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Neuroscience

Un método de limpieza de tejido hidrófobo para el tejido cerebral de rata

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/61821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

Aquí presentamos un método de limpieza de tejido hidrofóbico que permite la visualización de moléculas objetivo como parte de estructuras cerebrales intactas. Esta técnica ha sido validada para el control de F344/N y ratas transgénicas VIH-1 de ambos sexos.

Abstract

Los métodos de limpieza de tejido hidrofóbico son procedimientos fácilmente ajustables, rápidos y de bajo costo que permiten el estudio de una molécula de interés en muestras de tejido inalteradas. Los procedimientos tradicionales de inmunoetiquetado requieren cortar la muestra en secciones delgadas, lo que restringe la capacidad de etiquetar y examinar estructuras intactas. Sin embargo, si el tejido cerebral puede permanecer intacto durante el procesamiento, las estructuras y los circuitos pueden permanecer intactos para el análisis. Los métodos de limpieza previamente establecidos toman un tiempo significativo para limpiar completamente el tejido, y los productos químicos agresivos a menudo pueden dañar los anticuerpos sensibles. El método iDISCO elimina rápida y completamente el tejido, es compatible con muchos anticuerpos y no requiere equipo de laboratorio especial. Esta técnica fue validada inicialmente para su uso en tejido de ratones, pero el protocolo actual adapta este método a la imagen de hemisferios de cerebros de ratas de control y transgénicos. Además de esto, el protocolo actual también realiza varios ajustes al protocolo preexistente para proporcionar imágenes más claras con menos manchas de fondo. Los anticuerpos para Iba-1 y tirosina hidroxilasa se validaron en la rata transgénica VIH-1 y en ratas control F344/N utilizando el actual método de limpieza de tejido hidrófobo. El cerebro es una red entrelazada, donde las estructuras trabajan juntas más a menudo que separadamente unas de otras. Analizar el cerebro como un sistema completo en lugar de una combinación de piezas individuales es el mayor beneficio de todo este método de limpieza cerebral.

Introduction

Se han validado varias técnicas de limpieza de tejidos para su uso en el cerebro: hidrogel, hidrófilo e hidrófobo. Estas técnicas tienen como objetivo hacer que un tejido sea transparente a través de la delipidación, la decoloración y la descalcificación a través de la administración de disolventes. Una vez que el índice de refracción de la muestra de tejido coincide con el índice de refracción del medio de imagen elegido, se puede obtener una imagen clara de la muestra. Las técnicas basadas en hidrogel, como CLARITY, aseguran las biomoléculas en el tejido uniéndolas a hidrogeles a base de acrilo, lo que evita el daño estructural y la pérdida de proteínas1. Sin embargo, las técnicas de hidrogel utilizan productos químicos agresivos que tienen el potencial de dañar tejidos más frágiles, y las muestras de tejido más densas pueden no ser compatibles con el protocolo de hidrogel. Ciertas técnicas de hidrogel pueden requerir equipos costosos o conducir a la expansión del tejido. Las técnicas hidrófilas, como CUBIC, preservan la estructura 3D a través de la formación de enlaces de hidrógeno dentro del tejido2. La expansión del tejido también puede ocurrir en cierto protocolo hidrófilo. La capacidad de limpieza de las técnicas hidrofílicas a menudo no coincide con la capacidad que tienen las técnicas hidrofóbicas, lo cual es importante para tejidos más densos y gruesos3.

Las técnicas hidrofóbicas suelen ser rápidas, no requieren equipos especiales y producen una muestra que es fácil de manejar y almacenar. iDISCO es una técnica hidrofóbica que elimina la contracción que puede producirse en otros protocolos hidrófobos. Originalmente, la técnica de limpieza de tejidos iDISCO fue descrita por Renier et al.4 para los embriones y órganos densos y adultos de ratones. Esta técnica elimina el agua del tejido en el paso inicial de deshidratación, reduciendo así la dispersión de la luz. El tejido se permeabiliza durante el pretratamiento para permitir la penetración profunda de anticuerpos. Los colorantes Alexa Fluor en el espectro rojo lejano se utilizan para el inmunoetiquetado para evitar la autofluorescencia del tejido en longitudes de onda más bajas5. El tejido que se ha sometido a protocolos de limpieza hidrofóbica se puede manejar fácilmente y se puede obtener imágenes varias veces debido a la longevidad de los tintes Alexa Fluor. Si se almacenan adecuadamente, los tejidos pueden proporcionar imágenes durante meses a un año después del procesamiento inicial.

En el presente protocolo, el anticuerpo tirosina hidroxilasa (TH), el anticuerpo Iba1 y la subunidad B de la toxina del cólera (CTB) se utilizaron en el control masculino y femenino y en los cerebros de ratas transgénicas (Tg) del VIH-1. La rata VIH-1 Tg posee siete de los nueve genes que componen el genoma viral del VIH-1, lo que conduce a un modelo no infeccioso de exposición a largo plazo a la proteína VIH-16,7,8. Las alteraciones dopaminérgicas se han demostrado previamente en la rata VIH-1 Tg, y el VIH-1 en sí es una enfermedad inflamatoria, por lo que la elección del anticuerpo fue relevante para el diseño experimental9,10,11,12. CTB es un trazador que se adhiere a las neuronas a través de la unión gangliósido y se puede utilizar para rastrear proyecciones aferentes en el cerebro. CTB se ha utilizado previamente para estudiar proyecciones desde el núcleo accumbens hasta el área de la sustancia negra, dos áreas del cerebro muy involucradas con las vías dopaminérgicas13,14,15.

En este protocolo, TH servirá como marcador para la producción de dopamina, e Iba1 marcará la microglía activada. El anticuerpo TH utilizado marca selectivamente una sola banda a aproximadamente 62 kDa que corresponde a la tirosina hidroxilasa. El anticuerpo Iba1 corresponde a la secuencia carboxi-terminal Iba1. Ambos anticuerpos fueron criados en conejo y eran policlonales. CTB se utilizará para el rastreo retrógrado de neuronas desde el área del núcleo accumbens hasta el área de la sustancia negra. El protocolo actual también ofrece una guía para el ajuste del protocolo iDISCO original de dos maneras distintas: 1) reducción general de la tinción de fondo mediante el cambio de los reactivos séricos en los pasos de bloqueo, y 2) escalado del tiempo de incubación para que sea adecuado para muestras de tejido más grandes. En general, el presente protocolo proporciona evidencia continua de que las técnicas de limpieza hidrofóbica son factibles en los tejidos cerebrales de la rata, no tienen interacciones perjudiciales discernibles con las proteínas virales del VIH-1 y son compatibles con el anticuerpo TH, el anticuerpo Iba1 y el CTB.

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Protocol

Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur.

1. Preparación de la solución de stock

  1. Solución 1 (1 L): A 900 mL de H2O desionizado añadir 100 mL de solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS) y 2 mL de Tritón X-100.
  2. Solución 2 (1 L): A 900 mL de H2O desionizado, añadir 100 mL de 10x PBS, 2mL de Tween-20 y 1 mL de solución stock de heparina de 10 mg/mL.
  3. Solución 3 (500 ml): A 400 ml de solución 1, agregue 11,5 g de glicina y 100 ml de dimetilsulfóxido (DMSO).
  4. Solución 4 (50 mL): A 42 mL de Solución 1, agregue 3 mL de suero correspondiente y 5 mL de DMSO.
  5. Solución primaria de anticuerpos (50 ml): A 46 ml de solución 2, agregue 2,5 ml de DMSO y 1,5 ml de suero correspondiente.
  6. Solución secundaria de anticuerpos (50 ml): A 48,5 ml de solución 2, añadir 1,5 ml de suero correspondiente.
    NOTA: Para la solución 4, solución primaria y solución secundaria, use un suero que corresponda con el anticuerpo secundario (por ejemplo, cabra, caballo, bovino).

2. Preparación de la muestra

NOTA: Realice los pasos 2.1 a 2.7 en una campana extractora de humos debido a limitar la exposición a PFA.

  1. Anestesiar profundamente a las ratas jóvenes (3-6 semanas) usando sevoflurano; proceda a 2.2 cuando la rata no responda y no responda al pellizco del dedo del dedo del dedo del día y la cola.
  2. Coloque a la rata en posición supina y haga una incisión a través de la pared abdominal con un par de tijeras Iris.
  3. Corta a través de la parte inferior de la caja torácica hasta la clavícula a ambos lados de la caja torácica con tijeras Mayo.
  4. Coloque el esternón y las costillas lejos del corazón y los pulmones con un hemostático.
  5. Perfora el ventrículo izquierdo con una aguja de 23 G conectada a una bomba de perfusión y corta la aurícula derecha con tijeras Iris.
  6. Realizar perfusión transcárdica con aproximadamente 75 mL de 100 mM (1x) PBS.
  7. Continuar la perfusión transcárdica con aproximadamente 100 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) tamponado en 1x PBS.
  8. Retire el cerebro del cráneo usando pórceps.
  9. Coloque el cerebro en posición sagital y corte en 4 secciones iguales (aproximadamente 3 mm de ancho) usando una cuchilla de afeitar y una matriz cerebral de rata.
  10. Fije cada sección en 4% de PFA en 1x PBS en un tubo de plástico sellado de 5 ml durante la noche a 4 ° C en un agitador.
  11. Continúe fijando en 4% PFA en 1x PBS a temperatura ambiente (RT) en un agitador durante 1 h.
  12. Lave cada sección con 1x PBS en RT durante 30 min, 3 veces.

3. Deshidratación y despigmentación

  1. Incubar la muestra en una solución de metanol al 20%/80% de agua desionizada durante 1 h a RT.
  2. Incubar la muestra en una solución de metanol al 40%/60% de agua desionizada durante 1 h en RT.
  3. Incubar la muestra en una solución de metanol al 60%/40% de agua desionizada durante 1 h en RT.
  4. Incubar la muestra en una solución de metanol al 80%/20% de agua desionizada durante 1 h a RT.
  5. Incubar la muestra en metanol al 100% durante 1 h en RT. Repetir con más 100% de metanol, incubando durante 1 h en RT.
  6. Enfriar la muestra en metanol al 100% a 4° C durante aproximadamente 10 min.
  7. Prepare una solución de diclorometano al 66% (DCM)/metanol al 33%.
  8. Incubar la muestra durante la noche en la solución de DCM/metanol en RT, con agitación.
  9. Lavar con metanol en RT durante 30 min, 2 veces.
  10. Enfriar la muestra en metanol al 100% a 4° C durante aproximadamente 10 min.
  11. Blanquear en peróxido de hidrógeno al 5% refrigerado y recién preparado en metanol durante la noche a 4 ° C.
  12. Incubar la muestra en una solución de metanol al 80%/20% de agua desionizada durante 1 h a RT.
  13. Incubar la muestra en una solución de metanol al 60%/40% de agua desionizada durante 1 h en RT.
  14. Incubar la muestra en una solución de metanol al 40%/60% de agua desionizada durante 1 h en RT.
  15. Incubar la muestra en una solución de metanol al 20%/80% de agua desionizada durante 1 h a RT.
  16. Incubar la muestra en 1x PBS durante 1 h en RT.
  17. Lavar en solución 1 durante 1 h en RT, 2 veces.

4. Etiquetado de la subunidad B de la toxina del cólera

  1. Inserte la punta de la aguja de la jeringa de 1 ml en el sitio del núcleo accumbens.
  2. Inyecte lentamente 2,5 μL de biotina-CTB al 1% durante 20 s.
  3. Deje la punta de la aguja en su lugar durante 1 minuto y retire lentamente durante 10 s para evitar fugas.

5. Aplicación de anticuerpos

  1. Incubar la muestra en la Solución 3 durante 2 días a 37 °C en un baño de agua.
  2. Incubar la muestra en la Solución 4 durante 2 días a 37 °C en un baño de agua.
  3. Incubar con anticuerpo primario durante 7 días a 37 °C en un baño de agua.
  4. Lavar en Solución 2 por 5 veces, incubando 1 h por lavado. Almacene en la Solución 2 en RT durante la noche.
  5. Incubar con anticuerpos secundarios durante 7 días a 37 °C en baño de agua.
  6. Lavar en solución 2 por 5 veces, incubando 1 h por lavado; almacenar en la Solución 2 en RT durante la noche.
    NOTA: Todos los pasos a partir de 5.6 en adelante, incluido el almacenamiento final, deben realizarse con poca luz. Los tubos de muestra se pueden blindar con papel de aluminio. Las concentraciones utilizadas para los anticuerpos en este protocolo fueron: TH a 1:100, Iba1 a 1:200 y el anticuerpo secundario a 1:100. Agregue la Solución 2 adicional a los pasos 5.1-5.6 para asegurarse de que los tubos estén completamente llenos.

6. Limpieza de tejidos

  1. Incubar la muestra en una solución de metanol al 20%/80% de agua desionizada durante 1 h a RT.
  2. Incubar la muestra en una solución de metanol al 40%/60% de agua desionizada durante 1 h en RT.
  3. Incubar la muestra en una solución de metanol al 60%/40% de agua desionizada durante 1 h en RT.
  4. Incubar la muestra en una solución de metanol al 80%/20% de agua desionizada durante 1 h a RT.
  5. Incubar la muestra en metanol al 100% durante 1 h en RT.
  6. Incubar en fresco 100% metanol durante la noche en RT.
  7. Incubar en 66% DCM/33% metanol durante 3 h, con agitación, a temperatura ambiente.
  8. Incubar en éter dibencil (DBE) sin agitar. Deje la muestra en DBE hasta que esté clara y guárdela en DBE hasta la obtención de imágenes.

7. Montaje

  1. Obtenga una cámara impresa en 3D hecha de resina Visijet M3 Crystal (plantillas disponibles en el sitio web de idisco.info).
  2. Asegure la cámara a un portaobjetos de microscopio con un epoxi.
  3. Coloque la muestra en el espacio cuadrado en el centro de la cámara.
  4. Llene la cámara completamente con DBE.
  5. Coloque una cubierta de 0,17 mm de espesor sobre la cámara y aplique presión hasta que la cubierta tenga contacto completo con las paredes de la cámara.
  6. Selle los bordes de la cubierta a la cámara con el epoxi.
  7. Gire la cámara para permitir que las burbujas de aire escapen de la entrada de llenado.
  8. Llene la cámara con DBE adicional.
  9. Selle la entrada de relleno con epoxi y deje curar.
    NOTA: El exceso de DBE se derramará durante el montaje.

8. Imágenes

  1. Utilice un sistema de microscopio confocal para realizar el escaneo z a un aumento de 4x (vea el video 3Dadjunto).
  2. Lograr la excitación fluorescente de la muestra utilizando un conjunto láser para emitir a una longitud de onda similar a la longitud de onda especificada por el anticuerpo secundario. La excitación TH se logró utilizando un conjunto de láser HeNe para emitir a 632 nm.
  3. Configure el detector a una longitud de onda cercana a la emisión del láser. Para el protocolo actual, el detector para TH se estableció en 650 nm.
  4. Aumente la ganancia del detector hasta que haya una señal visible. La ganancia de 650LP para imágenes se estableció en 7.50 B.
  5. Usando la opción Escanear en el software de imágenes confocales, mueva la etapa del microscopio hasta que la muestra se enfoque.
  6. Navegue por el tejido en todas las llanuras y obtenga imágenes individuales o imágenes de pila z utilizando el software de imágenes confocales.
  7. Una vez que se completen las imágenes, retire la muestra de la cámara. Vuelva a colocarlo en un tubo completamente lleno de DBE y guárdelo en RT en un lugar oscuro, preferiblemente cubierto de papel de aluminio.
    NOTA: Las muestras se pueden volver a montar y tomar imágenes siempre que la señal de florescencia siga siendo fuerte.

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Representative Results

La limpieza completa de grandes secciones de tejido cerebral de rata F344 / N y VIH-1 se logró utilizando este protocolo de limpieza de tejido hidrófobo modificado. La Figura 1 muestra una imagen confocal típica para TH en la región de la sustancia negra. La Figura 1A representa la tinción densa y positiva. Las áreas densas como estas se pueden analizar enfocando a través del plano "Z" para confirmar la tinción positiva y la morfología celular adecuada. La Figura 1B representa una tinción positiva escasa, que puede ser identificada por la morfología distintiva de las neuronas TH. La Figura 1C representa el tejido que no está teñido positivamente, pero que sigue siendo de color oscuro a azul claro debido a la señal de fondo. Las áreas de la imagen que aparecen como completamente negras indican una ausencia de tejido en esa área. Las áreas completamente negras en la imagen pueden deberse a estar en el borde de la muestra, un agujero que está en la muestra o tejido que está desenfocada.

La Figura 2A muestra la morfología típica de una neurona TH positiva a un aumento de 20x. Las imágenes confocales correctamente teñidas y enfocadas idealmente mostrarán una fluorescencia brillante y nítida contra un fondo oscuro. Una neurona TH positiva tiene un soma grande (cuerpo celular) y varios procesos de ramificación16. La Figura 2B muestra la microglía teñida de Iba1, que tiene cuerpos celulares pequeños y procesos de extensión más cortos17. La confirmación de la tinción adecuada y la morfología celular esperada es el primer paso en la obtención de imágenes.

La Figura 3 compara una imagen ideal(Figura 3A)con tres imágenes indeseables(Figura 3B-D). La Figura 3A muestra una tinción positiva y brillante contra un fondo claro y oscuro. La tinción positiva es fácilmente distinguible del fondo. La Figura 3B es un ejemplo de una imagen mal enfocada con demasiada ganancia fluorescente. La Figura 3C muestra una señal de falso positivo. Los puntos brillantes que no están enfocados con el resto del tejido son artefactos y no deben considerarse como una señal positiva. La Figura 3D es un ejemplo de uso de un suero bloqueador que no coincide con el anticuerpo secundario, como se sugiere en el protocolo iDISCO original4. En esta imagen, el uso de suero de burro para un anticuerpo secundario hecho en cabra produjo una imagen con alta tinción de fondo, lo que oscurece la capacidad de identificar adecuadamente la tinción positiva.

La Figura 4A muestra una tinción positiva de CTB en el cerebro de la rata. Las fibras largas y delgadas son proyecciones aferentes a lo largo de la vía dopaminérgica. La Figura 4B y la Figura 4C muestran la colocalización de TH y CTB. En la Figura 4B,la inyección se puede ver en el área del núcleo accumbens, que aparece como un círculo verde densamente fluorescente. La Figura 4C muestra la colocalización de TH y CTB en el área de la sustancia negra.

Figure 1
Figura 1: Imagen confocal de una muestra de tejido hidrofóbicamente despejada con marcadores, aumento de 4x. (A) Tinción de TH densa en el área de la sustancia negra. (B) Neuronas TH dispersas adyacentes a la sustancia negra. (C) Tejido carente de neuronas TH positivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Morfología típica de neuronas TH positivas con marca fluorescente (aumento de 20x) y microglia positiva de Iba1 (aumento de 10x). (A) Dos neuronas TH positivas representativas. (B) Microglía positiva Iba1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imágenes confocales ideales y pobres de tejido hidrofóbico despejado, aumento 4x. (A) Tinción de TH densa en el área de la sustancia negra, debidamente enfocada con una ganancia de fluorescencia adecuada. (B) Una imagen mal enfocada y sobreexpuesta. (C) Tinción de falsos positivos. (D) Alta tinción de fondo como resultado de seguir el protocolo iDISCO inalterado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Etiquetado de la toxina B del cólera a lo largo de la vía dopaminérgica, aumento de 4x. (A) Imagen confocal de tinción positiva de CTB. (B) Imagen superpuesta de TH y CTB y el sitio de inyección de núcleo accumbens. (C) Colocalización de TH y CTB en el área de sustancia negra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1: Película 3D de escaneo z de la muestra a un aumento de 4x. Haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

La limpieza de tejidos ofrece una solución a las limitaciones del protocolo IHC tradicional. Una muestra que es transparente minimiza la dispersión y absorción de la luz, lo que proporciona acceso óptico a nivel celular a los tejidos intactos18,19. Las técnicas de limpieza de tejidos vuelven un tejido transparente a través de la delipidación, decoloración y descalcificación con la administración de disolventes. Una vez que el índice de refracción de la muestra de tejido coincide con el índice de refracción del medio de imagen elegido, la muestra aparecerá completamente transparente y se puede obtener una imagen adecuada3. El protocolo hidrofóbico actual elimina el agua del tejido en los pasos iniciales de deshidratación, reduciendo así la dispersión de la luz. El tejido se permeabiliza durante el pretratamiento para permitir la penetración profunda de anticuerpos. El tejido que se ha sometido al protocolo se puede manejar fácilmente y se puede obtener una imagen varias veces. Si se almacenan adecuadamente, los tejidos aún pueden proporcionar imágenes hasta un año después del procesamiento inicial.

En el presente protocolo, aplicamos una técnica de limpieza de tejido hidrofóbico a muestras de tejido cerebral de rata F344 / N y VIH-1 Tg para teñir TH, Iba1 y CTB. Después de la limpieza, las muestras de tejido se tomaron imágenes utilizando un microscopio confocal. El presente protocolo tiene varias ventajas sobre otros protocolos hidrófobos, como iDISCO4. En primer lugar, el protocolo iDISCO original fue validado para su uso en tejido de ratones, mientras que el protocolo actual es viable en tejido cerebral de rata. En segundo lugar, el tiempo de incubación ajustado en cada paso permite que la técnica se utilice para secciones de tejido más grandes. En tercer lugar, incluir el suero correspondiente durante la incubación de anticuerpos (a diferencia del uso de un suero general) proporciona imágenes más claras para el análisis.

Si bien el presente protocolo es fácilmente adaptable para satisfacer las necesidades de las preguntas de investigación individuales, hay varias consideraciones importantes. El protocolo tarda, como mínimo, 26 días consecutivos de principio a fin. No deje la muestra en una solución por más tiempo del indicado anteriormente. Sin embargo, la muestra puede almacenarse en DBE al final del protocolo durante al menos 6 meses de forma segura hasta la obtención de imágenes, aunque se recomienda obtener imágenes lo antes posible. Solicite una cámara impresa en 3D que se ajuste perfectamente a la muestra entre el portaobjetos del microscopio y la cubierta. Todas las soluciones de stock, aparte de la Solución 1, se mezclaron día a día en una cantidad que fuera apropiada para el uso de ese día. La muestra debe trasladarse a un nuevo tubo cada vez que se introduzca una nueva solución para evitar la contaminación cruzada. Si el crecimiento microbiano es motivo de preocupación, la azida de sodio se puede agregar a la Solución 2, Solución 3, Solución 4, la solución primaria de anticuerpos y la solución secundaria de anticuerpos a una concentración de 0.02% en la solución total.

En general, la técnica actual es un procedimiento extremadamente versátil, fácil de implementar y de bajo costo que es compatible con muchos anticuerpos. Con este protocolo que está validado para funcionar tanto en el control de F344 / N como en ratas Tg de VIH-1, se pueden responder muchas nuevas preguntas de investigación.

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Disclosures

Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por subvenciones de los NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 y por T32 Training Grant 5T32GM081740

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 Invitrogen C34775
DBE Sigma-Aldrich 108014-1KG
DCM Sigma-Aldrich 270997-100mL
DMSO Sigma-Aldrich 472301-1L
Glycine Fisher Chemical G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 Invitrogen A32733
Goat serum Sigma Life Science G9023-10mL
Heparin Acros Organics 41121-0010
Iba1 primary antibody FUJIFILM Wako 019-19741
Kwik-sil epoxy VWR 70730-062
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1l-R
PBS Fisher Bioreagents BP2944-100
Perfusion machine VWR 70730-062 mini pump variable flow
PFA Sigma-Aldrich 158127-3KG
TH primary antibody Millipore Sigma AB152
TritonX-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Tween-20 Fisher Bioreagents BP337-500

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References

  1. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).
  4. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  5. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  6. Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
  7. Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
  8. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
  9. Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
  10. Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).
  11. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152 (2018).
  12. Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
  13. Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
  14. Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
  15. Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
  16. Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
  17. Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  18. Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).

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Neurociencia Número 166 limpieza de tejidos inmunohistoquímica iDISCO cerebro rata confocal
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Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A. R., Harrod, S. B., Mactutus, C. F., Booze, R. M. A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (166), e61821, doi:10.3791/61821 (2020).

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