа.

Хотя настоящий протокол легко адаптируется к потребностям отдельных исследовательских вопросов, существует несколько важных соображений. Протокол занимает, как минимум, 26 последовательных дней от начала до конца. Не оставляйте образец в растворе дольше, чем указано выше. Образец, однако, может храниться в DBE в конце протокола в течение не менее 6 месяцев безопасно до получения изображения, хотя рекомендуется делать изображение как можно скорее. Закажите 3D-печатную камеру, которая будет плотно помещать образец между слайдом микроскопа и крышкой. Все стандартные растворы, за исключением Раствора 1, были смешанными в количестве, которое было подходящим для использования в этот день. Образец следует перемещать в новую пробирку всякий раз, когда вводится новый раствор для предотвращения перекрестного загрязнения. Если рост микроорганизмов вызывает беспокойство, азид натрия можно добавлять в раствор 2, раствор 3, раствор 4, раствор первичного антитела и раствор вторичного антитела в концентрации 0,02% в общем растворе.

В целом, настоящий метод является чрезвычайно универсальной, простой в реализации и недорогой процедурой, которая совместима со многими антителами. С помощью этого протокола, который проверен для работы как у крыс F344/N, так и у крыс с ВИЧ-1 Tg, можно ответить на многие новые вопросы исследовательских исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ни у одного из авторов нет конфликта интересов, о чем можно было бы заявить.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась грантами NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 и грантом обучения T32 5T32GM081740

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 Invitrogen C34775
DBE Sigma-Aldrich 108014-1KG
DCM Sigma-Aldrich 270997-100mL
DMSO Sigma-Aldrich 472301-1L
Glycine Fisher Chemical G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 Invitrogen A32733
Goat serum Sigma Life Science G9023-10mL
Heparin Acros Organics 41121-0010
Iba1 primary antibody FUJIFILM Wako 019-19741
Kwik-sil epoxy VWR 70730-062
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1l-R
PBS Fisher Bioreagents BP2944-100
Perfusion machine VWR 70730-062 mini pump variable flow
PFA Sigma-Aldrich 158127-3KG
TH primary antibody Millipore Sigma AB152
TritonX-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Tween-20 Fisher Bioreagents BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).
  4. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  5. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  6. Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
  7. Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
  8. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
  9. Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
  10. Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).
  11. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152 (2018).
  12. Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
  13. Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
  14. Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
  15. Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
  16. Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
  17. Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  18. Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).

Tags

Неврология Выпуск 166 Очистка тканей иммуногистохимия iDISCO мозг крысы конфокальные
Гидрофобный метод очистки тканей для ткани мозга крыс
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A.… More

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A. R., Harrod, S. B., Mactutus, C. F., Booze, R. M. A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (166), e61821, doi:10.3791/61821 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter