Summary
Här presenterar vi en hydrofobisk vävnadsrensningsmetod som möjliggör visning av målmolekyler som en del av intakta hjärnstrukturer. Denna teknik har nu validerats för F344/N kontroll och HIV-1 transgena råttor av båda könen.
Abstract
Hydrofobiska vävnadsrensningsmetoder är lätt justerbara, snabba och billiga förfaranden som möjliggör studier av en molekyl av intresse för oförändrade vävnadsprover. Traditionella immunolabeling förfaranden kräver att provet skärs i tunna sektioner, vilket begränsar förmågan att märka och undersöka intakta strukturer. Men om hjärnvävnad kan förbli intakt under bearbetningen kan strukturer och kretsar förbli intakta för analysen. Tidigare etablerade clearingmetoder tar betydande tid att rensa vävnaden helt, och de hårda kemikalierna kan ofta skada känsliga antikroppar. IDISCO-metoden rensar snabbt och helt vävnad, är kompatibel med många antikroppar och kräver ingen speciell labbutrustning. Denna teknik validerades ursprungligen för användning i möss vävnad, men det nuvarande protokollet anpassar denna metod till bild halvklot av kontroll och transgena råtta hjärnor. Utöver detta gör det nuvarande protokollet också flera justeringar av befintliga protokoll för att ge tydligare bilder med mindre bakgrundsfärgning. Antikroppar för Iba-1 och tyrosinhydroxilas validerades hos den transgena hiv-1-råttan och hos F344/N-kontrollråttor med den nuvarande hydrofobiska vävnadsrensningsmetoden. Hjärnan är ett sammanvävt nätverk, där strukturer arbetar tillsammans oftare än separat av varandra. Att analysera hjärnan som helhetssystem i motsats till en kombination av enskilda bitar är den största fördelen med hela denna hjärnrensningsmetod.
Introduction
Flera vävnadsrensningstekniker har validerats för användning i hjärnan: hydrogel, hydrofil och hydrofobisk. Dessa tekniker syftar till att vända en vävnad transparent genom delipidation, avfärgning och avkalkning via administrering av lösningsmedel. När brytningsindexet för vävnadsprovet matchar det valda bildmediets brytningsindex kan en tydlig bild av provet erhållas. Hydrogelbaserade tekniker, såsom CLARITY, säkrar biomolekyler i vävnaden genom att koppla dem till akrylbaserade hydrogeler, vilket förhindrar strukturella skador och förlust av proteiner1. Hydrogeltekniker använder dock hårda kemikalier än vad som kan skada mer ömtåliga vävnader, och tätare vävnadsprover kanske inte är kompatibla med hydrogelprotokollet. Vissa hydrogeltekniker kan kräva dyr utrustning eller leda till vävnadsexpansion. Hydrofila tekniker, som CUBIC, bevarar 3D-struktur genom bildandet av vätebindningar ivävnaden 2. Vävnad expansion kan också uppstå i vissa hydrofila protokoll. Clearingförmågan hos hydrofila tekniker matchar ofta inte den förmåga som hydrofobiska tekniker har, vilket är viktigt för tätare och tjockarevävnader 3.
Hydrofobiska tekniker är vanligtvis snabba, kräver inte speciell utrustning och producerar ett prov som är lätt att hantera och lagra. iDISCO är en hydrofobisk teknik som eliminerar krympningen som kan uppstå i andra hydrofobiska protokoll. Ursprungligen beskrevs iDISCO vävnad clearing teknik av Renier et al.4 för embryon och täta, vuxna organ av möss. Denna teknik tar bort vatten från vävnaden i det första uttorkningssteget, vilket minskar ljusspridningen. Vävnaden genomsyras under förbehandlingen för att möjliggöra djup antikroppspenetration. Alexa Fluorfärgämnen i det långröda spektrumet används för immunolabeling för att undvika autofluorescens av vävnaden vid lägrevåglängder 5. Vävnad som har genomgått hydrofobiska clearingprotokoll kan hanteras enkelt och kan avbildas flera gånger på grund av livslängden hos Alexa Fluor-färgämnena. Om vävnaderna lagras korrekt kan de ge bilder i månader till ett år efter den första bearbetningen.
I detta protokoll användes tyrosinhydroxilas (TH) antikroppar, Iba1 antikroppar och Kolera Toxin Subunit B (CTB) på både manliga och kvinnliga kontroll och HIV-1 transgena (Tg) råtta hjärnor. HIV-1 Tg-råttan har sju av de nio gener som utgör hiv-1-virusgenomet, vilket leder till en icke-infektiös modell av långvarig HIV-1 proteinexponering6,7,8. Dopaminerga förändringar har tidigare visats hos HIV-1 Tg-råttan, och HIV-1 i sig är en inflammatorisk sjukdom, så antikroppsvalet var relevant för den experimentella designen9,10,11,12. CTB är en spårämne som fäster vid nervceller via gangliosidebindning och kan användas för att spåra afferenta projektioner i hjärnan. CTB har tidigare använts för att studera projektioner från kärnan accumbens till substantia nigra området, två områden i hjärnan starkt involverade i dopaminerga vägar13,14,15.
I detta protokoll kommer TH att fungera som en markör för dopaminproduktion, och Iba1 kommer att markera aktiverad mikroglia. TH-antikroppen som används märker selektivt ett enda band på cirka 62 kDa som motsvarar tyrosinhydroxilas. Iba1-antikroppen motsvarar Iba1-karboxeterminalsekvensen. Båda antikropparna höjdes i kanin och var polyklonala. CTB kommer att användas för bakåtsträvande spårning av nervceller från nucleus accumbens-området till substantia nigra-området. Det nuvarande protokollet erbjuder också en riktlinje för justering av det ursprungliga iDISCO-protokollet på två olika sätt: 1) övergripande minskning av bakgrundsfärgningen genom att ändra serumreagenserna i blockeringsstegen och 2) skalning av inkubationstiden för att vara lämplig för större vävnadsprover. Sammantaget ger detta protokoll fortsatta bevis för att hydrofobiska clearingtekniker är genomförbara i hjärnans vävnader hos råttan, har inga märkbara skadliga interaktioner med HIV-1-virusproteiner och är kompatibla med TH-antikroppar, Iba1-antikroppar och CTB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprotokoll granskades och godkändes av Animal Care and Use Committee vid University of South Carolina.
1. Beredning av stamlösning
- Lösning 1 (1 L): Till 900 ml avjoniserad H2O tillsätt 100 ml 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 2 ml Triton X-100.
- Lösning 2 (1 L): Till 900 ml avjoniserad H2O, tillsätt 100 ml 10x PBS, 2mL Tween-20 och 1 ml 10 mg/mL Heparin stamlösning.
- Lösning 3 (500 ml): Tillsätt 11,5 g glycin och 100 ml dimetylsulfoxid (DMSO) till 400 ml lösning 1.
- Lösning 4 (50 ml): Tillsätt 3 ml motsvarande serum och 5 ml DMSO till 42 ml lösning 1.
- Primär antikroppslösning (50 ml): Till 46 ml lösning 2 tillsätt 2,5 ml DMSO och 1,5 ml motsvarande serum.
- Sekundär antikroppslösning (50 ml): Tillsätt 1,5 ml motsvarande serum till 48,5 ml lösning 2.
OBS: För lösning 4, primär lösning och sekundär lösning, använd ett serum som motsvarar den sekundära antikroppen (t.ex. get, häst, nötkreatur).
2. Provberedning
OBS: Utför steg 2.1 till 2.7 i en rökhuv på grund av att exponeringen för PFA är begränsad.
- Djupt bedöva ung (3-6 veckor) råtta med sevofluran; fortsätt till 2,2 när råttan inte reagerar och inte svarar på tå och svansnypa.
- Lägg råttan i ett supinläge och gör ett snitt genom bukväggen med hjälp av en par Iris-saxar.
- Skär upp genom botten av revbenskorgen till nyckelbenet på båda sidor av revbensburen med Mayo-sax.
- Fäst bröstbenet och revbenen bort från hjärtat och lungorna med en hemostat.
- Genomborra den vänstra ventrikeln med en 23 G nål fäst vid en perfusionspump och skär det högra atriumet med Iris sax.
- Utför transkardiell perfusion med cirka 75 ml 100 mM (1x) PBS.
- Fortsätt transkardiell perfusion med cirka 100 ml 4% paraformaldehyd (PFA) buffrat i 1x PBS.
- Ta bort hjärnan från skallen med tång.
- Placera hjärnan i sagittal position och skär i 4 lika stora sektioner (ca 3 mm i bredd) med hjälp av ett rakblad och en råtta hjärnmatris.
- Fixera varje sektion i 4% PFA i 1x PBS i ett förseglat 5mL plaströr över natten vid 4 °C på en skakapparat.
- Fortsätt att fixera i 4% PFA i 1x PBS vid rumstemperatur (RT) på en skakapparat i 1 timme.
- Tvätta varje sektion med 1x PBS på RT i 30 min, 3 gånger.
3. Uttorkning och utplottning
- Inkubera provet i en 20% metanol/80% avjoniserad vattenlösning i 1 timme på RT.
- Inkubera provet i en 40% metanol/60% avjoniserad vattenlösning i 1 timme på RT.
- Inkubera provet i en 60% metanol/40% avjoniserad vattenlösning i 1 timme på RT.
- Inkubera provet i en 80% metanol/20% avjoniserad vattenlösning i 1 timme på RT.
- Inkubera provet i 100% metanol i 1 h vid RT. Upprepa med mer 100% metanol och inkubera i 1 h på RT.
- Kyl provet i 100% metanol vid 4°C i ca 10 min.
- Förbered en 66% diklormetan (DCM)/33% metanollösning.
- Inkubera provet över natten i DCM/metanollösningen på RT, med skakningar.
- Tvätta med metanol på RT i 30 min, 2 gånger.
- Kyl provet i 100% metanol vid 4°C i ca 10 min.
- Blekmedel i kyld, nylagad 5% väteperoxid i metanol över natten vid 4° C.
- Inkubera provet i en 80% metanol/20% avjoniserad vattenlösning i 1 timme på RT.
- Inkubera provet i en 60% metanol/40% avjoniserad vattenlösning i 1 timme på RT.
- Inkubera provet i en 40% metanol/60% avjoniserad vattenlösning i 1 timme på RT.
- Inkubera provet i en 20% metanol/80% avjoniserad vattenlösning i 1 timme på RT.
- Inkubera provet i 1x PBS i 1 timme på RT.
- Tvätta i lösning 1 i 1 timme på RT, 2 gånger.
4. Koleratoxin underavdelning B märkning
- Sätt in nålspetsen på 1 ml spruta i kärnans accumbensställe.
- Injicera långsamt 2,5 μL 1% biotin-CTB över 20 s.
- Låt nålspetsen vara på plats i 1 minut och ta långsamt bort över 10 s för att förhindra läckage.
5. Antikroppsapplikation
- Inkubera provet i lösning 3 i 2 dagar vid 37 °C i ett vattenbad.
- Inkubera provet i lösning 4 i 2 dagar vid 37 °C i ett vattenbad.
- Inkubera med primär antikropp i 7 dagar vid 37 °C i ett vattenbad.
- Tvätta i lösning 2 i 5 gånger och inkubera 1 timme per tvätt. Förvara i lösning 2 på RT över natten.
- Inkubera med sekundär antikropp i 7 dagar vid 37 °C i vattenbad.
- Tvätta i lösning 2 i 5 gånger och inkubera 1 timme per tvätt; i lösning 2 på RT över natten.
OBS: Alla steg från 5,6 och framåt, inklusive slutförvaring, bör ske i svagt ljus. Provrören kan avskärmas med aluminiumfolie. Koncentrationerna som användes för antikropparna i detta protokoll var: TH vid 1:100, Iba1 vid 1:200 och den sekundära antikroppen vid 1:100. Lägg till ytterligare lösning 2 i steg 5.1-5.6 för att säkerställa att rören är helt fyllda.
6. Vävnadsrensning
- Inkubera provet i en 20% metanol/80% avjoniserad vattenlösning i 1 timme på RT.
- Inkubera provet i en 40% metanol/60% avjoniserad vattenlösning i 1 timme på RT.
- Inkubera provet i en 60% metanol/40% avjoniserad vattenlösning i 1 timme på RT.
- Inkubera provet i en 80% metanol/20% avjoniserad vattenlösning i 1 timme på RT.
- Inkubera provet i 100% metanol i 1 timme på RT.
- Inkubera i färsk 100% metanol över natten på RT.
- Inkubera i 66% DCM/33% metanol i 3 h, med skakningar, vid rumstemperatur.
- Inkubera i dibenzyleter (DBE) utan skakningar. Lämna provet i DBE tills det är klart och förvaras i DBE tills det avbildningar.
7. Montering
- Skaffa en 3D-utskriven kammare av Visijet M3 Crystal harts (mallar finns på idisco.info webbplats).
- Fäst kammaren på en mikroskopbild med en epoxi.
- Placera provet i det fyrkantiga utrymmet i mitten av kammaren.
- Fyll kammaren helt med DBE.
- Placera ett 0,17 mm tjockt täckslip över kammaren och tryck tills täcket har full kontakt med kammarväggarna.
- Försegla täckglasets kanter till kammaren med hjälp av epoxi.
- Rotera kammaren så att luftbubblor kan komma ut ur påfyllningsintaget.
- Fyll kammaren med ytterligare DBE.
- Försegla påfyllningsintaget med epoxi och låt härda.
OBS: Överskott av DBE kommer att spilla ut under monteringen.
8. Bildbehandling
- Använd ett konfokalt mikroskopsystem för att utföra z-scan vid 4x förstoring (se bifogad 3D-video).
- Uppnå fluorescerande excitation av provet med hjälp av en laseruppsättning för att avge vid en våglängd som liknar den våglängd som anges av den sekundära antikroppen. TH excitation uppnåddes med hjälp av en HeNe laser inställd på att avge vid 632 nm.
- Ställ in detektorn på en våglängd nära laseremissionen. För det nuvarande protokollet var detektorn för TH inställd på 650 nm.
- Öka detektorns förstärkning tills det finns en synlig signal. Vinsten på 650LP för bilder var inställd på 7,50 B.
- Använd alternativet Skanna i den konfokala bildframställningsprogramvaran och flytta mikroskopstadiet tills provet har kommit i fokus.
- Navigera runt vävnaden på alla slätter och få antingen enstaka bilder eller z-stack-bilder med hjälp av den konfokala bildframställningsprogramvaran.
- När avbildningen är klar tar du bort provet från kammaren. Placera tillbaka det i ett rör som är helt fyllt med DBE och förvara på RT på en mörk plats, helst täckt av aluminiumfolie.
OBS: Proverna kan monteras om och avbildas så länge florescencesignalen fortfarande är stark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fullständig clearing av stora delar av både F344/N och HIV-1 råtta hjärnvävnad uppnåddes med hjälp av detta modifierade hydrofobiska vävnad clearing protokoll. Figur 1 visar en typisk konfokal bild för TH i regionen substantia nigra. Figur 1A representerar tät, positiv färgning. Täta områden som dessa kan tolkas genom att fokusera genom "Z" -planet för att bekräfta positiv färgning och korrekt cellmorfologi. Figur 1B representerar sparse positiv färgning, som kan identifieras av TH nervceller distinkt morfologi. Figur 1C representerar vävnad som inte är positivt fläckad men fortfarande mörk till ljusblå på grund av bakgrundssignal. Områden på bilden som visas som helt svarta indikerar en frånvaro av vävnad i det området. Helt svarta områden i bilden kan bero på att de är på kanten av provet, ett hål som finns i provet eller vävnad som är ur fokus.
Figur 2A visar typisk morfologi av en TH positiva nervceller vid 20x förstoring. Korrekt färgade och fokuserade konfokala bilder visar helst ljus och skarp fluorescens mot en mörk bakgrund. En TH-positiv neuron har en stor soma (cellkropp) och flera förgreningsprocesser16. Figur 2B visar Iba1-färgad mikroglia, som har små cellkroppar och kortare förlängningsprocesser17. Bekräftelse av korrekt färgning och förväntad cellmorfologi är det första steget i bildbehandling.
Figur 3 jämför en idealisk bild (figur 3A) med tre oönskade bilder (figur 3B-D). Figur 3A visar positiva, ljusa fläckar mot en klar, mörk bakgrund. Positiv färgning är lätt att skilja från bakgrunden. Figur 3B är ett exempel på en felaktigt fokuserad bild med för mycket fluorescerande vinst. Bild 3C visar en falsk positiv signal. Ljusa fläckar som inte är i fokus med resten av vävnaden är artefakter och bör inte betraktas som en positiv signal. Figur 3D är ett exempel på hur du använder ett blockerande serum som inte matchar den sekundära antikroppen, som föreslås i det ursprungliga iDISCO-protokollet4. I denna bild producerade användning av åsneserum för en sekundär antikropp gjord i get en bild med hög bakgrundsfärgning, vilket döljer förmågan att korrekt identifiera positiv färgning.
Figur 4A visar positiva CTB-färgning i råtthjärnan. De långa, tunna fibrerna är afferenta projektioner längs den dopaminerga vägen. Figur 4B och figur 4C visar colocalization av TH och CTB. I figur 4Bkan injektionen ses i området nukleusacumbens, som visas som en tätt fluorescerande grön cirkel. Figur 4C visar colocalization av TH och CTB i området substantia nigra.
Figur 1: Konfokal bild av ett hydrofobiskt rensat vävnadsprov med markörer, 4x förstoring. A)Tät TH-färgning i nigraområdet i sak. B)Sparse TH-nervceller i anslutning till substansen nigra. (C) Vävnad saknar positiva TH-nervceller. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Typisk morfologi av fluorescerande märkta TH-positiva nervceller (20x förstoring) och Iba1-positiv mikroglia (10x förstoring). (A) Två representativa TH positiva nervceller. B)Iba1 positiv mikroglia. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Idealiska och dåliga konfokala bilder av hydrofobiskt rensad vävnad, 4x förstoring. A)Tät TH-färgning i nigraområdet i sak, ordentligt i fokus med lämplig fluorescensförströkning. (B) En felaktigt fokuserad och alltför exponerad bild. (C) Falsk positiv färgning. D)Hög bakgrundsfärgning till följd av att man följer det oförändrade iDISCO-protokollet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Koleratoxin B-märkning längs den dopaminerga vägen, 4x förstoring. (A) Konfokal bild av positiv CTB färgning. (B) Överlappande bild av TH och CTB och kärnan accumbens injektionsställe. C)Colocalization av TH och CTB i området substantia nigra. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Film 1: 3D-film av z-skanning av provet vid 4x förstoring. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vävnadsrensning erbjuder en lösning på begränsningarna i det traditionella IHC-protokollet. Ett prov som är transparent minimerar spridning och absorption av ljus, vilket ger optisk åtkomst på cellnivå tillintakta vävnader 18,19. Vävnadsrensningstekniker gör en vävnad transparent genom delipidation, avfärgning och avkalkning med administrering av lösningsmedel. När brytningsindexet för vävnadsprovet matchar det valda bildmediets brytningsindex, kommer provet att verka helt transparent och kan avbildas korrekt3. Det nuvarande hydrofobiska protokollet tar bort vatten från vävnaden i de första uttorkningsstegen, vilket minskar ljusspridningen. Vävnaden genomsyras under förbehandlingen för att möjliggöra djup antikroppspenetration. Vävnad som har genomgått protokollet kan hanteras enkelt och kan avbildas flera gånger. Om vävnaderna lagras korrekt kan de fortfarande ge bilder i upp till ett år efter den första bearbetningen.
I det nuvarande protokollet tillämpar vi en hydrofobisk vävnad clearing teknik på F344/N och HIV-1 Tg råtta hjärnvävnad prover att fläcka för TH, Iba1 och CTB. Efter klarning, vävnad prover avbildades med hjälp av ett confocal mikroskop. Det nuvarande protokollet har flera fördelar jämfört med andra hydrofobiska protokoll, som iDISCO4. Först validerades det ursprungliga iDISCO-protokollet för användning i musvävnad, medan det nuvarande protokollet är livskraftigt i råtta hjärnvävnad. För det andra tillåter den justerade inkubationstiden på varje steg tekniken att användas för större vävnadssektioner. För det tredje ger motsvarande serum under antikroppsinkubation (i motsats till användning av ett allmänt serum) tydligare bilder för analys.
Även om det nuvarande protokollet är lätt att anpassa för att passa behoven hos enskilda forskningsfrågor, finns det flera viktiga överväganden. Protokollet tar minst 26 dagar i följd från början till slut. Lämna inte provet i en lösning längre än vad som anges ovan. Provet kan dock förvaras i DBE i slutet av protokollet i minst 6 månader på ett säkert sätt fram till avbildningen, även om det rekommenderas att avbilda så snart som möjligt. Beställ en 3D-utskriven kammare som passar provet tätt mellan mikroskopets glid och täckglaset. Alla lagerlösningar, förutom Lösning 1, var blandade dag för i ett belopp som var lämpligt för dagens användning. Provet bör flyttas till ett nytt rör när en ny lösning införs för att förhindra korskontaminering. Om mikrobiell tillväxt är oroande kan natriumazid tillsättas till lösning 2, lösning 3, lösning 4, den primära antikroppslösningen och den sekundära antikroppslösningen med en koncentration på 0, 02% i total lösning.
Sammantaget är den nuvarande tekniken en extremt mångsidig, lätt att implementera och billig procedur som är kompatibel med många antikroppar. Med detta protokoll som valideras för att fungera i både F344/N-kontroll och HIV-1 Tg råttor, kan många nya undersökande forskningsfrågor besvaras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av NIH-bidrag: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & av T32 Training Grant 5T32GM081740
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | C34775 | |
| DBE | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| DCM | Sigma-Aldrich | 270997-100mL | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301-1L | |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-500 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 | Invitrogen | A32733 | |
| Goat serum | Sigma Life Science | G9023-10mL | |
| Heparin | Acros Organics | 41121-0010 | |
| Iba1 primary antibody | FUJIFILM Wako | 019-19741 | |
| Kwik-sil epoxy | VWR | 70730-062 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1l-R | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP2944-100 | |
| Perfusion machine | VWR | 70730-062 | mini pump variable flow |
| PFA | Sigma-Aldrich | 158127-3KG | |
| TH primary antibody | Millipore Sigma | AB152 | |
| TritonX-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Tween-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 |
References
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
- Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
- Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).
- Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152 (2018).
- Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
- Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
- Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
- Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
- Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
- Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
- Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
