Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/61821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

Burada, hedef moleküllerin sağlam beyin yapılarının bir parçası olarak görüntülenmesini sağlayan hidrofobik bir doku temizleme yöntemi sunuyoruz. Bu teknik artık F344/N kontrolü ve her iki cinsiyetten HIV-1 transgenik sıçanlar için onaylanmıştır.

Abstract

Hidrofobik doku temizleme yöntemleri, değiştirilmemiş doku örneklerinde ilgi molekülünün incelenmesini sağlayan kolayca ayarlanabilir, hızlı ve düşük maliyetli prosedürlerdir. Geleneksel immünolabeling prosedürleri, numunenin sağlam yapıları etiketleme ve inceleme yeteneğini kısıtlayan ince bölümlere kesilmesini gerektirir. Ancak, işlem sırasında beyin dokusu bozulmadan kalabiliyorsa, analiz için yapılar ve devreler bozulmadan kalabilir. Daha önce kurulan temizleme yöntemleri dokuyu tamamen temizlemek için önemli zaman alır ve sert kimyasallar genellikle hassas antikorlara zarar verebilir. iDISCO yöntemi dokuyu hızlı ve tamamen temizler, birçok antikorla uyumludur ve özel bir laboratuvar ekipmanı gerektirmez. Bu teknik başlangıçta fare dokusunda kullanım için doğrulandı, ancak mevcut protokol bu yöntemi kontrol ve transgenik sıçan beyinlerinin görüntü yarımkürelerine uyarlıyor. Buna ek olarak, mevcut protokol, daha az arka plan boyama ile daha net görüntüler sağlamak için önceden var olan protokolde birkaç ayarlama yapar. Iba-1 ve tirozin hidroksilaz antikorları HIV-1 transgenik sıçanda ve F344/N kontrol sıçanlarında mevcut hidrofobik doku temizleme yöntemi kullanılarak doğrulandı. Beyin, yapıların birbirinden ayrı olarak daha sık birlikte çalıştığı iç içe geçmiş bir ağdır. Beyni tek tek parçaların bir kombinasyonunun aksine bütün bir sistem olarak analiz etmek, tüm bu beyin temizleme yönteminin en büyük yararıdır.

Introduction

Beyinde kullanım için çeşitli doku temizleme teknikleri doğrulanmıştır: hidrojel, hidrofilik ve hidrofobik. Bu teknikler, çözücülerin yönetimi yoluyla bir dokuyu delipidasyon, dekolorizasyon ve kireçten arındırma yoluyla şeffaf hale getirmeyi amaçlamaktadır. Doku örneğinin kırılma indeksi seçilen görüntüleme ortamının kırılma indisiyle eşleştiğinde, numunenin net bir görüntüsü elde edilebilir. CLARITY gibi hidrojel bazlı teknikler, dokudaki biyomolekülleri akril bazlı hidrojellere bağlayarak güvence altına almakta, bu da yapısal hasarı ve protein kaybını önler1. Bununla birlikte, hidrojel teknikleri daha kırılgan dokulara zarar verme potansiyeline sahip olandan daha sert kimyasallar kullanır ve daha yoğun doku örnekleri hidrojel protokolü ile uyumlu olmayabilir. Bazı hidrojel teknikleri pahalı ekipman gerektirebilir veya doku genişlemesine yol açabilir. CUBIC gibi hidrofilik teknikler, doku içinde hidrojen bağları oluşumu yoluyla 3D yapıyı korur2. Doku genişlemesi bazı hidrofilik protokollerde de ortaya çıkabilir. Hidrofilik tekniklerin temizleme yeteneği genellikle daha yoğun ve kalın dokular için önemli olan hidrofobik tekniklerin sahip olduğu yetenekle eşleşmez3.

Hidrofobik teknikler genellikle hızlıdır, özel ekipman gerektirmez ve kullanımı ve depolaması kolay bir örnek üretir. iDISCO, diğer hidrofobik protokollerde meydana gelebilecek büzülmeleri ortadan kaldıran bir hidrofobik tekniktir. Başlangıçta, iDISCO doku temizleme tekniği, farelerin embriyoları ve yoğun, yetişkin organları için Renier ve ark.4 tarafından tanımlanmıştır. Bu teknik, ilk dehidrasyon adımında dokudaki suyu temizler, böylece ışık saçılmasını azaltır. Doku, derin antikor penetrasyonunu sağlamak için ön işlem sırasında permeabilize edilir. Uzak kırmızı spektrumdaki Alexa Fluor boyaları, alt dalga boylarında dokunun otoflüoresansını önlemek için immünolabeling için kullanılır5. Hidrofobik temizleme protokollerinden geçen doku kolayca işlenebilir ve Alexa Fluor boyalarının uzun ömürlü olması nedeniyle birkaç kez görüntülenebilir. Düzgün bir şekilde saklanırsa, dokular ilk işlemden sonra aylarca ila bir yıl boyunca görüntü sağlayabilir.

Mevcut protokolde hem erkek hem de kadın kontrolünde ve HIV-1 transgenik (Tg) sıçan beyinlerinde tirozin hidroksilaz (TH) antikoru, Iba1 antikoru ve Kolera Toksini Alt Ünlem B (CTB) kullanılmıştır. HIV-1 Tg sıçanı, HIV-1 viral genomu oluşturan dokuz genden yedisine sahiptir, bu da uzun süreli HIV-1 protein maruziyetinin bulaşıcı olmayan bir modeline yol açar6,7,8. Dopaminerjik değişiklikler daha önce HIV-1 Tg sıçanında gösterilmiştir ve HIV-1'in kendisi enflamatuar bir hastalıktır, bu nedenle antikor seçimi deneysel tasarım 9 , 10,11,12ile ilişkiliydi. CTB, ganglioside bağlama yoluyla nöronlara bağlanan ve beyindeki farklı projeksiyonları izlemek için kullanılabilen bir izleyicidir. CTB daha önce çekirdek akumbens'ten substantia nigra bölgesine, beynin dopaminerjik yollar13 , 14,15ile yoğun olarak ilgili iki bölgesine kadar projeksiyonları incelemek için kullanılmıştır.

Bu protokolde, TH dopamin üretimi için bir işaretleyici olarak hizmet edecek ve Iba1 aktif mikrogliayı işaretleyecek. Kullanılan TH antikor, tirozin hidroksilaz'a karşılık gelen yaklaşık 62 kDa'da tek bir bandı seçici olarak etiketler. Iba1 antikorı Iba1 karboksi-terminal dizisine karşılık gelir. Her iki antikor da tavşanda bulundu ve poliklonaldi. CTB, nöronların çekirdek akumbens bölgesinden substantia nigra bölgesine retrograd izlenmesi için kullanılacaktır. Mevcut protokol ayrıca orijinal iDISCO protokolünün iki farklı şekilde ayarlanması için bir kılavuz sunar: 1) engelleme adımlarındaki serum reaktiflerini değiştirerek arka plan boyamanın genel olarak azaltılması ve 2) kuluçka süresinin daha büyük doku örnekleri için uygun olacak şekilde ölçeklendirilmesi. Genel olarak, mevcut protokol, hidrofobik temizleme tekniklerinin sıçanın beyin dokularında mümkün olduğuna, HIV-1 viral proteinlerle ayırt edilebilir zararlı etkileşimleri olmadığına ve TH antikor, Iba1 antikor ve CTB ile uyumlu olduğuna dair sürekli kanıtlar sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan protokolleri Güney Carolina Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından incelendi ve onaylandı.

1. Stok çözeltisi hazırlama

  1. Çözelti 1 (1 L): 900 mL'ye deiyonize H2O, 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ve 2 mL Triton X-100 ekleyin.
  2. Çözüm 2 (1 L): 900 mL deiyonize H2O'ya, 10x PBS'nin 100 mL'si, 2mL Ara-20 ve 1 mL'lik 10 mg/mL Heparin stok çözeltisi ekleyin.
  3. Çözelti 3 (500 mL): 400 mL Çözelti 1'e 11,5 g glisin ve 100 mL dimetilsüllfoksit (DMSO) ekleyin.
  4. Çözelti 4 (50 mL): 42 mL Çözelti 1'e, karşılık gelen serumun 3 mL'si ve 5 mL DMSO ekleyin.
  5. Primer antikor çözeltisi (50 mL): Çözelti 2'nin 46 mL'sine 2,5 mL DMSO ve karşılık gelen serumun 1,5 mL'si ekleyin.
  6. İkincil antikor çözeltisi (50 mL): Çözelti 2'nin 48,5 mL'sine karşılık gelen serumun 1,5 mL'sini ekleyin.
    NOT: Çözüm 4, birincil çözelti ve ikincil çözelti için ikincil antikora karşılık gelen bir serum kullanın (örneğin, keçi, at, sığır).

2. Numune hazırlama

NOT: PFA'ya maruz kalmayı sınırlamak için duman kaputunda 2.1 ile 2.7 arasında adımlar uygulayın.

  1. Sevoflurane kullanarak genç (3-6 hafta) sıçanı derinden uyuşturmak; sıçan yanıt vermediğinde ve parmak ve kuyruk kıskacına yanıt vermediğinde 2.2'ye geçin.
  2. Sıçanı sırtüstü bir konuma getirin ve bir çift İris makası kullanarak karın duvarından bir kesi yapın.
  3. Mayo makası kullanarak göğüs kafesinin dibinden göğüs kafesinin her iki tarafındaki köprücük kemiğine kadar kesin.
  4. Sternumu ve kaburgaları kalpten ve akciğerlerden hemostatla yapıştırın.
  5. Sol ventrikülü perfüzyon pompasına bağlı 23 G'lik bir iğneyle delin ve sağ kulakçığı Iris makasıyla kesin.
  6. Yaklaşık 75 mL 100 mM (1x) PBS ile transkardiyal perfüzyon gerçekleştirin.
  7. 1x PBS'de tamponlanmış yaklaşık %4 paraformaldehit (PFA) 100 mL ile transkardiyal perfüzyona devam edin.
  8. Beyni kafatasından çıkardık.
  9. Beyni sagittal konuma getirin ve bir jilet ve sıçan beyin matrisi kullanarak 4 eşit bölüme (yaklaşık 3 mm genişlik) dilimleyin.
  10. Her bölümü 1x PBS'de %4 PFA'da, bir çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de gece boyunca kapalı, 5mL plastik bir tüpte sabitleyin.
  11. 1 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında (RT) 1x PBS'de% 4 PFA'da sabitlemeye devam edin.
  12. Her bölümü RT'de 1x PBS ile 30 dakika, 3 kez yıkayın.

3. Dehidrasyon ve depigmentasyon

  1. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %20 metanol/%80 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  2. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %40 metanol/%60 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  3. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %60 metanol/%40 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  4. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %80 metanol/%20 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  5. Rt'de 1 saat boyunca %100 metanolde numuneyi kuluçkaya yatırın.
  6. Numuneyi yaklaşık 10 dakika boyunca 4° C'de% 100 metanolde soğutun.
  7. %66 diklorometan (DCM)/%33 metanol çözeltisi hazırlayın.
  8. Rt'deki DCM/metanol çözeltisinde numuneyi bir gecede sallanarak kuluçkaya yatırın.
  9. RT'de metanol ile 30 dakika, 2 kez yıkayın.
  10. Numuneyi yaklaşık 10 dakika boyunca 4° C'de% 100 metanolde soğutun.
  11. 4° C'de bir gecede metanolde soğutulmuş, taze hazırlanmış% 5 hidrojen peroksit içinde çamaşır suyu.
  12. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %80 metanol/%20 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  13. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %60 metanol/%40 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  14. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %40 metanol/%60 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  15. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %20 metanol/%80 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  16. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi 1x PBS'de kuluçkaya yatırın.
  17. Çözüm 1'de RT'de 1 saat, 2 kez yıkayın.

4. Kolera Toksin Alt Üni B etiketleme

  1. Çekirdek akumbens bölgesine 1 mL şırınga iğne ucu yerleştirin.
  2. Yavaşça 20 sn'nin üzerine% 1 biyotin-CTB'nin 2,5 μL'sini enjekte edin.
  3. İğne ucunu 1 dakika yerinde bırakın ve sızıntıyı önlemek için 10 sn'nin üzerinde yavaşça çıkarın.

5. Antikor uygulaması

  1. Numuneyi Çözelti 3'te bir su banyosunda 37 °C'de 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın.
  2. Numuneyi Çözelti 4'te bir su banyosunda 37 °C'de 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın.
  3. Bir su banyosunda 37 °C'de 7 gün boyunca birincil antikor ile kuluçkaya yatır.
  4. Çözelti 2'de 5 kez yıkayın, yıkama başına 1 saat inkübe edin. Çözüm 2'de rt'de bir gecede saklayın.
  5. Su banyosunda 37 °C'de 7 gün boyunca ikincil antikor ile kuluçkaya yatır.
  6. Çözelti 2'de 5 kez yıkayın, yıkama başına 1 saat inkübe edin; Çözüm 2'de rt bir gecede saklayın.
    NOT: Son depolama dahil 5,6'dan itibaren tüm adımlar düşük ışıkta gerçekleşmelidir. Numune tüpleri alüminyum folyo ile korunabilir. Bu protokoldeki antikorlar için kullanılan konsantrasyonlar şöyleydi: TH 1:100'de, Iba1 1:200'de ve ikincil antikor 1:100'de. Tüplerin tamamen doldurulmasını sağlamak için 5.1-5.6 adımlarına ek Çözüm 2 ekleyin.

6. Doku temizleme

  1. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %20 metanol/%80 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  2. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %40 metanol/%60 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  3. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %60 metanol/%40 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  4. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %80 metanol/%20 deiyonize su çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
  5. Rt'de 1 saat boyunca numuneyi %100 metanolde kuluçkaya yatırın.
  6. RT'de bir gecede taze %100 metanol içinde kuluçkaya yatır.
  7. Oda sıcaklığında sallanarak 3 saat boyunca% 66 DCM / 33% metanol içinde kuluçkalayın.
  8. Dibenzyl eterde (DBE) titremeden kuluçkaya yatır. Numuneyi temizleyene kadar DBE'de bırakın ve görüntülemeye kadar DBE'de saklayın.

7. Montaj

  1. Visijet M3 Crystal reçineden yapılmış 3D baskılı bir oda edinin (idisco.info web sitesinde bulunan şablonlar).
  2. Hazneyi bir epoksi kullanarak mikroskop kaydırana sabitleyin.
  3. Örneği odanın ortasındaki kare alana yerleştirin.
  4. Odayı tamamen DBE ile doldurun.
  5. Odanın üzerine 0,17 mm kalınlığında bir kapak kılıfı yerleştirin ve kapak kapağı oda duvarlarıyla tam temas edene kadar basınç uygulayın.
  6. Kapak kapağının kenarlarını epoksi kullanarak odaya kapatın.
  7. Hava kabarcıklarının dolum girişinden kaçmasına izin vermek için odayı döndürün.
  8. Odayı ek DBE ile doldurun.
  9. Dolgu girişini epoksi ile kapatın ve kürlemesine izin verin.
    NOT: Montaj sırasında fazla DBE dökülür.

8. Görüntüleme

  1. 4x büyütmede z taraması yapmak için bir konfokal mikroskop sistemi kullanın (ekli 3D videoyabakın).
  2. İkincil antikor tarafından belirtilen dalga boylarına benzer bir dalga boyunda yayacak bir lazer seti kullanarak numunenin floresan eksitasyonunu elde edin. TH ekscitasyon, 632 nm'de yayılması için bir HeNe lazer seti kullanılarak elde edildi.
  3. Dedektörü lazer emisyonu için yakın bir dalga boylarına ayarlayın. Mevcut protokol için, TH dedektörü 650 nm olarak ayarlandı.
  4. Görünür bir sinyal olana kadar dedektörün kazancını artırın. Görüntüler için 650LP kazancı 7.50 B olarak belirlendi.
  5. Konfokal görüntüleme yazılımındaki Tarama seçeneğini kullanarak, numune netleme getirilene kadar mikroskop aşamasını hareket ettinin.
  6. Tüm düzlüklerde dokunun etrafında gezinin ve konfokal görüntüleme yazılımını kullanarak tek görüntüler veya z yığını görüntüler elde edin.
  7. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, numuneyi odadan çıkarın. Tamamen DBE ile dolu bir tüpe geri yerleştirin ve RT'de tercihen alüminyum folyo ile kaplı karanlık bir yerde saklayın.
    NOT: Floresan sinyali hala güçlü olduğu sürece numuneler yeniden monte edilebilir ve görüntülenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu modifiye hidrofobik doku temizleme protokolü kullanılarak hem F344/N hem de HIV-1 sıçan beyin dokusunun geniş bölümlerinin tam olarak temizlenmesi sağlandı. Şekil 1, substantia nigra bölgesinde TH için tipik bir konfokal görüntü görüntüler. Şekil 1A yoğun, pozitif lekeleri temsil eder. Bu gibi yoğun alanlar pozitif lekeleme ve uygun hücre morfolojisini doğrulamak için "Z" düzlemine odaklanarak ayrıştırılabilir. Şekil 1B, TH nöronlarının farklı morfolojisi ile tanımlanabilen seyrek pozitif lekelenmeyi temsil eder. Şekil 1C, pozitif olarak lekeli olmayan ancak arka plan sinyali nedeniyle hala koyudan açık maviye koyu olan dokuyu temsil eder. Görüntünün tamamen siyah görünen bölgeleri, o bölgede doku olmadığını gösterir. Görüntüdeki tamamen siyah alanlar, numunenin kenarında, numunede bulunan bir delik veya odak dışında olan dokudan kaynaklanabilir.

Şekil 2A, 20x büyütmede TH pozitif nöronunun tipik morfolojilerini göstermektedir. Düzgün boyanmış ve odaklanmış konfokal görüntüler, karanlık bir arka plana karşı parlak ve net floresan gösterecektir. Bir TH pozitif nöron büyük bir soma (hücre gövdesi) ve birkaç dallanma işlemine sahiptir16. Şekil 2B, küçük hücre gövdeleri ve daha kısa uzatma işlemleri17olan Iba1 lekeli mikroglia'yı göstermektedir. Uygun boyama ve beklenen hücre morfolojisinin doğrulanması görüntülemenin ilk adımıdır.

Şekil 3 ideal bir görüntüyü (Şekil 3A) üç istenmeyen görüntüyle karşılaştırır (Şekil 3B-D). Şekil 3A, net ve koyu bir arka plana karşı pozitif, parlak lekeler göstermektedir. Pozitif boyama arka plandan kolayca ayırt edilebilir. Şekil 3B, çok fazla floresan kazancı olan yanlış odaklanmış bir görüntünün bir örneğidir. Şekil 3C yanlış pozitif sinyal gösteriyor. Dokunun geri kalanıyla odaklanmayan parlak noktalar eserlerdir ve olumlu bir sinyal olarak düşünülmemelidir. Şekil 3D, orijinal iDISCO protokolü4'teönerildikçe ikincil antikorla eşleşmeyen bir bloke serumu kullanmanın bir örneğidir. Bu görüntüde, keçide yapılan ikincil bir antikor için eşek serumu kullanımı, pozitif lekeyi düzgün bir şekilde tanımlama yeteneğini gizleyen yüksek arka plan lekelemeli bir görüntü üretti.

Şekil 4A sıçan beyninde pozitif CTB lekesi göstermektedir. Uzun, ince lifler dopaminerjik yol boyunca farklı projeksiyonlardır. Şekil 4B ve Şekil 4C, TH ve CTB'nin kolokalizasyonunu göstermektedir. Şekil 4B'deenjeksiyon, yoğun floresan yeşil bir daire olarak görünen çekirdek akumbens bölgesinde görülebilir. Şekil 4C, substantia nigra alanında TH ve CTB'nin kolokalizasyonunu görüntüler.

Figure 1
Şekil 1: Hidrofobik olarak temizlenmiş bir doku örneğinin işaretleyicilerle konfokal görüntüsü, 4x büyütme. (A) Substantia nigra bölgesinde yoğun TH lekeleme. (B) Substantia nigra'ya bitişik seyrek TH nöronları. (C) Pozitif TH nöronları olmayan doku. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Floresan etiketli TH pozitif nöronların (20x büyütme) ve Iba1 pozitif mikrogliasının (10x büyütme) tipik morfolojisi. (A) İki temsili TH pozitif nöron. (B) Iba1 pozitif mikroglia. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Hidrofobik olarak temizlenmiş dokunun ideal ve zayıf konfokal görüntüleri, 4x büyütme. (A) Substantia nigra bölgesinde yoğun TH lekeleme, uygun bir floresan kazancı ile uygun şekilde odaklanır. (B) Yanlış odaklanmış ve aşırı maruz kalan bir görüntü. (C) Yanlış pozitif lekeleme. (D) Değiştirilmemiş iDISCO protokolünün takipi sonucu yüksek arka plan boyama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Dopaminerjik yol boyunca kolera Toksini B etiketlemesi, 4x büyütme. (A) Pozitif CTB boyama konfokal görüntü. (B) TH ve CTB ve çekirdek akumbens enjeksiyon bölgesinin çakışmış görüntüsü. (C) Substantia nigra bölgesinde TH ve CTB'nin kolokalizasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Film 1: 4x büyütmede numunenin z taramasının 3D filmi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Doku temizleme, geleneksel IHC protokolünün sınırlamalarına bir çözüm sunar. Şeffaf olan bir örnek, sağlam dokulara hücresel düzeyde optik erişim sağlayan ışığın saçılmasını ve emilimini en aza indirir18,19. Doku temizleme teknikleri, çözücülerin yönetimi ile delipidasyon, dekolorizasyon ve kireçten arındırma yoluyla bir dokuyu şeffaf hale gelir. Doku örneğinin kırılma indeksi seçilen görüntüleme ortamının kırılma indeksiyle eşleştiğinde, örnek tamamen şeffaf görünecek ve düzgün bir şekilde görüntülenebilir3. Mevcut hidrofobik protokol, ilk dehidrasyon adımlarında dokudaki suyu temizler, böylece hafif dağılımını azaltır. Doku, derin antikor penetrasyonunu sağlamak için ön işlem sırasında permeabilize edilir. Protokolden geçen doku kolayca işlenebilir ve birkaç kez görüntülenebilir. Düzgün bir şekilde saklanırsa, dokular ilk işlemden sonra bir yıla kadar görüntü sağlayabilir.

Mevcut protokolde, F344/N ve HIV-1 Tg sıçan beyin dokusu örneklerine TH, Iba1 ve CTB için lekeleme için hidrofobik doku temizleme tekniği uyguluyoruz. Temizlemeden sonra doku örnekleri konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendi. Mevcut protokol, iDISCO4gibi diğer hidrofobik protokollere göre çeşitli avantajlara sahiptir. İlk olarak, orijinal iDISCO protokolü fare dokusunda kullanım için doğrulanırken, mevcut protokol sıçan beyin dokusunda uygulanabilir. İkinci olarak, her adımda ayarlanan kuluçka süresi, tekniğin daha büyük doku bölümleri için kullanılmasını sağlar. Üçüncüsü, antikor inkübasyonu sırasında karşılık gelen serum da dahil olmak üzere (genel bir serum kullanımının aksine) analiz için daha net görüntüler sağlar.

Mevcut protokol bireysel araştırma sorularının ihtiyaçlarına göre kolayca uyarlanabilir olsa da, birkaç önemli husus vardır. Protokol, en az 26 gün üst üste baştan sona sürer. Numuneyi yukarıda belirtilenden daha uzun süre bir çözeltide bırakmayın. Bununla birlikte, örnek, protokolün sonunda DBE'de görüntülemeye kadar en az 6 ay boyunca güvenli bir şekilde saklanabilir, ancak mümkün olan en kısa sürede görüntülenmesi önerilir. Mikroskop kaydırağı ve kapak kılıfı arasına numuneyi sıkıca sığdıracak bir 3D baskılı oda sipariş edin. Çözüm 1 dışında tüm stok çözümleri, o günün kullanımına uygun miktarda karışık bir gündü. Çapraz kontaminasyonu önlemek için yeni bir çözelti getirildiğinde numune yeni bir tüpe taşınmalıdır. Mikrobiyal büyüme söz konusuysa, sodyum azit Çözelti 2, Çözelti 3, Çözelti 4, birincil antikor çözeltisi ve ikincil antikor çözeltisine toplam çözeltide% 0.02 konsantrasyonda eklenebilir.

Genel olarak, mevcut teknik birçok antikorla uyumlu son derece çok yönlü, uygulanması kolay ve düşük maliyetli bir prosedürdür. Hem F344/N kontrolünde hem de HIV-1 Tg sıçanlarında çalışmak üzere onaylanan bu protokol ile birçok yeni araştırma sorusu cevaplanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların hiçbirinin beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH hibeleri tarafından finanse edildi: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & T32 Eğitim Hibesi 5T32GM081740

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488 Invitrogen C34775
DBE Sigma-Aldrich 108014-1KG
DCM Sigma-Aldrich 270997-100mL
DMSO Sigma-Aldrich 472301-1L
Glycine Fisher Chemical G46-500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647 Invitrogen A32733
Goat serum Sigma Life Science G9023-10mL
Heparin Acros Organics 41121-0010
Iba1 primary antibody FUJIFILM Wako 019-19741
Kwik-sil epoxy VWR 70730-062
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1l-R
PBS Fisher Bioreagents BP2944-100
Perfusion machine VWR 70730-062 mini pump variable flow
PFA Sigma-Aldrich 158127-3KG
TH primary antibody Millipore Sigma AB152
TritonX-100 Fisher Bioreagents BP151-500
Tween-20 Fisher Bioreagents BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).
  4. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  5. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  6. Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
  7. Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
  8. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
  9. Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
  10. Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).
  11. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152 (2018).
  12. Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
  13. Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
  14. Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
  15. Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
  16. Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
  17. Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  18. Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).

Tags

Nörobilim Sayı 166 doku temizleme immünhistokimya iDISCO beyin sıçan konfokal
Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A.… More

Kirchner, K. N., Li, H., Denton, A. R., Harrod, S. B., Mactutus, C. F., Booze, R. M. A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp. (166), e61821, doi:10.3791/61821 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter