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Biochemistry

पॉलीमर्ाइजेशन-डेपोलिमराइजेशन चक्रों द्वारा सीमित स्रोतों से नियंत्रित पोस्टट्रांसलाइजेशनल संशोधनों और आइसोटाइप के साथ ट्यूबलिन का शुद्धिकरण

Published: November 5, 2020 doi: 10.3791/61826
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2
1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल बहुभाषी कोशिकाओं या एकल माउस दिमाग जैसे छोटे/मध्यम पैमाने के स्रोतों से ट्यूबुलिन शुद्धिकरण का वर्णन करता है, बहुलीकरण और depolymerization चक्र का उपयोग कर । शुद्ध ट्यूबुलिन विशिष्ट आइसोटाइप में समृद्ध है या विशिष्ट पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों में है और माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता और बातचीत का अध्ययन करने के लिए विट्रो पुनर्गठन परख में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

माइक्रोटुबुल साइटोस्केलेटन के अध्ययन का एक महत्वपूर्ण पहलू इन विट्रो पुनर्गठन प्रयोगों में माइक्रोटुबुल व्यवहार की जांच है। वे माइक्रोट्यूबुल के आंतरिक गुणों के विश्लेषण की अनुमति देते हैं, जैसे गतिशीलता, और माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन (एमएपी) के साथ उनकी बातचीत। "ट्यूबलिन कोड" एक उभरती हुई अवधारणा है जो माइक्रोट्यूबुल गुणों और कार्यों के नियामकों के रूप में विभिन्न ट्यूबलिन आइसोटाइप और विभिन्न पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएमएस) को इंगित करती है। ट्यूबलिन कोड के आणविक तंत्र का पता लगाने के लिए, विशिष्ट आइसोटाइप और पीटीएमएस के साथ शुद्ध ट्यूबलिन का उपयोग करके विट्रो पुनर्गठन प्रयोगों में प्रदर्शन करना महत्वपूर्ण है।

आज तक, यह मस्तिष्क ट्यूबलिन के रूप में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण था, जिसका व्यापक रूप से इन विट्रो प्रयोगों में उपयोग किया जाता है, कई पीटीएमएस बंदरगाहों और एक परिभाषित आइसोटाइप संरचना है। इसलिए, हमने बहुभाषण और नियंत्रण चक्रों के शास्त्रीय दृष्टिकोण का उपयोग करके विभिन्न स्रोतों से और विभिन्न आइसोटाइप रचनाओं और नियंत्रित पीटीएमएस के साथ ट्यूबलिन को शुद्ध करने के लिए इस प्रोटोकॉल को विकसित किया। आत्मीयता शुद्धि के आधार पर मौजूदा तरीकों की तुलना में, यह दृष्टिकोण शुद्ध, बहुलकीकरण-सक्षम ट्यूबलिन की पैदावार करता है, क्योंकि लगातार शुद्धिकरण चरणों के दौरान पॉलीमराइजेशन या अपोलिमराइजेशन के लिए ट्यूबलिन प्रतिरोधी को छोड़ दिया जाता है।

हम सेल लाइनों से ट्यूबलिन की शुद्धि का वर्णन करते हैं, या तो निलंबन में या अनुयायी संस्कृतियों के रूप में उगाए जाते हैं, और एकल माउस दिमाग से। विधि पहले निलंबन और अनुयायी सेटिंग्स, लाइसिस चरण दोनों में सेल द्रव्यमान की पीढ़ी का वर्णन करती है, जिसके बाद बहुलीकरण-अप्लीमराइजेशन चक्रों द्वारा ट्यूबलिन शुद्धिकरण के क्रमिक चरणों का वर्णन किया जाता है। हमारी विधि ट्यूबलिन पैदा करती है जिसका उपयोग माइक्रोट्यूबुल्स के आंतरिक गुणों और संबंधित प्रोटीन के साथ माइक्रोट्यूबुले इंटरैक्शन पर ट्यूबुलिन कोड के प्रभाव को संबोधित करने वाले प्रयोगों में किया जा सकता है।

Introduction

माइक्रोट्यूबुल कई सेलुलर प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाते हैं। वे कोशिकाओं को अपना आकार देते हैं, गुणसूत्र अलगाव के लिए मेयोटिक और माइटोटिक स्पिंडल बनाते हैं, और इंट्रासेलुलर परिवहन के लिए पटरियों के रूप में काम करते हैं। इन विविध कार्यों को करने के लिए, माइक्रोट्यूबुल खुद को विभिन्न तरीकों से व्यवस्थित करते हैं। क्षेत्र में पेचीदा सवालों में से एक आणविक तंत्र को समझना है जो संरचनात्मक और विकासवादी रूप से संरक्षित माइक्रोट्यूबुल को संगठनों और कार्यों की इस अधिकता के अनुकूल बनाने की अनुमति देता है। एक संभावित तंत्र माइक्रोट्यूबुल्स का विविधीकरण है, जिसे'ट्यूबलिन कोड'1,2,3के रूप में जाना जाने वाली अवधारणा द्वारा परिभाषित किया गया है। ट्यूबलिन कोड में दो प्रमुख घटक शामिल हैं: माइक्रोट्यूबुल्स और ट्यूबलिन पोस्टट्रांसलेक्शनल संशोधनों (पीटीएमएस) में α और β-ट्यूबुलिन जीन उत्पादों (ट्यूबलिन आइसोटाइप) का अंतर समावेश।

1 9 70 के दशक से, विकसित प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ मिलकर विट्रो पुनर्गठन प्रयोगों ने सूक्ष्मतुबलों के गुणों के बारे में महत्वपूर्ण खोजों का मार्ग प्रशस्त किया है: गतिशील अस्थिरता4 और ट्रेडमिलिंग5,और उनके अन्य तंत्रऔर कार्य6,7,8,9,10,11,12,13,14,15। अब तक किए गए लगभग सभी इन विट्रो प्रयोग मस्तिष्क के ऊतकों से शुद्ध ट्यूबलिन पर आधारित रहे हैं , जिनमें पॉलीमराइजेशन और16,17के बार - बार चक्रों का उपयोग किया गया है । यद्यपि मस्तिष्क के ऊतकों से शुद्धि बड़ी मात्रा (आमतौर पर ग्राम मात्रा) में उच्च गुणवत्ता वाले ट्यूबलिन प्राप्त करने का लाभ प्रदान करती है, एक महत्वपूर्ण दोष विषमता है क्योंकि मस्तिष्क के ऊतकों से शुद्ध ट्यूबलिन विभिन्न ट्यूबलिन आइसोटाइप का मिश्रण है और कई ट्यूबलिन पीटीएम से समृद्ध है। यह विषमता माइक्रोट्यूबुल गुणों और कार्यों के नियंत्रण में एक विशेष ट्यूबलिन पीटीएम या आइसोटाइप की भूमिका को चित्रित करना असंभव बना देती है। इस प्रकार, ट्यूबलिन कोड के आणविक तंत्र को संबोधित करने के लिए नियंत्रित ट्यूबलिन पीटीएमएस और समरूप आइसोटाइप संरचना के साथ असेंबली-सक्षम ट्यूबलिन का उत्पादन आवश्यक है।

हाल ही में, खमीर Stu2p के माइक्रोट्यूबुले-बाध्यकारी टोग (ट्यूमर-ओवरएक्सप्रेस्ड जीन) डोमेन का उपयोग करके आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी द्वारा ट्यूबलिन को शुद्ध करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित किया गयाहै। इस विधि में, कोशिकाओं या ऊतकों के कच्चे तेल के लंग्स में ट्यूबुलिन को एक कॉलम के माध्यम से पारित किया जाता है जहां यह मैट्रिक्स-स्थिर टोग डोमेन से बांधता है, जो किसी दिए गए, यहां तक कि बहुत छोटे, नमूने के पूरे ट्यूबलिन पूल के विश्लेषण की अनुमति देता है। हाल के वर्षों में पुनर्संयोजन ट्यूबलिन को शुद्ध करने के लिए एक लंबे समय से प्रतीक्षित दृष्टिकोण का भी वर्णन किया गया है । यह बाकुलोवायरस प्रणाली पर आधारित है, जिसमें α और β-ट्यूबलिन जीन युक्त एक द्वि-सिस्ट्रोनिक वेक्टर कीट कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है19। हालांकि, यह विधि बहुत बोझिल और समय लेने वाली है और इसलिए ज्यादातर ट्यूबलिन म्यूटेशन 20 और ट्यूबलिन आइसोटाइप21, 22, 23इन विट्रो के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग कियाजाता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो सेल लाइनों से या माउस मस्तिष्क ऊतक24से संशोधन के विभिन्न स्तरों के साथ ट्यूबलिन उत्पन्न करने के लिए एक ब्लूप्रिंट के रूप में अच्छी तरह से स्थापित और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले बहुलीकरण-depolymerization दृष्टिकोण का उपयोग करता है। इस प्रक्रिया में, ट्यूबुलिन को घुलनशील (4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबुलिन डिमर) और पॉलीमराइज्ड फॉर्म (गुआनोसिन 5'-ट्रिप्होस्फेट [जीटीपी] की उपस्थिति में 30 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोट्यूबुले के बीच साइकिल किया जाता है। प्रत्येक रूप को अपकेंद्रित्र के क्रमिक चरणों के माध्यम से अलग किया जाता है: ट्यूबलिन डिमर्स सर्दी (4 डिग्री सेल्सियस) स्पिन के बाद सुपरनैंट में रहेंगे, जबकि माइक्रोट्यूबुल्स को 30 डिग्री सेल्सियस पर गोली मार दी जाएगी। इसके अलावा, एक बहुलककरण कदम उच्च पिपराज़ीन-एन,एन′-बीआईएस (2-एथेलसुल्फोनिक एसिड) (पाइप) एकाग्रता पर किया जाता है, जो माइक्रोट्यूबुल से माइक्रोटुबुल से जुड़े प्रोटीन को हटाने की अनुमति देता है और इस प्रकार, अंत में शुद्ध ट्यूबुलिन से। हेला एस 3 कोशिकाओं से प्यूरीफलिन को निलंबित या अनुयायी संस्कृतियों के रूप में उगाया जाता है, यह किसी भी ट्यूबलिन पीटीएम से लगभग मुक्त है और इसका उपयोग हाल ही में विट्रो पुनर्गठन प्रयोगों में किया गया है25,27, 27,28. हमने एकल माउस दिमाग से ट्यूबलिन को शुद्ध करने के लिए विधि को और अनुकूलित किया है, जिसका उपयोग बड़ी संख्या में माउस मॉडल के लिए ट्यूबुलिन आइसोटाइप और पीटीएमएस में परिवर्तन के साथ किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में, हम सबसे पहले स्रोत सामग्री (सेल द्रव्यमान या मस्तिष्क ऊतक), इसकी लाइसिस(चित्रा 1A)की पीढ़ी का वर्णन करते हैं, जिसके बाद ट्यूबलिन बहुलीकरण और विरूपण के क्रमिक चरणों के बाद ट्यूबलिन(चित्रा 1 बी)को शुद्ध किया जा सकता है। हम शुद्ध ट्यूबलिन की शुद्धता(चित्रा 2ए, बी)और मात्रा(चित्र 3ए, बी)का आकलन करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। इस विधि को ट्यूबुलिन शुद्धिकरण(चित्रा 4 बी)से पहले कोशिकाओं में एक संशोधित एंजाइम को अधिकएक्सप्रेस करके चयनित पीटीएम के साथ समृद्ध ट्यूबलिन का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान ट्यूबलिन में ट्यूबलिन-संशोधित एंजाइमों को जोड़ा जा सकता है। अंत में, हम ट्यूबुलिन-संशोधित एंजाइमों(चित्रा 4B)29में चूहों की कमी चूहों के दिमाग से विशिष्ट आइसोटाइप या पीटीएमएस की कमी को शुद्ध कर सकते हैं।

हम यहां जिस विधि का वर्णन करते हैं उसके दो मुख्य फायदे हैं: (i) यह अपेक्षाकृत कम समय में पर्याप्त रूप से बड़ी मात्रा में ट्यूबलिन के उत्पादन की अनुमति देता है, और (ii) यह उच्च गुणवत्ता वाले, शुद्ध ट्यूबलिन उत्पन्न करता है, या तो विशिष्ट ट्यूबुलिन आइसोटाइप संरचना या पीटीएमएस के साथ। इस पांडुलिपि के संबद्ध वीडियो में, हम इस प्रक्रिया में शामिल कुछ महत्वपूर्ण कदमों को उजागर करते हैं।

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Protocol

पशु देखभाल और इस अध्ययन के लिए उपयोग यूरोपीय समुदाय (2010/63/UE) की सिफारिशों के अनुसार किया गया । प्रायोगिक प्रक्रियाओं को विशेष रूप से अंतर्राष्ट्रीय दिशा-निर्देशों के अनुपालन में इंस्टीटयूट क्यूरी सीईईए-आईसी #118 (प्राधिकरण संख्या 04395.03 राष्ट्रीय प्राधिकरण द्वारा दिए गए) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. तुबुलिन शुद्धिकरण के लिए रिएजेंट्स की तैयारी

नोट: ट्यूबलिन शुद्धिकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी बफ़र्स में पोटेशियम लवण और सोडियम लवण30नहीं होना चाहिए।

  1. पूर्ण माध्यम के 1 एल तैयार करें: दुलबेको का संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस, 100 एमएल), 200 एमएम एल-ग्लूटामाइन (2 एम स्टॉक का 10 मिलीलीटर), और 1x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100x स्टॉक का 10 मीटर एल)। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. पानी में 140 ग्राम को कोह को भंग करके 10 मीटर पोटेशियम हाइड्रोक्साइड (कोह) तैयार करें, अंतिम मात्रा को 250 एमएल में समायोजित करें, और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  3. पानी में 36.5 ग्राम ईडीटीए को भंग करके 0.5 एम एथिलेंडिमाइन टेट्राएसेटिक एसिड (ईएचटीए), पीएच 8 तैयार करें, कोह का उपयोग करके पीएच को 8.0 तक समायोजित करें (अन्यथा ईडीटीए भंग नहीं होगा) और अंतिम मात्रा 250 मिलीएल, फिल्टर-स्टरलाइज, और तापमान कक्ष में स्टोर करें।
  4. 5 एमएम फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) -ईडीटीए को पीबीएस के 500 एमएल में जोड़कर 5 एमएम फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) -ईडीटीए तैयार करें, फिल्टर-स्टरलाइज करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  5. पानी में 75.5 ग्राम पाइप को भंग करके 0.5 एम के-पाइप, पीएच 6.8 तैयार करें, कोह के साथ पीएच 6.8 में समायोजित करें (अन्यथा पाइप भंग नहीं होंगे) और अंतिम मात्रा 500 एमएल, फिल्टर-स्टरलाइज, और 4 सी पर स्टोर करें।
  6. पानी में 15.1 ग्राम पाइप को भंग करके 1 एम के-पाइप, पीएच 6.8 तैयार करें, कोह के साथ पीएच 6.8 में समायोजित करें और अंतिम मात्रा 50 एमएल, फिल्टर-स्टरलाइज करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. तैयार करें 0.5 मीटर पोटेशियम-एथिलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (β-अमीनोएथिल ईथर)-एन, एन, एन,एन,एन',एन'-टेट्राएसेटिकएसिड (K-EGTA, पीएच 7.7) पानी में 47.5 ग्राम ईजीटीए को भंग करके, कोह के साथ पीएच 7.7 और अंतिम मात्रा में 250 एमएल तक समायोजित करें, फिल्टर-स्टरलाइज करें, और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  8. बीआरबी 80 (80 एमएम के-पाइप, तैयार करें पीएच 6.8; 1 m M K-EGTA; 1 m m मैग्नीशियम क्लोराइड [एमजीसीएल2])समाधान 0.5 एम पाइप के 3.2 एमएल, 0.5 एम के-ईजीटीए के 40 माइक्रोन, और 1 एम सीएमएल 2 के20 माइक्रोन को मिलाकर और अंतिम मात्रा को 20 एमएल तक समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. आइसोप्रोपैनॉल में 435 मिलीग्राम पीएमएसएफ को भंग करके 0.1 मीटर फिनाइलमेथेन्सुल्फोनाइल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) तैयार करें ताकि 25 एमएल की अंतिम मात्रा प्राप्त की जा सके और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सके।
  10. 2.5 एमएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए पानी में 10 मिलीग्राम एप्रोटिनिन, 10 मिलीग्राम ल्यूपेप्टिन, और 10 मिलीग्राम 4-बेंजेनेसुलफोनिल फ्लोराइड को भंग करके प्रोटीज़ अवरोधक मिश्रण (200x) तैयार करें, और -20 सी पर स्टोर करें।
  11. 10% ट्राइटन एक्स-100 को 45 एमएल पानी में ट्राइटन एक्स-100 का 5 एमएल मिलाकर तैयार करें, फिल्टर-स्टरलाइज करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  12. लाइसिस बफर तैयार करें (बीआरबी80 1 एमएमएम 2-मर्केप्टोथेनॉल, 1 mm PMSF, 1x प्रोटीज अवरोधक मिश्रण और, वैकल्पिक रूप से एचईके-293 कोशिकाओं के लिए, 0.2% ट्राइटन एक्स-100) बीआरबी80 के 20 एमएल को 2-मर्केप्टोथेन के 1.5 माइक्रोन के साथ मिलाकर, 0.1 एम पीएमएसएफ के 200 माइक्रोन, प्रोटीज अवरोधकों के 100 माइक्रोन मिश्रण और एचईके-293 सेल के लिए वैकल्पिक रूप से मिलाकर , 10% ट्राइटन एक्स-100 के 400 माइक्रोन।
    नोट: 2-मर्केप्टोथेन जहरीला है और इसका उपयोग धूम-हुड में किया जाना चाहिए।
  13. 9.5 एमएल पानी में जीटीपी के 1 ग्राम को भंग करके 0.2 एम जीटीपी तैयार करें, कोह का उपयोग करके पीएच को 7.5 तक समायोजित करें, 20 माइक्रोन के एलिकेट्स बनाएं, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। बार-बार फ्रीज-गल चक्र से बचें।
  14. पानी में 60.56 ग्राम ट्रिस को भंग करके 1 एम ट्राइस (हाइड्रोक्सीमेथाइल) एमिनोमेथेन-हाइड्रोक्लोराइड (ट्रिस-एचसीएल) तैयार करें, एचसीएल के साथ पीएच 6.8 में समायोजित करें, 500 एमएल, फिल्टर-स्टरलाइज की अंतिम मात्रा में पूरा करें, और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  15. 5x लेममली नमूना बफर (450 m m dithiothreitol (DTT); 10% सोडियम डोडेसिल्सुल्फेट (एसडीएस); 400 माइक्रोएम ट्रिस-एचसीएल, तैयार करें पीएच 6.8; 50% ग्लाइसरोल; ~ 0.006% ब्रोमोफेनॉल ब्लू) एसडीएस के 4 ग्राम को 16 एमएल में प्रीहीटेड 1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 6.8, और धीरे-धीरे मिलाएं। मिश्रण में डीटीटी के 2.6 ग्राम और 100% ग्लाइस्रोल के 20 एमएल जोड़ें और तब तक हिलाएं जब तक कि समाधान समरूप न हो जाए। आवश्यक रंग तीव्रता तक पहुंचने के लिए ब्रोमोफेनॉल ब्लू (2.5 मिलीग्राम) की वांछित मात्रा जोड़ें। 5 एमएल एलिकोट्स बनाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। आसुत पानी में 5x स्टॉक को कमजोर करके लैमली नमूना बफर का 2x कार्य समाधान तैयार करें।

2. तुबुलिन के प्रवर्धन और कटाई स्रोत

नोट: इस प्रोटोकॉल में, ट्यूबलिन के तीन स्रोतों का उपयोग किया गया था: (i) कोशिकाएं (हेला S3 और HEK-293) निलंबन संस्कृतियों के रूप में उगाई जाती हैं; (ii) अनुयायी संस्कृतियों (एचईके-293, हेला और यू2 ओएस) के रूप में उगाई जाने वाली कोशिकाएं); और (iii) माउस मस्तिष्क ऊतक। यह प्रोटोकॉल ट्यूबलिन शुद्धि के दिन को 'दिन 0' मानता है और तदनुसार, अन्य चरणों को दिन 0 के सापेक्ष वर्णित किया गया है।

  1. कोशिकाओं का प्रवर्धन
    1. कोशिकाओं निलंबन संस्कृतियों के रूप में उगाया
      नोट: निलंबन संस्कृतियों से ट्यूबलिन को सफलतापूर्वक शुद्ध करने के लिए, निलंबन संस्कृति के कम से कम 2 एल का उपयोग करें।
      1. निलंबन संस्कृति के 2 एल के लिए, तैयारी के दिन से 10 दिन पहले 6 × 107 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पसंदीदा सेल प्रकार को पुनर्जीवित और विकसित करें। दिन-10 पर, प्लेट कोशिकाओं पर छह 15 सेमी व्यास व्यंजन पर 107 कोशिकाओं प्रति प्लेट।
      2. दिन-8 पर, पूर्ण माध्यम की आवश्यक राशि को 37 डिग्री सेल्सियस तक पहले से गरम करें। बाँझ परिस्थितियों में प्रत्येक स्पिनर बोतल के लिए पूर्व गर्म माध्यम के 1 एल जोड़ें । स्पिनरों को सेल कल्चर इनक्यूबेटर के अंदर 20-25 आरपीएम पर सेट एक उभारक टेबल पर रखें, पार्श्व स्पिनर कैप को थोड़ा खोलें ताकि मीडियम को इनक्यूबेटर के माहौल में बराबरी करने की अनुमति मिल सके ।
        नोट: किसी भी प्रदूषण से बचने के लिए, 70% इथेनॉल का उपयोग करके मीडिया और स्पिनर बोतलों की बाहरी सतह को अच्छी तरह से साफ करें।
      3. दिन-7 पर, 80-90% संगम (लगभग 1.8 × 108 कोशिकाओं) में उगाई जाने वाली कोशिकाओं को ट्राइपसिनाइज और एकत्र करें। एक समय में 3 व्यंजनों से कोशिकाओं को इकट्ठा करें, नीचे स्पिन करें (200 × जी,5 मिनट, कमरे का तापमान), और डीएमईएम के 10 एमएल में सभी कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
        नोट: इस बिंदु पर कोशिकाओं का पूरी तरह से वियोजन स्पिनर बोतलों में बड़े समुच्चय के गठन से बचने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, जो सेल के अस्तित्व को प्रभावित करता है और कम ट्यूबलिन उपज में परिणाम होता है।
      4. डीएमईएम के 1 एल युक्त प्रत्येक स्पिनर बोतल में सेल निलंबन के 5 एमएल जोड़ें, स्पिनरों को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में स्टर्डर टेबल पर वापस करें, और कोशिकाओं को एक सप्ताह तक बढ़ने दें।
    2. अनुयायी संस्कृतियों के रूप में उगाई जाने वाली कोशिकाएं
      नोट: अनुयायी कोशिकाओं से ट्यूबलिन को सफलतापूर्वक शुद्ध करने के लिए, 80-90% संगम के कम से कम 10 व्यंजनों का उपयोग करें।
      1. तुबुलिन तैयारी के दिन से तीन दिन पहले 1 × 108 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए वांछित कोशिका प्रकार को पुनर्जीवित और बढ़ाना।
      2. दिन-3 पर, इन कोशिकाओं को दस 15 सेमी व्यंजनों पर 1 × 107कोशिकाओं प्रति पकवान पर प्लेट करें और उन्हें 80-90% संगम बढ़ने की अनुमति दें।
      3. दिन-1 पर, यदि आवश्यक हो, तो एक प्लाज्मिड के साथ कोशिकाओं को एक ट्यूबलिन-संशोधित एंजाइम या एक विशेष ट्यूबलिन आइसोटाइप व्यक्त करने के लिए ट्रांसफेक्ट करें।
  2. कोशिकाओं/मस्तिष्क ऊतक की कटाई
    1. कोशिकाओं निलंबन संस्कृतियों के रूप में उगाया
      1. स्पिनरों से सेल निलंबन को 1 एल सेंट्रलाइजबोतलों (सामग्री की तालिका)और पैलेट कोशिकाओं में 250 × जी,15 मिनट, कमरे के तापमान में स्थानांतरित करें। स्पिनर की बोतलों में हेला S3 कोशिकाओं की एक और संस्कृति शुरू करने के लिए, स्पिनरों में सेल निलंबन के 100 एमएल छोड़ दें, और स्पिनर बोतल में 1 एल पूर्ण, पूर्व-गर्म डीएमईएम जोड़ें।
        नोट: ट्यूबलिन शुद्धिकरण के लिए आगे बढ़ने से पहले बैक्टीरियल संदूषण की सावधानीपूर्वक जांच करें।
      2. बर्फ-ठंडे पीबीएस के 10 एमएल में प्रत्येक अपकेंद्रित्र की बोतल से पेलेट कोशिकाओं को फिर से रीसुस्पेंड करें, और सभी कोशिकाओं को 50 एमएल स्क्रू-कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें। री-सस्पेंशन के दौरान, कोशिकाओं को बर्फ पर रखें। 250 × जी,15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को गोली।
        नोट: स्पिनर बोतल की सफाई और भंडारण के लिए सिफारिशों का पालन करें (सामग्री की तालिकादेखें) ।
      3. सुपरनेट को त्यागें और सेल पेलेट की मात्रा निर्धारित करें। निलंबन संस्कृति (दो स्पिनर बोतलों) के 2 एल से, 5-6 एमएल के सेल पेलेट की उम्मीद है।
        नोट: नीचे वर्णित प्रोटोकॉल में, सेल गोली की मात्रा को 10 एमएल माना जाता है। प्रयोग को पैलेट वॉल्यूम के हिसाब से एडजस्ट करें।
      4. लाइसिस बफर के 1 वॉल्यूम (10 एमएल) जोड़ें और सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
        नोट: सेल गोली की मात्रा के लिए लाइसिस बफर मात्रा का अनुपात सफल ट्यूबलिन शुद्धिकरण के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। अधिक लाइसिस बफर जोड़ने से ट्यूबलिन एकाग्रता कम हो जाती है, जो तब बहुलीकरण के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण एकाग्रता तक पहुंचने में विफल रहता है, इस प्रकार ट्यूबुलिन उपज को बहुत कम करता है।
        नोट: लाइसिस बफर में पुनः निलंबित कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रोजन किया जा सकता है और दो महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. अनुयायी संस्कृतियों के रूप में उगाई जाने वाली कोशिकाएं
      नोट: अनुयायी संस्कृतियों से कोशिकाओं को सफल ट्यूबलिन शुद्धिकरण (दस 15 सेमी व्यंजनों की कटाई के लिए लगभग 15 मिनट) के लिए बहुत जल्दी काटा जाना चाहिए। प्रोटोकॉल के इस कदम में तीन लोगों ने हिस्सा लिया।
      1. व्यंजनों को झुकाकर 15 सेमी व्यंजनों से माध्यम निकालें, और फिर धीरे-धीरे कमरे के तापमान (व्यक्ति 1) पर पीबीएस-EDTA के 7 मिलीएल के साथ कोशिकाओं को धोएं। मध्यम या बफर के बिना कोशिकाओं को छोड़ने से बचने के लिए एक समय में केवल तीन 15 सेमी व्यंजन के साथ काम करें।
      2. कोशिकाओं में पीबीएस-ईडीटीए के 5 मिलीएल जोड़ें और उन्हें कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      3. कोशिकाओं को धीरे-धीरे डिश (व्यक्ति 2) के एक किनारे पर फावड़े से अलग करने के लिए एक सेल लिफ्टर का उपयोग करें, और सभी कोशिकाओं को 50 एमएल स्क्रू-कैप ट्यूब (व्यक्ति 3) में इकट्ठा करें। व्यंजन से किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए पीबीएस-ईडीटीए के अतिरिक्त 2 एमएल के साथ प्रत्येक प्लेट कुल्ला। इस स्टेप के दौरान 50 एमएल स्क्रू-कैप ट्यूब को बर्फ पर सेल सस्पेंशन युक्त रखें।
      4. 250 × जी,10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को गोली। सुपरनेट को त्यागें और सेल पेलेट की मात्रा निर्धारित करें। दस 15 सेमी व्यंजन से ~ 1 एमएल की मात्रा की उम्मीद करें।
        नोट: नीचे वर्णित प्रोटोकॉल में, सेल गोली की मात्रा को 10 एमएल माना जाता है। प्रयोगों को पैलेट वॉल्यूम के हिसाब से एडजस्ट करें।
      5. लाइसिस बफर के 1 वॉल्यूम (10 एमएल) में कोशिकाओं को फिर से र्ल्स रीसुस्ल करें।
        नोट: लाइसिस बफर में पुनः निलंबित कोशिकाओं को दो महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. मस्तिष्क ऊतक
      नोट: किसी भी उम्र, सेक्स या आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चूहों का उपयोग किया जा सकता है। ट्रांसजेनिक माउस तनाव का चुनाव वैज्ञानिक प्रश्न को संबोधित करने पर निर्भर करेगा। इस पांडुलिपि में, हम ttll1-/-माउस से शुद्ध ट्यूबलिन का उदाहरण दिखाते हैं, जिसमें एक प्रमुख मस्तिष्क ग्लूटामिलटिंग एंजाइम की कमी है, ट्यूबुलिन टायरोसिन लिगासे-जैसे 1 (टीटीएलएल1) प्रोटीन31।
      1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस का बलिदान, जल्दी से काटना, और एक गोल नीचे ट्यूब में मस्तिष्क इकट्ठा। यदि मस्तिष्क पर अधिक रक्त है, तो जल्दी से लाइसिस बफर से धोएं। जैसे ही माउस का त्याग होता है, जैसे ही माउस की बलि दी जाती है, वैसे ही मस्तिष्क को इकट्ठा करें, ट्यूबलिन शुद्धि की सफलता को प्रभावित कर सकता है। समरूपता के लिए उपयोग की जाने वाली जांच की चौड़ाई को समायोजित करने के लिए राउंड-बॉटम ट्यूब का उपयोग करें।
        नोट: एकत्र माउस दिमाग तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रोजन किया जा सकता है और 3 साल तक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      2. वयस्क माउस से निकाले गए एक मस्तिष्क में लाइसिस बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें। बाकी प्रोटोकॉल के लिए, लाइसिस बफर एडेड की मात्रा को 10 एमएल माना जाता है। उपयोग किए जाने वाले दिमाग की संख्या के अनुसार अपने प्रयोग के लिए समायोजित करें।

3. कोशिकाओं या मस्तिष्क ऊतक की लाइसिस

  1. कोशिकाओं निलंबन संस्कृतियों के रूप में उगाया
    1. एचईके-293 के लिए, विभिन्न चौड़ाई के पिपेट युक्तियों का उपयोग करके बर्फ पर कोशिकाओं को बार-बार पिपटिंग करके ऊपर और नीचे ढेल करें। सबसे पहले, 10 एमएल पिपेट में एक p1000 टिप संलग्न करें, और सेल निलंबन को हर 5 मिनट के ऊपर और नीचे, 10 मिनट (पिपटिंग के तीन चक्र) के लिए पिपेट करें। दूसरा, एक p1000 टिप और आगे पिपेट हर 5 मिनट के लिए एक p200 टिप देते हैं, 20 मिनट (pipetting के पांच चक्र) के लिए ।
    2. HeLa S3 के लिए, एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग कर कोशिकाओं lyse (सेटिंग्स के लिए सामग्री की मेज देखें) ।
    3. लाइसिस मिक्स (एल) (एल के 200 μL) की 1/100मात्रा लें, और 2x Laemmli बफर की एक ही मात्रा जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें, और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. अनुयायी संस्कृतियों के रूप में उगाई जाने वाली कोशिकाएं
    1. कोशिकाओं को 14 एमएल राउंड-बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें जिनकी ऊंचाई सोनिकेटर जांच को समायोजित करने के लिए कम कर दी गई है (सेटिंग्स के लिए सामग्री की तालिका देखें)। ~ 45 दालों के लिए कोशिकाओं को सोनिकेट करें, और माइक्रोस्कोप के नीचे लाइसिस मिश्रण की एक बूंद का नमूना लेकर सेल लाइसिस की पुष्टि करें।
      नोट: दालों की संख्या ट्यूबलिन शुद्धिकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल प्रकार के अनुसार भिन्न हो सकती है। सोनिकिंग कोशिकाएं बहुत अधिक ट्यूबलिन का कारण बन सकती हैं और शुद्धि उपज को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेंगी।
    2. एक p200 टिप का उपयोग करके, 20 मिनट (पिपटिंग के पांच चक्र) के लिए हर 5 मिनट में बर्फ पर कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    3. लाइसिस मिक्स (एल) (एल के 200 μL) की 1/100मात्रा लें और 2x Laemmli बफर की एक ही मात्रा जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. मस्तिष्क ऊतक
    1. एक ऊतक ब्लेंडर का उपयोग करके मस्तिष्क के ऊतकों को Lyse (सेटिंग्स के लिए सामग्री की तालिका देखें)। वैकल्पिक रूप से, एक माइक्रोट्यूब मूसल या एक समकक्ष उपकरण और एक 18 जी सुई के साथ एक 1 एमएल सिरिंज के साथ बर्फ पर ऊपर और नीचे पिपेट का उपयोग कर ऊतक lyse ।
    2. लाइसिस मिक्स (एल) (एल के 200 μL) की 1/100मात्रा ले लो, और 2x Laemmli बफर की एक ही मात्रा जोड़ें, 5 मिनट के लिए फोड़ा, और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

4. तुबुलिन का शुद्धिकरण

  1. Lysate स्पष्टीकरण
    1. 150,000 × जी,4 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट पर अपकेंद्रित्र द्वारा लाइसेट (लाइसिस मिश्रण के पैलेट और घुलनशील अंश को अलग करना) साफ करें। अल्ट्रासेंट्रफ्यूज रोटर और ट्यूब के बारे में जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें। सेल अर्क के लिए, अपकेंद्रित्र के बाद अक्सर एक सफेद फ्लोटिंग परत बनती है। इस फ्लोटिंग लेयर को सुपरनेट के साथ स्थानांतरित न करें, क्योंकि यह ट्यूबुलिन बहुलीकरण में हस्तक्षेप करता है। फ्लोटिंग लेयर को परेशान किए बिना सुपरनेट को धीरे-धीरे हटाने के लिए लंबे 20 जी या 21 जी सुई से जुड़ी उचित मात्रा की सिरिंज का उपयोग करें। यदि सुपरनेट अभी भी बादल छाए हुए हैं, तो 5,000 × जीपर अपकेंद्रित्र, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
    2. सुपरनेट (एसएन1) को अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसकी मात्रा नोट करें। 10 एमएल सेल पैलेट के लिए, एसएन1 के लिए ~ 12 एमएल की मात्रा की उम्मीद करें।
    3. SN1 की1/100 मात्रा लें (एसएन 1 के 12 एमएल के लिए 120 माइक्रोन), और 2x लैमली बफर की एक ही मात्रा जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें, और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. बीआरबी 80(सामग्रीकी तालिका) में गोली (पी 1) को फिर से रीसुस्ल्ब करें, जो एसएन1 के समान मात्रा का उपयोग करके है। पी 1 की1/100 मात्रा लें (पी 1 के 20 एमएल के लिए 200 माइक्रोन), और 2x लैमली बफर की एक ही मात्रा जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें, और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. कम मोलेरिटी बफर में पहला बहुलीकरण
    1. 0.2 एम जीटीपी (60 माइक्रोन, अंतिम एकाग्रता 1 m), और 0.5 मात्रा पूर्व-गर्म ग्लाइसेरोल (6 एमएल) की 0.5 मात्रा के संयोजन से पॉलीमराइजेशन मिश्रण तैयार करें।
      नोट: ग्लिसेरोल का उपयोग पूरे प्रोटोकॉल में बहुलककरण चरणों में भीड़ एजेंट के रूप में किया जाता है और इस प्रकार अन्य घटकों की सांद्रता की गणना में विचार नहीं किया जाता है।
    2. मिश्रण को ऊपर और नीचे पिपेट करें, धीरे-धीरे हवा के बुलबुले के गठन से बचें और इसे उपयुक्त अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
      नोट: ट्यूबों में मिश्रण स्थानांतरित करते समय, ट्यूबों के वजन (जोड़े में) को समायोजित करें। यह प्रयोगकर्ता को पॉलीमराइजेशन चरण के बाद माइक्रोट्यूब्यूल के तलछट के लिए सीधे आगे बढ़ने की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल के दौरान सभी बहुलककरण चरणों के लिए ऐसा करें।
    3. ट्यूबों को पैराफिल्म के साथ कवर करें, 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान में स्थानांतरित करें, और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 150,000 × जी, 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। सुपरनैंट (एसएन2) को हटा दें, और पॉलीमराइज्ड माइक्रोट्यूबुल (पी 2) की गोली रखें।
      नोट: माइक्रोट्यूबुले गोली को स्नैप-फ्रोजन किया जा सकता है और 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. SN2 की1/200 मात्रा लें (18 एमएल एसएन2 के लिए 90 माइक्रोन) और 2x लामली बफर की एक ही मात्रा जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें, और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. पहला डेपोलिनाइजेशन
    1. गोली P2 के लिए बर्फ ठंडा BRB80 जोड़कर माइक्रोट्यूबुल्स depolymerize, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़: कोशिकाओं से ट्यूबलिन के लिए, 1/60 (२०० μL) जोड़ें, और दिमाग से ट्यूबलिन के लिए, SN1 की मात्रा के1/20 वें (६०० μL) जोड़ें ।
      नोट: बर्फ की मात्रा ठंड BRB80 depolymerization चरणों के दौरान गोली में जोड़ा हमेशा SN1 की मात्रा के सापेक्ष है ।
    2. माइक्रोट्यूबुले गोली को धीरे-धीरे रीस्बल्ब करें, हवा के बुलबुले से बचें, जब तक कि समाधान पूरी तरह से सजातीय न हो जाए। 20 मिनट (पिपटिंग के पांच चक्र) के लिए हर 5 मिनट में एक p200 टिप के बाद पाइपिंग के चक्रों के एक जोड़े के लिए एक p1000 टिप का उपयोग करें। ट्यूबलिन शुद्धि की सफलता के लिए यह एक महत्वपूर्ण कदम है।
    3. उचित अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों के लिए समाधान स्थानांतरित करें, और 20 मिनट के लिए 150,000 × जी,4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन करें। एसएन3 को एक नई 1.5 एमएल अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस अपकेंद्रित्र चरण (पी 3) के बाद गठित गोली में उपजी प्रोटीन (माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन या एमएपी) और गैर-विकृत माइक्रोट्यूबुल होते हैं। सुपरनेट (एसएन 3) में घुलनशील घटक होते हैं: डिपॉलीमराइज्ड ट्यूबलिन डाइमर और एमएपी, जो डिपॉलीमराइज्ड माइक्रोट्यूबुल्स से अलग हो गए हैं।
    4. एसएन 3 के 1-4 माइक्रोन लें, और 2x लैमली बफर के 9 वॉल्यूम जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें, और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. बीआरबी 80 (एसएन 3 की एक ही मात्रा में) में गोली पी 3 को फिर से रीसुस्ल करें, 1-4 माइक्रोन लें, और 2x लैमली बफर के 9 वॉल्यूम जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. दूसरा बहुलकीकरण (उच्च-मोलेरिटी बफर में)
    1. एसएन3 (200 माइक्रोल), प्री-गर्म 1 एम पाइप (200 माइक्रोल) की 1 मात्रा के संयोजन से बहुलीकरण मिश्रण तैयार करें, अंतिम एकाग्रता 0.5 मीटर), 0.2 एम जीटीपी (2 माइक्रोल, अंतिम एकाग्रता 1 mM), और उचित मात्रा की एक ट्यूब में पूर्व-गर्म ग्लाइसरोल (200 माइक्रोल) की 1 मात्रा 1/100वें वॉल्यूम।
    2. हवा के बुलबुले के गठन से बचते हुए, मिश्रण को ऊपर और नीचे पिपेट करें, और इसे अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    3. ट्यूबों को पैराफिल्म के साथ कवर करें, उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान में स्थानांतरित करें, और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 150,000 × जी,30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट (एसएन4) को हटा दें, और पॉलीमराइज्ड माइक्रोट्यूबुल (पी 4) की गोली रखें। गोली पी 4 में पॉलीमराइज्ड माइक्रोट्यूबुल्स होते हैं, और सुपरनैंट एसएन4 में अनपॉलिमराइज्ड ट्यूबुलिन, एमएपी और अन्य घुलनशील प्रोटीन होते हैं ।
      नोट: दूसरे बहुलीकरण कदम के बाद माइक्रोट्यूबुले गोली स्नैप-फ्रोजन किया जा सकता है और 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. 1-4 माइक्रोल लें और 2x लेमडली बफर के 9 वॉल्यूम जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें, और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. दूसरा डिपॉलीमराइजेशन
    1. गोली P4 के लिए बर्फ ठंडा BRB80 जोड़कर माइक्रोट्यूबुल्स depolymerize, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़: कोशिकाओं से ट्यूबलिन के लिए, 1/100वें (१२० μL) जोड़ें, और दिमाग से ट्यूबुलिन के लिए, SN1 की मात्रा के 1/40वें (३०० μL) जोड़ें ।
    2. 20 मिनट (पिपटिंग के पांच चक्र) के लिए, हर 5 मिनट में एक p200 टिप के साथ ऊपर और नीचे पिपेट।
    3. समाधान को 1.5 एमएल अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 20 मिनट के लिए 150,000 × जी,4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। एसएन5 को एक नई 1.5 एमएल अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस अपकेंद्रित्र चरण (पी 5) के बाद गठित गोली में गैर-विकृत माइक्रोट्यूबुल होते हैं। सुपरनेट (एसएन5) में घुलनशील ट्यूबुलिन होता है।
    4. 1-4 माइक्रोल लें और 2x लेमडली बफर के 9 वॉल्यूम जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें, और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. बीआरबी 80 (एसएन 5 की एक ही मात्रा) में गोली P5 को फिर से खर्च करें, 1-4 माइक्रोन लें, और 2x लेमडली बफर के 9 वॉल्यूम जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें, और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. तीसरा बहुलककरण (कम मोलेरिटी बफर में)
    1. बहुलीकरण मिश्रण तैयार करें: एसएन5 (120 माइक्रोन) की 1 मात्रा, 0.2 एम जीटीपी (0.6 माइक्रोन, अंतिम एकाग्रता 1 m है), और उचित मात्रा की एक ट्यूब में पूर्व-गर्म ग्लिसरोल (60 माइक्रोन) की 0.5 मात्रा।
    2. मिश्रण को ऊपर और नीचे पिपेट करें, धीरे-धीरे हवा के बुलबुले के गठन से बचें, और इसे उपयुक्त अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    3. ट्यूबों को पैराफिल्म के साथ कवर करें, उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान में स्थानांतरित करें, और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 150,000 × जी,30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। गोली (पी 6) में पॉलीमराइज्ड माइक्रोट्यूबुल्स होते हैं और सुपरनिट एसएन6 में नॉन-पॉलीमराइज्ड ट्यूबलिन की छोटी मात्रा होती है ।
      नोट: माइक्रोट्यूबुल छर्रों को स्नैप-फ्रोजन किया जा सकता है और 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. 1-4 माइक्रोल लें और 2x लेमडली बफर के 9 वॉल्यूम जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें, और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. तीसरा डेपोलिनराइजेशन
    1. गोली P6 के लिए बर्फ ठंडा BRB80 जोड़कर माइक्रोट्यूबुल्स depolymerize, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़: कोशिकाओं से ट्यूबलिन के लिए, 1/100वें (१२० μL) जोड़ें, और दिमाग से ट्यूबुलिन के लिए, SN1 की मात्रा के 1/40वें (३०० μL) जोड़ें ।
    2. 20 मिनट (पिपटिंग के पांच चक्र) के लिए, हर 5 मिनट में एक p200 टिप के साथ ऊपर और नीचे पिपेट।
    3. समाधान को उपयुक्त अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और 20 मिनट के लिए 150,000 × जी,4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। एसएन7 को एक नई 1.5 एमएल अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। गोली (P7) गैर-depolymerized माइक्रोट्यूबल की छोटी मात्रा में होता है। सुपरनेट (एसएन 7) में विशेष रूप से डिपॉलीमराइज्ड माइक्रोट्यूबुल्स (घुलनशील ट्यूबुलिन) होते हैं।
    4. 1-4 माइक्रोल लें और 2x लेमडली बफर के 9 वॉल्यूम जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें, और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. बीआरबी 80 (एसएन 7 की एक ही मात्रा) में गोली P7 को फिर से खर्च करें, 1-4 माइक्रोन लें, और 2x लैमली बफर के 9 वॉल्यूम जोड़ें, 5 मिनट के लिए उबालें, और आगे के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. ट्यूबलिन की मात्रा की मात्रा निर्धारित करें (प्रतिनिधि परिणामदेखें) और एलिकोट एसएन 7 को छोटी मात्रा में, स्नैप-फ्रीज, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

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Representative Results

इस विधि का मुख्य लक्ष्य शुद्ध घटकों के साथ विट्रो प्रयोगों में दोहराया प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त मात्रा में उच्च गुणवत्ता, विधानसभा सक्षम ट्यूबलिन का उत्पादन करना है। इस ट्यूबलिन से इकट्ठे किए गए माइक्रोट्यूबुल्स का उपयोग कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी तकनीक के आधार पर पुनर्गठन परख में किया जा सकता है, सूक्ष्मताव गतिशीलता का परीक्षण करने वाले प्रयोगों में, एमएपी या आणविक मोटर्स के साथ बातचीत, और मोटर्स25द्वारा बल उत्पादन। इनका उपयोग माइक्रोट्यूबुल-मैप सह-पेलेटिंग परख और ठोस-राज्य एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी28में भी किया जा सकता है।

शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान ट्यूबलिन के संवर्धन और शुद्धता की निगरानी एक कूमासी-दाग एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (पेज) जेल का उपयोग करके की जा सकती है, अधिमानतः 'टब' एसडीएस-पेज जैल, जो α के अलग होने की अनुमति देता है - और β-ट्यूबलिन, जो जेल शास्त्रीय32में एक बैंड के रूप में सह-प्रवास करता है। विभिन्न चरणों में एकत्र किए गए Lysates (बहुत पिछले depolymerization को छोड़कर, प्रोटोकॉल देखें) ट्यूबलिन शुद्धिकरण(चित्रा 2A)24की सफलता का आकलन करने के लिए तुलनीय मात्रा में जेल पर लोड किए जाते हैं । अंतिम ट्यूबलिन नमूना, जो बहुत कीमती है, केवल ट्यूबलिन एकाग्रता के निर्धारण के लिए जेल पर लोड किया जाता है। पॉलीमराइजेशन और डिपॉलीमराइजेशन के बार-बार चक्रों की प्रक्रिया में कुछ ट्यूबुलिन खोना सामान्य है। अंतिम शुद्ध ट्यूबलिन की कम-से-अधिक अपेक्षित उपज माइक्रोट्यूबुल्स के अपूर्ण विरूपण के कारण हो सकती है, अंशों में ट्यूबलिन की एक महत्वपूर्ण राशि की उपस्थिति से कल्पना P3, P5, और P7, या (ii) माइक्रोट्यूबुल्स में एक अक्षम ट्यूबलिन बहुलीकरण, जिस स्थिति में ट्यूबुलिन की कम मात्रा में अंशों पी 2, पी 4, और पी 6 और अंशों में अधिक है SN2, SN4, और SN6(चित्रा 2B)। यदि बहुलीकरण चरणों (पी 2 और पी 4 की कम मात्रा) (i) के दौरान ट्यूबुलिन खो जाता है, तो बहुलीकरण (ii) के दौरान पर्याप्त ट्यूबुलिन एकाग्रता सुनिश्चित करें, जीटीपी के एक ताजा aliquot का उपयोग करें, और/या (iii) बहुलकीकरण प्रतिक्रिया के तापमान की पुष्टि । यदि ट्यूबुलिन को डीपॉलिमराइजेशन चरणों (एसएन 3 और एसएन 5 की कम मात्रा) के दौरान खो दिया जाता है, तो समय के साथ-साथ बर्फ पर मिश्रण की पिपिंग बढ़ाएं।

शुद्ध ट्यूबलिन के मात्राकरण के लिए, एसडीएस-पेज पर गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए, 0.5 माइक्रोग्राम - 1 माइक्रोग्राम - 2 माइक्रोग्राम - 4 माइक्रोग्राम)(चित्रा 3 ए)की ज्ञात मात्रा के साथ नमूनों को चलाएं। जैल को कूमासी शानदार नीले, स्कैन के साथ दाग दिया जाता है, और बीएसए और ट्यूबलिन बैंड की तीव्रता को मात्रात्मक घनत्व(चित्रा 3 बी)द्वारा मापा जाता है जैसा कि https://openwetware.org/wiki/Protein_Quantification_Using_ImageJ में वर्णित है। कृपया ध्यान दें कि फिजी में एक ही विश्लेषण किया जा सकता है, जो इमेजजे33का एक उन्नत संस्करण है। बीएसए बैंड से मानों रैखिक प्रतिगमन समीकरण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जिसका उपयोग ट्यूबलिन बैंड में प्रोटीन की मात्रा की गणना करने के लिए किया जाता था। केवल ट्यूबलिन बैंड तीव्रता बीएसए वक्र की सीमा के भीतर ट्यूबलिन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है। गणना ट्यूबलिन एकाग्रता के आधार पर, ट्यूबलिन की वांछित मात्रा के aliquots तैयार कर रहे हैं, तरल नाइट्रोजन में स्नैप जमे हुए, और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। हम आमतौर पर हेला S3 निलंबन संस्कृतियों (कोशिकाओं के ~ 15 ग्राम) के चार स्पिनर बोतलों से लगभग ~ 2 मिलीग्राम ट्यूबुलिन प्राप्त करते हैं, दस 15 सेमी व्यास व्यंजन (~ 1.2 ग्राम कोशिकाओं) से ट्यूबलिन के ~ 250 माइक्रोन, और माउस मस्तिष्क ऊतक के 1 ग्राम से ~ 1 मिलीग्राम ट्यूबलिन।

एक विशेष ट्यूबलिन आइसोटाइप या संशोधन के संवर्धन की पुष्टि करने के लिए, शुद्ध ट्यूबबुलिन के ~ 0.1 माइक्रोग्राम को संबंधित एंटीबॉडी34,35का उपयोग करके इम्यूनोब्लोटो किया जा सकता है। नियंत्रण ट्यूबलिन ब्याज की ट्यूबलिन के आधार पर भिन्न होगा। एक संशोधित एंजाइम के साथ ट्यूबलिन संशोधित इन विट्रो के लिए, नियंत्रण के रूप में गैर-इलाज ट्यूबलिन का उपयोग करें। एक संशोधित एंजाइम के अतिव्यक्तता द्वारा सेल्यूलो में संशोधित ट्यूबलिन के लिए, उन कोशिकाओं से शुद्ध ट्यूबलिन का उपयोग करें जो एंजाइम को नियंत्रण(चित्रा 4A)के रूप में व्यक्त नहीं करते हैं। नॉकआउट से शुद्ध ट्यूबलिन के लिए ट्यूबलिन को नियंत्रित करें-माउस दिमाग जंगली प्रकार के चूहों(चित्रा 4B)से ट्यूबुलिन होगा। सभी इम्यूनोब्लॉट विश्लेषणों में, पीटीएम-इंडिपेंडेंट एंटी-α-ट्यूबलिन एंटीबॉडी (12G10) का उपयोग करके ट्यूबलिन का समान भार सत्यापित किया जाता है।

Figure 1
चित्र 1: बहुलीकरण-अपोत्सराकरण चक्रों का उपयोग करके विभिन्न स्रोतों से तुबुलिन शुद्धि। (क)तुबुलिन के विभिन्न स्त्रोतों को विशिष्ट रणनीतियों का उपयोग करके lysed किया जाता है । निलंबन में सुसंस्कृत HeLa S3 कोशिकाओं को एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग कर lysed हैं; एचईके-293 कोशिकाओं को दोहराव वाले पिपटिंग द्वारा lysed किया जाता है। एक ऊतक समरूपता का उपयोग करके सोनीशन और माउस मस्तिष्क ऊतक की छोटी दालों का उपयोग करके अनुयायी कोशिकाओं को lysed किया गया था। (ख)ठंड-अप्लीकीकरण और गर्म बहुलीकरण के चक्रों का उपयोग करके ट्यूबलिन शुद्धिकरण प्रोटोकॉल के क्रमिक चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। लाइसिस और लाइसेट स्पष्टीकरण के बाद, माइक्रोट्यूबुल को बहुलीकृत और पेल किया जाता है। माइक्रोट्यूबुल्स को तब विकृत कर दिया जाता है और बाद में माइक्रोट्यूबुल्स के साथ माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन (एमएपी) सह-तलछट को रोकने, उच्च-मोलेरिटी बफर में बहुलक होने की अनुमति दी जाती है। मानचित्र-मुक्त माइक्रोट्यूबुल्स को तब विकृत किया जाता है और उच्च-मोलेरिटी बफर की ट्रेस मात्रा को हटाने के लिए पॉलीमराइजेशन-डिपॉलिमराइजेशन के तीसरे चक्र के अधीन किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: ट्यूबलिन शुद्धि की सफलता का मूल्यांकन करना। ट्यूबलिन शुद्धिकरण प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों में एकत्र किए गए नमूनों को 'टब' सोडियम डोडेसिल्सफेट-पॉलीएक्रिलेमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) जेल (विवरण के लिए प्रोटोकॉल देखें) पर चलाया गया और कूमासी शानदार नीले रंग से सना हुआ था। (क)एक सफल ट्यूबलिन शुद्धि में, α और β-ट्यूबलिन उत्तरोत्तर प्रक्रिया के दौरान समृद्ध होते हैं । दूसरे बहुलीकरण के बाद, माइक्रोट्यूबुले गोली (पी 4) अन्य प्रोटीन या माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन (एमएपी) से प्रदूषण से लगभग मुक्त है। ध्यान दें कि प्रक्रिया के दौरान कुछ ट्यूबलिन खोना सामान्य है। (ख)एक असफल ट्यूबुलिन शुद्धिकरण में, अंतिम ट्यूबलिन उपज कम होती है, और ट्यूबुलिन या तो पेलेट में डीपॉलिमराइजेशन के बाद या पॉलीमराइजेशन (लाल बक्से) के बाद सुपरनेट में रहता है। यहां दिखाए गए उदाहरण में, ट्यूबलिन ने दोनों बहुलकीकरण चरणों में कुशलता से बहुलककरण नहीं किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: कूमासी-दाग सोडियम डोडेसिलुल्फेट-पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) जैल और घनत्व का उपयोग करके शुद्ध ट्यूबलिन का मात्राकरण। (A)गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए; 0.5, 1, 2 और 4 माइक्रोन, ग्रे ग्रेडिएंट लाइन) और विभिन्न वॉल्यूम (0.5 और 1 माइक्रोन, हल्के और गहरे रंग, क्रमशः) शुद्ध ट्यूबलिन की ज्ञात मात्रा के साथ कूमासी-दाग एसडीएस-पेज जेल। दिखाए गए उदाहरण में, जेल पर टायरोसिनेटेड ट्यूबुलिन (हेला S3 ट्यूबलिन, लाइट और डार्क ऑरेंज) और डिटिरोसिनेटेड ट्यूबलिन (हेला एस 3 ट्यूबुलिन का इलाज कार्बोक्सिपेप्टिडेस ए, लाइट और डार्क ब्लू के साथ) लोड किया गया था। (ख)बीएसए बैंड से (ए) ImageJ (मनमाने ढंग से इकाइयों, AU में) का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया गया था और प्रोटीन भरी हुई (काले अंक के लिए ग्रे) की मात्रा के खिलाफ साजिश रची । उन बिंदुओं का उपयोग रैखिक प्रतिगमन रेखा (ग्रे ढाल रेखा) और समीकरण की गणना करने के लिए किया जाता था, जिनका उपयोग जेल पर लोड किए गए ट्यूबलिन नमूनों (हल्के और गहरे नारंगी और नीले बिंदुओं) में प्रोटीन की मात्रा की गणना करने के लिए किया जाता था। इससे ट्यूबलिन नमूनों की एकाग्रता की गणना में मदद मिली। ध्यान दें कि बीएसए मानक वक्र से परे झूठ बोलने वाले बिंदुओं का उपयोग एकाग्रता (गहरे नारंगी और नीले बिंदु) निर्धारित करने के लिए नहीं किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न पीटीएम के साथ शुद्ध ट्यूबलिन का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण। (A)एचईके-293 कोशिकाओं से शुद्ध ट्यूबुलिन: जीटी335 एंटीबॉडी का उपयोग करके पॉलीग्लोटामाइलेशन के विशिष्ट संवर्धन के लिए टीएलएल 5 या टीटीएलएल 7 को ओवरएक्सप्रेस करने वाली जंगली प्रकार या कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया था। जबकि TTLL5 अतिव्यक्तता α और β-ट्यूबलिन पर पॉलीग्लूटमेशन बढ़ाती है, टीटीएलएल 7 ओवरएक्सप्रेशन विशेष रूप से β-ट्यूबलिन ग्लूटामिलेशन को समृद्ध करता है। (ख)जंगली प्रकार के मस्तिष्क के ऊतकों से शुद्ध तुबुलिन और ग्लूटमाइलेशन के पैटर्न के लिए चूहों का विश्लेषण किया गया । ttll1-/-चूहों से ट्यूबलिन के पॉलीग्लूटमाइलेशन की मजबूत कमी पर ध्यान दें, जिसमें प्रमुख मस्तिष्क ग्लूटामिलीज टीटीएलएल1३६की कमी है । ' टब ' जैल का इस्तेमाल α और β-ट्यूबलिन को अलग करने के लिए किया जाता था । ट्यूबलिन लोड की एक समान राशि 12G10, एक विरोधी α-ट्यूबलिन एंटीबॉडी द्वारा पुष्टि की गई थी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां वर्णित विधि सेल लाइनों और एकल माउस दिमाग से मध्यम-बड़ी मात्रा में उच्च गुणवत्ता वाले, विधानसभा-सक्षम ट्यूबलिन को तेजी से उत्पन्न करने के लिए एक मंच प्रदान करती है। यह कई वर्षों के लिए क्षेत्र में इस्तेमाल गोजातीय दिमाग से ट्यूबलिन शुद्धि के सोने के मानक प्रोटोकॉल पर आधारित है16,17. दृष्टिकोण का एक विशेष लाभ HeLa S3 कोशिकाओं के निलंबन संस्कृतियों का उपयोग है, जो, एक बार स्थापित, कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में पैदावार जबकि थोड़ा हाथ समय पर की आवश्यकता होती है । यह प्रोटोकॉल को किसी भी सेल जीव विज्ञान प्रयोगशाला में प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान बनाता है, जबकि अन्य ट्यूबलिन शुद्धिकरण विधियों18,19,32,37 विशिष्ट उपकरणों और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है और इस प्रकार ज्यादातर प्रोटीन शुद्धिकरण में एक मजबूत पृष्ठभूमि वाली प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया जाता है। अनुयायी कोशिका रेखाओं से ट्यूबलिन की छोटी मात्रा का उत्पादन करते समय, विभिन्न प्रकार की सेल लाइनों का उपयोग किया जा सकता है। हमने हेला, यू-2 ओएस और एचईके-293 कोशिकाओं से ट्यूबलिन को सफलतापूर्वक शुद्ध किया है। यदि बड़े पैमाने पर शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है, तो काटा गया कोशिकाओं या दिमाग को लाइसिस बफर में स्नैप-फ्रोजन किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, और बड़ी मात्रा में ट्यूबलिन को शुद्ध करने के लिए कई सेल छर्रों या दिमाग को एक साथ जमा किया जा सकता है।

सेल लाइनों से शुद्ध ट्यूबलिन वस्तुतः ट्यूबलिन पीटीएमएस से मुक्त है। इस टायर-ट्यूबलिन को आसानी से एक सीधा कदम25में डिटिरोसिन (deTyr-) ट्यूबुलिन में परिवर्तित किया जा सकता है। अन्य पीटीएम के साथ ट्यूबलिन का उत्पादन करने के लिए, तुबुलिन शुद्धिकरण से पहले कोशिकाओं में विशिष्ट ट्यूबलिन-संशोधित एंजाइमों को अतिव्यक्त किया जा सकता है। इसके अलावा, सामग्री के स्रोत के रूप में मानव मूल की सेल लाइनों का उपयोग करते समय माइक्रोट्यूबल और मानव एमएपी के बीच बातचीत का अध्ययन करते समय संभावित क्रॉस-प्रजातियों के मुद्दों से बचने में मदद करता है। इसके अलावा, असंस्थांत (जैसे HEK293) या रूपांतरित (जैसे हेला) कोशिकाओं से ट्यूबुलिन सामान्य-बनाम ट्यूमर-सेल माइक्रोट्यूबुल्स पर माइक्रोट्यूबुले निर्देशित दवाओं (जैसे, टैक्सनेन) के प्रभावों के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

अंत में, हमारा प्रोटोकॉल एकल माउस दिमाग से ट्यूबलिन की शुद्धि की सुविधा देता है। चूंकि ट्यूबलिन म्यूटेशन और संशोधनों के माउस मॉडल की बढ़ती संख्या उत्पन्न की जा रही है, इस प्रोटोकॉल में बदल गए ट्यूबुलिन आइसोटाइप संरचना38, 39, 40या ट्यूबलिन पीटीएम31,41 के साथ माइक्रोट्यूबुल के गुणों और बातचीत के प्रत्यक्ष विश्लेषण की अनुमति दी जाती है।

दृष्टिकोण बहुलीकरण और depolymerization के चक्र पर आधारित है । इस प्रकार, विशेष पीटीएम के साथ विशिष्ट ट्यूबलिन आइसोटाइप या ट्यूबलिन जो असेंबली को प्रभावित करते हैं और माइक्रोट्यूबुल के गुणों को अलग करते हैं, शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान आय से अधिक नुकसान या ऐसे ट्यूबलिन रूपों में कमी कर सकते हैं। फिर भी, हमने दिखाया है कि प्रमुख ट्यूबुलिन पीटीएम, जैसे एसिटिलेशन, डिटिरोसिनेशन, ग्लूटामिलेशन, और ग्लाइसिलेशन, ट्यूबुलिन शुद्धिकरण प्रक्रिया24में माइक्रोट्यूबुल्स पर बनाए रखे जाते हैं। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कोशिकाओं या ऊतकों में ट्यूबलिन संरचना के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, TOG-कॉलम आधारित ट्यूबलिन शुद्धिकरण दृष्टिकोण अधिक उपयुक्त है क्योंकि यह निष्पक्ष, बहुलकीकरण-स्वतंत्र ट्यूबलिन शुद्धिकरण18की अनुमति देगा। अपनी सीमा के बावजूद, हमारा प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले ट्यूबलिन की बड़ी मात्रा पैदा करने में एक बड़ा लाभ प्रदान करता है जिसका उपयोग विट्रो पुनर्गठन प्रयोगों में सावधानीपूर्वक किया जा सकता है। खासतौर पर यह रूटीन प्रयोगों में पीटीएम से भरपूर ब्रेन ट्यूबलिन के इस्तेमाल की सुविधा देता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एएनआर-10-आईडीईएक्स-0001-02, लैबएक्स सेल'एन scale ANR-11-LBX-0038 और इंस्टीटयूट डी कन्वर्जेंस क्यू-लाइफ एएनआर-17-CONV-0005 द्वारा समर्थित किया गया था। सीजे को इंस्टीटयूट क्यूरी द्वारा समर्थित किया जाता है, फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (एएनआर) पुरस्कार ANR-12-BSV2-0007 और ANR-17-CE13-0021, संस्थान राष्ट्रीय du Cancer (INCA) अनुदान २०१४-PL जैव-11-आईसीआर-1, और Fondation डालना ला Recherche Medicale (FRM) अनुदान DEQ217033676 । एमएमएम को प्रियतम वैंके अल्जाइमर ग्रांट एफआर-16055p और फ्रांस अल्जाइमर ग्रांट AAP एसएम 2019 एन ° 2023 द्वारा समर्थित किया गया है। जेएएस को मैरी स्क्लोडोस्का-क्यूरी ग्रांट एग्रीमेंट नंबर 675737 के तहत यूरोपियन यूनियन के क्षितिज 2020 रिसर्च एंड इनोवेशन प्रोग्राम और एफआरएम ग्रांट FDT201904008210 द्वारा समर्थित किया गया था। एसबी को एफआरएम ग्रांट एफडीटी201805005465 का समर्थन मिला।

हम प्रोटोकाल की स्थापना के दौरान मदद के लिए जानकी लैब के सभी सदस्यों, विशेष रूप से जे सूपरॉन के साथ-साथ जी लाडिसिक (इंस्टीटयूट माइकालिस, एग्रोपरिअलिस) और ए गौट्रेऊ (इकोले पॉलीटेक्निक) को धन्यवाद देते हैं। हम माउस प्रजनन और देखभाल के साथ मदद के लिए इंस्टीटयूट क्यूरी की पशु सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

जे फ्रेंकेल और एम नेल्सन द्वारा विकसित एंटीबॉडी 12G10, एनआईसीएचडी के तत्वावधान में विकसित विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक से प्राप्त किया गया था और आयोवा विश्वविद्यालय द्वारा बनाए रखा गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M MgCl2  Sigma #M1028
1-L cell culture vessels Techne F7610  Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol  Sigma  #M3148 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride  Sigma  #A8456
40% Acrylamide  Bio-Rad  #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS) Sigma #A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10  Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335  AdipoGen  #AG-20B-0020 dilution: 1/20,000
Aprotinin  Sigma  #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles  For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge For collecting spinner cultures
Biological stirrer  Techne MCS-104L  Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide  Bio-Rad  #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  #A7906
Bromophenol blue  Sigma  #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA) Sigma #C9268 Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  Sigma  #D8418 DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium  Life Technologies  #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol  Sigma  #D9779
EDTA Euromedex #EU0007-C
EGTA Sigma  #E3889
Ethanol absolute  Fisher Chemical  #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F7524
French pressure cell press  Thermo electron corporation  #FA-078A with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol  VWR Chemicals  #24388.295
Glycine Sigma #G8898
GTP  Sigma  #G8877
Heating block  Stuart  #SBH130D
Hela cells  ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells  ATCC ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl ) VWR #20252.290
Inverted microscope  With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol  VWR  #20842.298
jetPEI Polyplus  #101
JLA-8.1000 rotor  For collecting spinner cultures
KOH  Sigma  #P1767 KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine  Life Technologies  #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes Sigma 4-16 K 
Leupeptin  Sigma #L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles Eppendorf #0030 120.973
Mouse brain tissue  Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm Terumo #18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm Terumo #20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm B.Braun #466 5643
Parafilm
PBS  Life Technologies  #14190169
Penicillin-Streptomycin  Life Technologies  #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma  #P7626 PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES  Sigma  #P6757
Pipette-boy
Rotors Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment  Bio-Rad  #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate  VWR  #442444H For preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate  Sigma  #L5750 For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator  Branson #101-148-070 Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes Eppendorf 5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine  Sigma #9281
Trichostatin A (TSA) Sigma #T8552
Triton X-100  Sigma  #T9284
Trizma base (Tris) Sigma  #T1503
Trypsin  Life Technologies #15090046
Ultracentrifuge rotors  TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes  Beckman #357448  for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #349622 for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #355631  for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges Beckman Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders Set at 30°C 

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 165 माइक्रोट्यूबुल्स इन विट्रो पुनर्गठन ट्यूबुलिन ट्यूबलिन शुद्धिकरण बहुलीकरण माइक्रोट्यूबुले डायनेमिक्स ट्यूबुलिन कोड ट्यूबलिन आइसोटाइप सस्पेंशन कल्चर ट्यूबलिन पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन
पॉलीमर्ाइजेशन-डेपोलिमराइजेशन चक्रों द्वारा सीमित स्रोतों से नियंत्रित पोस्टट्रांसलाइजेशनल संशोधनों और आइसोटाइप के साथ ट्यूबलिन का शुद्धिकरण
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Bodakuntla, S., Jijumon, A. S.,… More

Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles. J. Vis. Exp. (165), e61826, doi:10.3791/61826 (2020).

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