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Biochemistry

Purification de la tubuline avec modifications posttranslationnelles contrôlées et isotypes à partir de sources limitées par des cycles de polymérisation et de dépolymérisation

Published: November 5, 2020 doi: 10.3791/61826
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2
1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit la purification de la tubuline à partir de sources à petite ou moyenne échelle telles que les cellules de culture ou les cerveaux d’une seule souris, à l’aide de cycles de polymérisation et de dpolymérisation. La tubuline purifiée est enrichie en isotypes spécifiques ou a des modifications posttranslationnelles spécifiques et peut être utilisée dans des tests de reconstitution in vitro pour étudier la dynamique et les interactions des microtubules.

Abstract

Un aspect important des études du cytosquelette de microtubule est l’investigation du comportement de microtubule dans les expériences in vitro de reconstitution. Ils permettent l’analyse des propriétés intrinsèques des microtubules, telles que la dynamique, et de leurs interactions avec les protéines associées aux microtubules (MAP). Le « code de la tubuline » est un concept émergent qui indique différents isotypes de la tubuline et diverses modifications posttranslationnelles (MNP) en tant que régulateurs des propriétés et fonctions des microtubules. Pour explorer les mécanismes moléculaires du code de la tubuline, il est crucial d’effectuer des expériences de reconstitution in vitro à l’aide de tubuline purifiée avec des isotypes et des MNP spécifiques.

À ce jour, cela a été techniquement difficile que la tubuline du cerveau, qui est largement utilisé dans les expériences in vitro, abrite de nombreux M PT et a une composition définie isotype. Par conséquent, nous avons développé ce protocole pour purifier la tubuline à partir de différentes sources et avec différentes compositions d’isotypes et ptms contrôlés, en utilisant l’approche classique des cycles de polymérisation et de démlymerisation. Comparée aux méthodes existantes basées sur la purification d’affinité, cette approche produit la tubuline pure et polymérisation-compétente, car la tubuline résistante à la polymérisation ou à la dénolysation est jetée pendant les étapes successives de purification.

Nous décrivons la purification de la tubuline à partir de lignées cellulaires, cultivées soit en suspension, soit en cultures adhérentes, et à partir de cerveaux de souris simples. La méthode décrit d’abord la génération de masse cellulaire dans les paramètres de suspension et d’adhérent, l’étape de la lyse, suivie des étapes successives de purification de la tubuline par des cycles de polymérisation-dérimérisation. Notre méthode produit de la tubuline qui peut être utilisée dans des expériences traitant de l’impact du code de la tubuline sur les propriétés intrinsèques des microtubules et des interactions microtubules avec les protéines associées.

Introduction

Les microtubules jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus cellulaires. Ils donnent aux cellules leur forme, construisent des fuseaux méiotiques et mitotiques pour la ségrégation chromosomique, et servent de pistes pour le transport intracellulaire. Pour remplir ces diverses fonctions, les microtubules s’organisent de différentes manières. L’une des questions intrigantes sur le terrain est de comprendre les mécanismes moléculaires qui permettent aux microtubules structurellement et évolutionnistes de s’adapter à cette pléthore d’organisations et de fonctions. Un mécanisme potentiel est la diversification des microtubules, qui est définie par le concept connu sous le nom de « code tubulin »1,2,3. Le code de la tubuline comprend deux composantes principales : l’incorporation différentielle de produits géniques α et β-tubulin (isotypes tubulaires) dans les microtubules et les modifications posttranslationnelles à la tubuline (MNP).

Depuis les années 1970, les expériences de reconstitution in vitro, combinées à l’évolution des techniques de microscopie légère, ont ouvert la voie à d’importantes découvertes sur les propriétés des microtubules : instabilitédynamique 4 et tapisroulant 5, et leurs autres mécanismeset fonctions 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Presque toutes les expériences in vitro réalisées jusqu’ici ont été basées sur la tubuline purifiée du tissu cérébral utilisant des cycles répétés de polymérisation et de dpolymérisation16,17. Bien que la purification du tissu cérébral confère l’avantage d’obtenir la tubuline de haute qualité en grandes quantités (généralement des quantités de gramme), un inconvénient important est l’hétérogénéité que la tubuline purifiée à partir du tissu cérébral est un mélange de différents isotypes de tubuline et est enrichi avec de nombreux PTMs tubulin. Cette hétérogénéité rend impossible la délimiture du rôle d’un PTM ou d’un isotype de tubuline particulier dans le contrôle des propriétés et des fonctions des microtubules. Ainsi, la production d’une tubuline compétente en assemblage avec des MNP tubulaires contrôlés et une composition homogène d’isotype est essentielle pour traiter les mécanismes moléculaires du code de la tubuline.

Récemment, une approche pour purifier la tubuline par chromatographie d’affinité utilisant le domaine de TOG microtubule-liant (gène tumeur-surexprimé) de levure Stu2p a étédéveloppée 18. Dans cette méthode, la tubuline dans les lysates bruts des cellules ou des tissus est passée à travers une colonne où elle se lie au domaine TOG immobilisé par matrice, ce qui permet l’analyse de l’ensemble du pool de tubulines d’un échantillon donné, voire très petit. Une approche attendue depuis longtemps pour purifier la tubuline recombinante a également été décrite ces dernières années. Il est basé sur le système de baculovirus, dans lequel un vecteur bi-cistronic contenant des gènes de α- et β-tubulin est exprimé dans les cellules d’insecte19. Cependant, cette méthode est très lourde et prend beaucoup de temps et est donc principalement utilisée pour étudier l’impact des mutations de la tubuline20 et des isotypes de la tubuline21,22,23 in vitro.

Dans le protocole actuel, nous décrivons une méthode qui utilise l’approche bien établie et largement utilisée de polymérisation-dépolymérisation comme modèle pour produire la tubuline avec différents niveaux de modification soit des lignes cellulaires ou du tissu cérébral de souris24. Dans cette procédure, la tubuline est pédalée entre la forme soluble (dimère tubuline à 4 °C) et polymère (microtubule à 30 °C en présence de guanosine 5'-triphosphate [GTP]). Chaque forme est séparée par des étapes successives de centrifugation : les dimers de tubuline resteront dans le supernatant après une rotation froide (4 °C), tandis que les microtubules seront granulés à 30 °C. En outre, une étape de polymérisation est effectuée à haute concentration de piperazine-N,N′-bis (acide 2-éthanesulfonique) (PIPES), ce qui permet l’élimination des protéines associées aux microtubules des microtubules et donc, de la tubuline finalement purifiée. La tubuline purifiée à partir des cellules HeLa S3 cultivées sous forme de cultures de suspension ou d’adhérent est pratiquement exempte de n’importe quelle tubuline PTM et a été utilisée dans des expériences récentes de reconstitution in vitro25,26,27,28. Nous avons en outre adapté la méthode pour purifier la tubuline à partir de cerveaux de souris simples, qui peuvent être utilisés pour un grand nombre de modèles de souris avec des changements dans les isotypes de la tubuline et les MNP.

Dans le protocole, nous décrivons d’abord la génération du matériau source (masse cellulaire ou tissu cérébral), sa lyse (figure 1A), suivie des étapes successives de polymérisation et de dénolysation des tubulines pour purifier la tubuline (Figure 1B). Nous décrivons en outre le processus d’évaluation de la pureté (figure 2A,B) et de la quantité (figure 3A,B) de la tubuline purifiée. La méthode peut être adaptée pour produire de la tubuline enrichie d’un PTM sélectionné en surexprimant une enzyme modérable dans les cellules avant la purification de la tubuline (Figure 4B). Alternativement, des enzymes modifiant la tubuline peuvent être ajoutées à la tubuline pendant le processus de purification. Enfin, nous pouvons purifier la tubuline dépourvue d’isotypes spécifiques ou de MNP provenant du cerveau de souris déficientes dans les enzymes correspondantes modificateurs de la tubuline (figure 4B)29.

La méthode que nous décrivons ici présente deux avantages principaux : (i) elle permet la production de quantités suffisamment importantes de tubuline en relativement peu de temps, et (ii) elle génère une tubuline pure de haute qualité, avec une composition spécifique d’isotype de tubuline ou des MNP. Dans la vidéo associée de ce manuscrit, nous soulignons quelques-unes des étapes critiques impliquées dans cette procédure.

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Protocol

Les soins et l’utilisation des animaux dans le cadre de cette étude ont été effectués conformément aux recommandations de la Communauté européenne (2010/63/UE). Les procédures expérimentales ont été spécifiquement approuvées par le comité d’éthique de l’Institut Curie CEEA-IC #118 (autorisation n° 04395.03 donnée par l’Autorité nationale) conformément aux directives internationales.

1. Préparation des reagents pour la purification de la tubuline

REMARQUE : Tous les tampons utilisés pour la purification de la tubuline doivent contenir des sels de potassium et non des sels de sodium30.

  1. Préparer 1 L de milieu complet : le milieu eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, 100 mL), 200 mM de L-glutamine (10 mL de 2 M de bouillon) et 1 x pénicilline-streptomycine (10 mL de stock de 100 x). Conserver à 4 °C.
  2. Préparer 10 M d’hydroxyde de potassium (KOH) en dissolvant 140 g de KOH dans l’eau, ajuster le volume final à 250 mL et les conserver à température ambiante.
  3. Préparer 0,5 M d’acide tétracétique éthylènediamine (EDTA), pH 8, en dissolvant 36,5 g d’EDTA dans l’eau, ajuster le pH à 8,0 à l’aide de KOH (sinon EDTA ne se dissoudra pas) et le volume final à 250 mL, filtrer-stériliser, et stocker à température ambiante.
  4. Préparer 5 mM de solution saline tamponnée de phosphate (PBS)-EDTA en ajoutant 5 mL de 0,5 M EDTA à 500 mL de PBS, filtrer-stériliser et conserver à température ambiante.
  5. Préparer 0,5 M K-PIPES, pH 6.8, en dissolvant 75,5 g de PIPES dans l’eau, ajuster au pH 6.8 avec KOH (sinon PIPES ne se dissoudra pas) et le volume final à 500 mL, filtrer-stériliser, et stocker à 4 °C.
  6. Préparer 1 M K-PIPES, pH 6.8, en dissolvant 15,1 g de PIPES dans l’eau, ajuster au pH 6.8 avec KOH et le volume final à 50 mL, filtrer-stériliser, et stocker à 4 °C.
  7. Préparer 0,5 M potassium-éthylène glycol-bis (éther β-aminoethyl)-N,N,N′,N′-acide tétraacétique (K-EGTA, pH 7.7) en dissolvant 47,5 g d’EGTA dans l’eau, ajuster au pH 7,7 avec KOH et le volume final à 250 mL, filtrer-stériliser, et stocker à température ambiante.
  8. Préparer BRB80 (80 mM K-PIPES, pH 6,8; 1 mM K-EGTA; 1 mM chlorure de magnésium [MgCl2])solution en mélangeant 3,2 mL de 0,5 M PIPES, 40 μL de 0,5 M K-EGTA, et 20 μL de 1 M MgCl2 et ajuster le volume final à 20 mL. Conserver à 4 °C.
  9. Préparer 0,1 M de fluorure de phénythéthanesulfonyl (PMSF) en dissolvant 435 mg de PMSF dans l’isopropanol pour obtenir un volume final de 25 mL et conserver à -20 °C.
  10. Préparer le mélange d’inhibiteurs de la protéase (200x) en dissolvant 10 mg d’aprotinine, 10 mg de leupeptine et 10 mg de fluorure de benzénerosulfonyl de 4(2 aminoéthyles) dans l’eau pour obtenir un volume final de 2,5 mL, faire des aliquots de 100 μL et les conserver à -20 °C.
  11. Préparer 10% Triton X-100 en mélangeant 5 mL de Triton X-100 dans 45 mL d’eau, filtrer-stériliser, et stocker à température ambiante.
  12. Préparer le tampon de lyse (BRB80 complété par 1 mM 2-mercaptoéthanol, 1 mM PMSF, 1x inhibiteurs de protéase mélange et, en option pour les cellules HEK-293, 0,2% Triton X-100) le jour de la purification de la tubuline en mélangeant 20 mL de BRB80 avec 1,5 μL de 2-mercaptoéthanol, 200 μL de 0,1 M PMSF, 100 μL du mélange inhibiteurs de la protéase et, en option, pour les cellules HEK-293 , 400 μL de 10% Triton X-100.
    REMARQUE : Le 2-mercaptoéthanol est toxique et doit être utilisé dans le capot de fumée.
  13. Préparer 0,2 M GTP en dissolvant 1 g de GTP dans 9,5 mL d’eau, ajuster le pH à 7,5 à l’aide de KOH, faire des aliquots de 20 μL et les conserver à -20 °C. Évitez les cycles répétés de gel-dégel.
  14. Préparer 1 M tris (hydroxyméthyle) aminométhane-hydrochlorure (Tris-HCl) en dissolvant 60,56 g de Tris dans l’eau, ajuster au pH 6,8 avec HCl, avec un volume final de 500 mL, filtrer-stériliser, et stocker à température ambiante.
  15. Préparer 5x Tampon échantillon Laemmli (450 mM dithiothreitol (TNT); 10% dodecylsulfate de sodium (SDS); 400 μM Tris-HCl, pH 6,8; 50% glycérol; ~0,006% bleu bromophénol) en ajoutant 4 g de SDS à 16 mL de préchauffé 1 M Tris-HCl, pH 6,8, et mélanger la solution doucement. Ajouter 2,6 g de TNT et 20 mL de glycérol à 100 % au mélange et remuer jusqu’à ce que la solution devienne homogène. Ajouter la quantité désirée de bleu bromophénol (2,5 mg) pour atteindre l’intensité de couleur requise. Faire 5 mL aliquots et conserver à -20 °C. Préparer la solution 2x de travail de tampon échantillon Laemmli en diluant le stock 5x dans de l’eau distillée.

2. Amplification et récolte des sources de tubuline

REMARQUE : Dans ce protocole, trois sources de tubuline ont été utilisées : (i) les cellules (HeLa S3 et HEK-293) cultivées en cultures de suspension; (ii) les cellules cultivées en tant que cultures adhérentes (HEK-293, HeLa et U2 OS); et (iii) tissu cérébral de souris. Ce protocole considère le jour de purification de la tubuline comme « jour 0 » et, par conséquent, d’autres étapes ont été décrites par rapport au jour 0.

  1. Amplification des cellules
    1. Cellules cultivées en tant que cultures de suspension
      REMARQUE : Pour purifier avec succès la tubuline des cultures de suspension, utilisez au moins 2 L de culture de suspension.
      1. Pour 2 L de culture de suspension, raviver et cultiver le type de cellule préféré pour obtenir 6 × 107 cellules 10 jours avant le jour de la préparation. Le jour -10, plaques sur six plats de 15 cm de diamètre à 107 cellules par assiette.
      2. Le jour -8, préchauffer la quantité requise de milieu complet à 37 °C. Ajouter 1 L de milieu préchauffé à chaque bouteille de filature dans des conditions stériles. Placez les essoreurs sur une table agitée fixée à 20-25 tours à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire, ouvrez légèrement les bouchons de filature latérale pour permettre au milieu d’équilibrer à l’atmosphère de l’incubateur.
        REMARQUE : Pour éviter toute contamination, nettoyez soigneusement la surface extérieure des bouteilles multimédias et filatures à l’aide de 70 % d’éthanol.
      3. Le jour -7, trypsinize et recueillir les cellules cultivées à 80-90% confluent (environ 1,8 × 108 cellules). Recueillir les cellules à partir de 3 plats à la fois, tourner vers le bas (200 × g, 5 min, température ambiante), et re-suspendre toutes les cellules dans 10 mL de DMEM.
        REMARQUE : La dissociation complète des cellules à ce stade est très importante pour éviter la formation de plus gros agrégats dans les bouteilles de filature, ce qui affecte la survie cellulaire et entraîne un faible rendement en tubuline.
      4. Ajouter 5 mL de suspension cellulaire à chaque bouteille de spinner contenant 1 L de DMEM, remettre les essoreuses à la table d’agitateur dans l’incubateur de culture cellulaire, et permettre aux cellules de croître pendant une semaine.
    2. Cellules cultivées en tant que cultures adhérentes
      REMARQUE : Pour purifier avec succès la tubuline des cellules adhérentes, utilisez un minimum de 10 plats de 80 à 90 % de confluence.
      1. Raviver et amplifier le type de cellule désiré pour obtenir 1 × 108 cellules trois jours avant le jour de la préparation de la tubuline.
      2. Le jour -3, plaquez ces cellules sur dix plats de 15 cm à 1 × 107cellules par plat et laissez-les pousser 80-90% de confluence.
      3. Le jour -1, si nécessaire, les cellules transfect avec un plasmide pour exprimer une enzyme modifiant la tubuline ou un isotype particulier de la tubuline.
  2. Récolte des cellules et des tissus cérébraux
    1. Cellules cultivées en tant que cultures de suspension
      1. Transférer la suspension cellulaire des essoreuses dans 1 bouteille de centrifugeuse L(table des matériaux)et les cellules à granulés à 250 × g,15 min, température ambiante. Pour commencer immédiatement une autre culture des cellules HeLa S3 dans les bouteilles de filature, laissez 100 mL de suspension cellulaire dans les essoreuses, et ajoutez 1 L de DMEM complet et préchauffé à la bouteille de filature.
        REMARQUE : Vérifiez soigneusement la contamination bactérienne avant de procéder à la purification de la tubuline.
      2. Resuspendez les cellules granulées de chaque bouteille de centrifugeuse dans 10 mL de PBS glacé, et transférez toutes les cellules dans des tubes à bouchon à vis de 50 mL. Pendant la suspension, garder les cellules sur la glace. Pelleter les cellules à 250 × g,15 min, 4 °C.
        REMARQUE : Suivez les recommandations concernant le nettoyage et l’entreposage des bouteilles de filature (voir tableau des matériaux).
      3. Jetez le supernatant et déterminez le volume de la pastille cellulaire. De 2 L de culture de suspension (deux bouteilles de spinner), attendez-vous à une pastille cellulaire de 5-6 mL.
        REMARQUE : Dans le protocole décrit ci-dessous, le volume de granulés cellulaires est supposé être de 10 mL. Ajustez l’expérience en fonction des volumes de granulés.
      4. Ajouter 1 volume (10 mL) de tampon de lyse et suspendre à nouveau la pastille cellulaire.
        REMARQUE : Le rapport entre le volume de granulés cellulaires et le volume tampon de lyse est très important pour la purification réussie de la tubuline. L’ajout de plus de tampon de lyse diminue la concentration de tubuline, qui n’atteint alors pas la concentration critique nécessaire à la polymérisation, réduisant ainsi considérablement le rendement de la tubuline.
        REMARQUE : Les cellules résusées dans le tampon de lyse peuvent être congelées dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C pendant deux mois.
    2. Cellules cultivées en tant que cultures adhérentes
      REMARQUE : Les cellules des cultures adhérentes doivent être récoltées très rapidement pour une purification réussie de la tubuline (environ 15 minutes pour la récolte de dix plats de 15 cm). Trois personnes ont participé à cette étape du protocole.
      1. Retirer le milieu de la vaisselle de 15 cm en inclinant la vaisselle, puis laver délicatement les cellules avec 7 mL de PBS-EDTA à température ambiante (personne 1). Ne travaillez qu’avec trois plats de 15 cm à la fois pour éviter de laisser les cellules sans milieu ni tampon.
      2. Ajouter 5 mL de PBS-EDTA aux cellules et les incuber pendant 5 min à température ambiante.
      3. Utilisez un élévateur cellulaire pour détacher doucement les cellules en les pelletant à un bord du plat (personne 2), et recueillir toutes les cellules dans un tube à bouchon à vis de 50 mL (personne 3). Rincer chaque assiette avec 2 mL supplémentaires de PBS-EDTA pour recueillir les cellules restantes de la vaisselle. Au cours de cette étape, gardez le tube de bouchon à vis de 50 mL contenant la suspension cellulaire sur la glace.
      4. Pelleter les cellules à 250 × g,10 min, 4 °C. Jetez le supernatant et déterminez le volume de la pastille cellulaire. Attendez-vous à un volume d’environ 1 mL à partir de dix plats de 15 cm.
        REMARQUE : Dans le protocole décrit ci-dessous, le volume de granulés cellulaires est supposé être de 10 mL. Ajustez les expériences en fonction des volumes de granulés.
      5. Resuspendez les cellules en 1 volume (10 mL) de tampon de lyse.
        REMARQUE : Les cellules réutilisées dans le tampon de lyse peuvent être stockées à -80 °C jusqu’à deux mois.
    3. Tissu cérébral
      REMARQUE : Des souris de tout âge, sexe ou origine génétique peuvent être utilisées. Le choix de la souche transgénique de la souris dépendra de la question scientifique à traiter. Dans ce manuscrit, nous montrons l’exemple de la tubuline purifiée à partir de la ttll1-/- souris, dépourvue d’une enzyme fessier majeure du cerveau, la protéine31de la tyrosine tyrosine de la baignoire 1 (TTLL1).
      1. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale, décapitez rapidement et rassemblez le cerveau dans un tube à fond rond. S’il y a excès de sang sur le cerveau, lavez-le rapidement avec un tampon de lyse. Recueillir le cerveau dès que la souris est sacrifiée comme un retard post mortem peut affecter le succès de la purification de la tubuline. Utilisez des tubes à fond rond pour tenir compte de la largeur de la sonde utilisée pour l’homogénéisation.
        REMARQUE : Les cerveaux de souris collectés peuvent être congelés dans de l’azote liquide et stockés à -80 °C jusqu’à 3 ans.
      2. Ajouter 500 μL de tampon de lyse à un seul cerveau extrait d’une souris adulte. Pour le reste du protocole, le volume de tampon de lyse ajouté est supposé être de 10 mL. Ajustez-vous pour votre expérience en fonction du nombre de cerveaux à utiliser.

3. Lyse des cellules ou des tissus cérébraux

  1. Cellules cultivées en tant que cultures de suspension
    1. Pour HEK-293, lyse les cellules sur la glace en pipetting répétitivement de haut en bas à l’aide de pointes pipette de différentes largeurs. Tout d’abord, fixez une pointe p1000 à une pipette de 10 mL, et pipette la suspension cellulaire de haut en bas toutes les 5 minutes, pendant 10 min (trois cycles de pipetage). Deuxièmement, fixez une pointe p200 à une pointe p1000 et une pipette supplémentaire toutes les 5 minutes, pendant 20 min (cinq cycles de pipetage).
    2. Pour HeLa S3, lyse les cellules à l’aide d’Français presse (voir tableau des matériaux pour les paramètres).
    3. Prendre 1/100e de volume du mélange de lyse (L) (200 μL pour 20 mL de L), et ajouter le même volume de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et conserver à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
  2. Cellules cultivées en tant que cultures adhérentes
    1. Transférer les cellules dans un tube à fond rond de 14 mL dont la hauteur a été réduite pour accueillir la sonde sonicator (voir tableau des matériaux pour les réglages). Sonicate les cellules pour ~ 45 impulsions, et de confirmer la lyse cellulaire en échantillonnant une goutte du mélange de lyse sous un microscope.
      REMARQUE : Le nombre d’impulsions peut varier selon le type de cellule utilisé pour la purification de la tubuline. Des cellules sonicantes trop pourraient provoquer une précipitation de la tubuline et affecter négativement le rendement de purification.
    2. Pipette les cellules de haut en bas sur la glace toutes les 5 minutes pendant 20 min (cinq cycles de pipetage), à l’aide d’une pointe p200.
    3. Prendre 1/100e volume de mélange de lyse (L) (200 μL pour 20 mL de L) et ajouter le même volume de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 minutes et conserver à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
  3. Tissu cérébral
    1. Lyse le tissu cérébral à l’aide d’un mélangeur de tissus (voir tableau des matériaux pour les paramètres). Alternativement, lyse le tissu à l’aide d’un pilon microtube ou un équipement équivalent et pipette de haut en bas sur la glace avec une seringue de 1 mL avec une aiguille de 18 G.
    2. Prendre 1/100e volume de mélange de lyse (L) (200 μL pour 20 mL de L), et ajouter le même volume de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et conserver à -20 °C pour une analyse plus approfondie.

4. Purification de la tubuline

  1. Lysate Clarification
    1. Effacer le lysate (séparation des granulés et fraction soluble du mélange de lyse) par centrifugation à 150 000 × g,4 °C, 30 min. Consultez tableau des matériaux pour plus de détails sur les rotors et les tubes d’ultracentrifugeuses. Pour les extraits cellulaires, une couche flottante blanche est souvent formée après centrifugation. Ne transférez pas cette couche flottante avec le supernatant, car elle interfère avec la polymérisation de la tubuline. Utilisez une seringue de volume approprié attachée à une longue aiguille de 20 G ou 21 G pour enlever délicatement le supernatant sans déranger la couche flottante. Si le supernatant est encore nuageux, centrifugeuse à 5 000 × g,4 °C pendant 10 min.
    2. Transférer le supernatant (SN1) dans un tube d’ultracentrifugeuse et noter son volume. Pour une pastille cellulaire de 10 mL, attendez-vous à un volume d’environ 12 mL pour SN1.
    3. Prenez 1/100e de volume de SN1 (120 μL pour 12 mL de SN1), et ajoutez le même volume de tampon Laemmli 2x, faites bouillir pendant 5 min et conservez-les à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
    4. Resuspendez la pastille (P1) dans BRB80 (Tableau des matériaux) en utilisant le même volume que SN1. Prenez 1/100e de volume de P1 (200 μL pour 20 mL de P1), et ajoutez le même volume de tampon Laemmli 2x, faites bouillir pendant 5 min et stockez à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
  2. Première polymérisation dans le tampon à faible molarité
    1. Préparer le mélange de polymérisation en combinant 1 volume de SN1 (12 mL), 1/200e volume de 0,2 M GTP (60 μL; concentration finale de 1 mM) et 0,5 volume de glycérol préchauffé (6 mL) dans un tube à bouchon à vis du volume approprié.
      REMARQUE : Le glycérol est utilisé comme agent d’encombrement dans les étapes de polymérisation tout au long du protocole et n’est donc pas pris en compte dans les calculs des concentrations d’autres composants.
    2. Pipette le mélange de haut en bas, en évitant doucement la formation de bulles d’air et de le transférer dans les tubes d’ultracentrifugeuse appropriés.
      REMARQUE : Lors du transfert du mélange sur les tubes, ajustez le poids des tubes (par paires). Cela permet à l’expérimentateur de procéder directement à la sédimentation des microtubules après l’étape de polymérisation. Faites ceci pour toutes les étapes de polymérisation tout au long du protocole.
    3. Couvrir les tubes de parafilm, transférer dans un bain d’eau à 30 °C et incuber pendant 20 min.
    4. Centrifugeuse les tubes à 150 000 × g, 30 °C pendant 30 min. Retirer le supernatant (SN2) et conserver la pastille de microtubules polymérisés (P2).
      REMARQUE : Les granulés de microtubules peuvent être congelés et stockés à -80 °C jusqu’à 1 an.
    5. Prenez 1/200e volume de SN2 (90 μL pour 18 mL SN2) et ajoutez le même volume de tampon Laemmli 2x, faites bouillir pendant 5 min et stockez à -20 °C pour une analyse plus approfondie.
  3. Première dénolysation
    1. Dépolymerize microtubules en ajoutant brb80 glacé à la pastille P2, et laisser sur la glace pendant 5 min: pour la tubuline des cellules, ajouter 1/60e (200 μL), et pour la tubuline du cerveau, ajouter 1/20e (600 μL) du volume de la SN1.
      REMARQUE : Le volume de BRB80 glacé ajouté à la pastille pendant les étapes de dénolysation est toujours par rapport au volume de SN1.
    2. Resuspendez doucement la pastille de microtubule, en évitant les bulles d’air, jusqu’à ce que la solution soit complètement homogène. Utilisez une pointe p1000 pour quelques cycles de pipetage suivis d’une pointe p200 toutes les 5 minutes, pendant 20 min (cinq cycles de pipetage). Il s’agit d’une étape cruciale pour le succès de la purification de la tubuline.
    3. Transférer la solution dans des tubes d’ultracentrifugeuse appropriés et faire tourner à 150 000 × g,4 °C pendant 20 min. Transférer le SN3 dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse de 1,5 mL. La pastille formée après cette étape de centrifugation (P3) contient des protéines précipitées (protéines associées aux microtubules ou MAP) et des microtubules non dépolymérisés. Le supernatant (SN3) contient des composants solubles : des dimers de tubuline dépolymérisés et des MAPs, qui se sont détachés des microtubules dépolymérisés.
    4. Prendre 1-4 μL de SN3, et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
    5. Resuspendez le granulé P3 en BRB80 (dans le même volume de SN3), prenez 1-4 μL, et ajoutez 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faites bouillir pendant 5 min et stockez à -20 °C.
  4. Deuxième polymérisation (en tampon à haute molarité)
    1. Préparer le mélange de polymérisation en combinant 1 volume de SN3 (200 μL), 1 volume de PIPES préchauffés de 1 M (200 μL, concentration finale 0,5 M), 1/100e volume de 0,2 M GTP (2 μL, concentration finale de 1 mM) et 1 volume de glycérol préchauffé (200 μL) dans un tube du volume approprié.
    2. Pipette le mélange de haut en bas, en évitant la formation de bulles d’air, et le transférer dans des tubes d’ultracentrifugeuse.
    3. Couvrir les tubes de parafilm, les transférer dans un bain d’eau à 30 °C et incuber pendant 20 min.
    4. Centrifugeuse les tubes à 150.000 × g, 30 °C pendant 30 min. Retirer le supernatant (SN4) et conserver la pastille de microtubules polymérisés (P4). La pastille P4 contient les microtubules polymérisés, et le Supernatant SN4 contient de la tubuline non dominumée, des MAP et d’autres protéines solubles.
      REMARQUE : La pastille de microtubule après la deuxième étape de polymérisation peut être congelée et stockée à -80 °C jusqu’à 1 an.
    5. Prendre 1-4 μL et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
  5. Deuxième dénolysation
    1. Dépolymerize microtubules en ajoutant brb80 glacé à la pastille P4, et laisser sur la glace pendant 5 min: pour la tubuline des cellules, ajouter 1/100e (120 μL), et pour la tubuline du cerveau, ajouter 1/40e (300 μL) du volume de la SN1.
    2. Pipette de haut en bas avec une pointe p200 toutes les 5 minutes, pendant 20 min (cinq cycles de pipetage).
    3. Transférer la solution dans un tube d’ultracentrifugeuse de 1,5 mL et faire tourner à 150 000 × g,4 °C pendant 20 min. Transférer le SN5 dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse de 1,5 mL. La pastille formée après cette étape de centrifugation (P5) contient des microtubules non dépolymérisés. Le supernatant (SN5) contient la tubuline soluble.
    4. Prendre 1-4 μL et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
    5. Resuspendez le granulé P5 en BRB80 (même volume de SN5), prenez 1-4 μL, et ajoutez 9 volumes de tampon 2x Laemmli, faites bouillir pendant 5 min et stockez à -20 °C pour d’autres analyses.
  6. Troisième polymérisation (en tampon à faible molarité)
    1. Préparer le mélange de polymérisation : 1 volume de SN5 (120 μL), 1/200th volume de 0,2 M GTP (0,6 μL, concentration finale est de 1 mM) et 0,5 volume de glycérol préchauffé (60 μL) dans un tube du volume approprié.
    2. Pipette le mélange de haut en bas, en évitant doucement la formation de bulles d’air, et le transférer dans les tubes d’ultracentrifugeuse appropriés.
    3. Couvrir les tubes de parafilm, les transférer dans un bain d’eau à 30 °C et incuber pendant 20 min.
    4. Centrifugeuse les tubes à 150.000 × g, 30 °C pendant 30 min. La pastille (P6) contient des microtubules polymérisés et le supernatant SN6 contient de petites quantités de tubuline non polymérisée.
      REMARQUE : Les granulés de microtubule peuvent être congelés et stockés à -80 °C jusqu’à 1 an.
    5. Prendre 1-4 μL et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
  7. Troisième dénolysation
    1. Dépolymerize microtubules en ajoutant brb80 glacé à la pastille P6, et laisser sur la glace pendant 5 min: pour la tubuline des cellules, ajouter 1/100e (120 μL), et pour la tubuline du cerveau, ajouter 1/40e (300 μL) du volume de la SN1.
    2. Pipette de haut en bas avec une pointe p200 toutes les 5 minutes, pendant 20 min (cinq cycles de pipetage).
    3. Transférer la solution dans les tubes d’ultracentrifugeuses appropriés et faire tourner à 150 000 × g,4 °C pendant 20 min. Transférer le SN7 dans un nouveau tube d’ultracentrifugeuse de 1,5 mL. La pastille (P7) contient de petites quantités de microtubules non dénolysés. Le supernatant (SN7) contient exclusivement des microtubules dépolymérisés (tubuline soluble).
    4. Prendre 1-4 μL et ajouter 9 volumes de tampon Laemmli 2x, faire bouillir pendant 5 min, et stocker à -20 °C pour d’autres analyses.
    5. Resuspendez le granulé P7 dans BRB80 (même volume de SN7), prenez 1-4 μL, et ajoutez 9 volumes de tampon 2x Laemmli, faites bouillir pendant 5 min, et stockez à -20 °C pour d’autres analyses.
    6. Quantifier la quantité de tubuline (voir Résultats représentatifs)et aliquot SN7 en petits volumes, casser-congeler, et stocker à -80 °C.

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Representative Results

L’objectif principal de cette méthode est de produire une tubuline de haute qualité et compétente en assemblage en quantités suffisantes pour effectuer des expériences in vitro répétées avec les composants purifiés. Les microtubules assemblés à partir de cette tubuline peuvent être utilisés dans des essais de reconstitution basés sur la technique de microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRF) avec des microtubules dynamiques ou stables, dans des expériences testant la dynamique des microtubules, les interactions avec les MAP ou les moteurs moléculaires, et la génération de force par les moteurs25. Ils peuvent également être utilisés dans les analyses de co-pelletage microtubule-MAP et la spectroscopie NMR à l’étatsolide 28.

L’enrichissement et la pureté de la tubuline tout au long du processus de purification peuvent être surveillés à l’aide d’un gel électrophoresis gel SDS-polyacrylamide (PAGE) taché de Coomassie, de préférence les gels SDS-PAGE « TUB », qui permettent la séparation des α et des β-tubulins, qui co-migrent en une seule bande dans les gelsclassiques 32. Les lysates recueillis à différentes étapes (à l’exception de la toute dernière dénolysation, voir protocole) sont chargés sur le gel en quantités comparables pour évaluer le succès de la purification de la tubuline (figure 2A)24. L’échantillon final de la tubuline, très précieux, n’est chargé que sur le gel pour déterminer la concentration de tubuline. Il est normal de perdre un peu de tubuline dans le processus de cycles répétés de polymérisation et de dpolymérisation. Un rendement inférieur aux attentes de la tubuline purifiée finale peut être dû à l’une ou l’autre (i) dépolymérisation incomplète des microtubules, visualisé par la présence d’une quantité importante de tubuline en fractions P3, P5 et P7, ou (ii) une polymérisation inefficace de la tubuline en microtubules, auquel cas une plus faible quantité de tubuline est présente en fractions P2, P4 et P6 et plus en fractions SN2, SN4 et SN6 (figure 2B). Si la tubuline est perdue pendant les étapes de polymérisation (quantités inférieures de P2 et P4) (i) assurer une concentration suffisante de tubuline pendant la polymérisation (ii) utiliser un aliquot frais de GTP, et /ou (iii) confirmer à nouveau la température de la réaction de polymérisation. Si la tubuline est perdue pendant les étapes de dénolysation (quantités inférieures de SN3 et de SN5), augmentez le temps ainsi que le pipetage du mélange sur la glace.

Pour la quantification de la tubuline purifiée, exécutez les échantillons avec les quantités connues d’albumine de sérum bovin (BSA, 0,5 μg – 1 μg – 2 μg – 4 μg) (Figure 3A) sur SDS-PAGE. Les gels sont tachés de bleu brillant Coomassie, numérisés, et les intensités des bandes bsa et tubuline sont mesurées par densitométrie quantitative (figure 3B) tel que décrit à https://openwetware.org/wiki/Protein_Quantification_Using_ImageJ. Veuillez noter que la même analyse peut être effectuée aux Fidji, une version améliorée d’ImageJ33. Les valeurs des bandes BSA ont été utilisées pour déterminer l’équation linéaire de régression, qui a été utilisée pour calculer la quantité de protéines dans les bandes de tubulines. Seules les intensités de la bande de tubuline dans la plage de la courbe BSA sont utilisées pour déterminer la concentration de tubulines. Sur la base de la concentration calculée de tubulines, des aliquots des volumes souhaités de tubuline sont préparés, congelés dans de l’azote liquide et stockés à -80 °C. Nous obtenons habituellement environ ~2 mg de tubuline de quatre bouteilles de spinner des cultures de suspension hela S3 (~15 g de cellules), ~250 μg de tubuline de dix plats de 15 cm de diamètre (~1.2 g de cellules), et ~1 mg de tubuline de 1 g de tissu cérébral de souris.

Pour confirmer l’enrichissement d’un isotype ou d’une modification particulier de la tubuline, ~0,1 μg de la tubuline purifiée peut être immunoblotted à l’aide d’anticorps respectifs34,35. La tubuline de commande variera selon la tubuline d’intérêt. Pour la tubuline modifiée in vitro avec une enzyme modificateur, utilisez la tubuline non traitée comme commande. Pour la tubuline modifiée en cellulo par la surexpression d’une enzyme modificateur, utilisez de la tubuline purifiée à partir de cellules qui n’expriment pas l’enzyme comme contrôle (Figure 4A). La tubuline de contrôle pour la tubuline purifiée à partir de cerveaux de souris knock-out sera la tubuline de souris sauvages (figure 4B). Dans toutes les analyses d’immunoblot, une charge égale de tubuline est vérifiée à l’aide d’un anticorps anti-α-tubulin indépendant du PTM (12G10).

Figure 1
Figure 1 : Purification de la tubuline à partir de différentes sources à l’aide de cycles de polymérisation et de dénolysation. (A) Différentes sources de tubuline sont lysées en utilisant des stratégies spécifiques. Les cellules HeLa S3 cultivés en suspension sont lysées à l’aide d’Français presse; Les cellules HEK-293 sont lysées par pipetting répétitif. Les cellules adhérentes ont été lysées à l’aide de courtes impulsions de sonication et de tissu cérébral de souris à l’aide d’un homogénéiseur tissulaire. (B) Représentation schématique des étapes successives du protocole de purification de la tubuline à l’aide de cycles de dépolymérisation à froid et de polymérisation chaude. Après la lyse et la clarification de lysate, les microtubules sont polymérisés et granulés. Les microtubules sont ensuite dépolymérisés et par la suite autorisés à polymériser dans un tampon à haute molarité, empêchant la co-sédimentation des protéines associées aux microtubules (MAP) avec les microtubules. Les microtubules sans MAP sont ensuite dépolymérisés et peuvent être soumis à un troisième cycle de polymérisation-démlymerisation pour éliminer les traces du tampon à haute densité. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Évaluer le succès de la purification de la tubuline. Les échantillons prélevés à différentes étapes du protocole de purification de la tubuline ont été exécutés sur un gel gel gel dodecylsulfate-polyacrylamide de sodium « TUB » (SDS-PAGE) (voir protocole pour plus de détails) et tachés de bleu brillant Coomassie. (A) Dans une purification réussie de la tubuline, α- et β-tubulines sont progressivement enrichis tout au long du processus. Après la deuxième polymérisation, la pastille de microtubule (P4) est pratiquement exempte de contamination par d’autres protéines ou protéines associées aux microtubules (MAP). Notez qu’il est normal de perdre un peu de tubuline pendant la procédure. (B) Dans une purification infructueuse de la tubuline, le rendement final de la tubuline est faible, et la tubuline reste soit dans la pastille après la dpolymérisation, soit dans le supernatant après polymérisation (boîtes rouges). Dans l’exemple montré ici, la tubuline n’a pas polymérisé efficacement dans les deux étapes de polymérisation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Quantification de la tubuline purifiée à l’aide de gels et densitométrie de gel de sodium dodecylsulfate-polyacrylamide tachés de Coomassie (SDS-PAGE). (A) Gel SDS-PAGE taché de coomassie avec des quantités connues d’albumine de sérum bovin (BSA; 0,5, 1, 2 et 4 μg, ligne de gradient gris) et différents volumes (0,5 et 1 μL, couleurs claires et foncées, respectivement) de tubuline purifiée. Dans l’exemple montré, la tubuline tyrosinée (baignoire HeLa S3, orange clair et foncé) et la tubuline détyrosinée (baignoire HeLa S3 traitée avec de la carboxypeptidase A, bleu clair et foncé) ont été chargées sur le gel. ( B )Lesbandes BSA de (A) ont été quantifiées à l’aide d’ImageJ (dans des unités arbitraires, UA) et tracées contre la quantité de protéines chargées (points gris à noirs). Ces points ont été utilisés pour calculer la ligne de régression linéaire (la ligne de gradient gris) et l’équation, qui ont été utilisées pour calculer les quantités de protéines dans les échantillons de tubulines (points orange clair et orange foncé et bleu) chargés sur le gel. Cela a facilité le calcul de la concentration des échantillons de tubuline. Notez que les points qui se trouvent au-delà de la courbe standard BSA ne doivent pas être utilisés pour déterminer la concentration (points orange foncé et points bleus). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Analyse immunoblot de la tubuline purifiée avec différents MNP. (A) Tubulins purifiés à partir de cellules HEK-293: type sauvage, ou cellules surexprimant TTLL5 ou TTLL7 ont été analysés pour l’enrichissement spécifique de la polyglutamylation à l’aide de l’anticorps GT335. Tandis que la surexpression de TTLL5 augmente la polyglutamylation sur α- et β-tubulin, la surexpression de TTLL7 enrichit spécifiquement la β-tubuline. (B) Tubulin purifié à partir de tissus cérébraux de type sauvage et ttll1-/- des souris ont été analysées pour des modèles de glutamylation. Notez la forte réduction de la polyglutamylation de la tubuline de ttll1-/- souris, qui n’ont pas la glutamylase cérébrale majeure TTLL136. Des gels « TUB » ont été utilisés pour séparer α- et β-tubuline. Une quantité égale de charge de tubuline a été confirmée par 12G10, un anticorps anti-α-tubuline. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

La méthode décrite ici fournit une plate-forme pour générer rapidement des tubulines de haute qualité et compétentes en assemblage en quantités moyennes-grandes à partir de lignées cellulaires et de cerveaux de souris simples. Il est basé sur le protocole d’étalon-or de purification de la tubuline à partir de cerveaux bovins utilisés sur le terraindepuis de nombreuses années 16,17. Un avantage particulier de l’approche est l’utilisation de cultures de suspension des cellules HeLa S3, qui, une fois établies, donne de grandes quantités de cellules tout en nécessitant peu de temps pratique. Cela rend le protocole relativement facile à effectuer dans n’importe quel laboratoire de biologie cellulaire, tandis que d’autres méthodes de purification de la tubuline18,19,32,37 nécessitent un équipement et une expertise spécifiques et sont donc principalement utilisés par les laboratoires ayant une solide expérience dans la purification des protéines. Lors de la production de plus petites quantités de tubuline à partir de lignées cellulaires adhérentes, une variété de lignées cellulaires peuvent être utilisées. Nous avons réussi à purifier la tubuline des cellules HeLa, U-2 OS et HEK-293. Si une purification à plus grande échelle est nécessaire, les cellules ou les cerveaux récoltés peuvent être congelés en tampon de lyse et stockés à -80 °C, et plusieurs granulés cellulaires ou cerveaux peuvent être mis en commun pour purifier de plus grandes quantités de tubuline.

La tubuline purifiée à partir des lignées cellulaires est pratiquement exempte de MNP tubulaires. Cette tyr-tubuline peut facilement être convertie en tubuline détyrosinée (deTyr-) en une seule étape simple25. Pour produire de la tubuline avec d’autres MNP, des enzymes spécifiques modificateurs de la tubuline peuvent être surexprimées dans les cellules avant la purification de la tubuline. En outre, l’utilisation de lignées cellulaires d’origine humaine comme source de matière aide à éviter les problèmes inter-espèces potentiels lors de l’étude des interactions entre les microtubules et les POP humains. De plus, la tubuline provenant de cellules non transformées (comme HEK293) ou transformées (comme HeLa) peut fournir des informations sur les effets des médicaments dirigés par microtubules (p. ex., les taxanes) sur les microtubules normaux par rapport aux microtubules tumoraux.

Enfin, notre protocole facilite la purification de la tubuline à partir de cerveaux de souris simples. Comme un nombre croissant de modèles murin de mutations et de modifications de la tubuline sont générés, ce protocole permet une analyse directe des propriétés et des interactions des microtubules avec la composition altérée de l’isotype de la tubuline38,39,40 ou tubuline PTMs31,41.

L’approche est basée sur des cycles de polymérisation et de dpolymérisation. Ainsi, des isotypes ou des tubulines spécifiques contenant des MNP particuliers qui affectent les propriétés d’assemblage et de démontage des microtubules pourraient entraîner une perte ou une réduction disproportionnée de ces formes de tubuline pendant le processus de purification. Néanmoins, nous avons montré que les MNP tubulines majeurs, tels que l’acétylation, la détyrosination, la glutamylation et la glycylation, sont conservés sur les microtubules tout au long du processus de purification de la tubuline24. Toutefois, il convient de noter que pour les analyses quantitatives de la composition de la tubuline dans les cellules ou les tissus, l’approche de purification de la tubuline à base de colonne TOG est plus appropriée car elle permettrait une purification impartiale et indépendante de la polymérisation18. Malgré sa limitation, notre protocole offre un grand avantage en générant de grandes quantités de tubuline de haute qualité qui peuvent être utilisées dans des expériences méticuleuses de reconstitution in vitro. En particulier, il facilite l’utilisation de la tubuline cérébrale riche en PTM dans les expériences de routine.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par l’ANR-10-IDEX-0001-02, le LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 et l’Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ est soutenu par l’Institut Curie, l’Agence nationale de la recherche du Français (ANR) décerne l’ANR-12-BSV2-0007 et l’ANR-17-CE13-0021, la subvention de l’Institut national du cancer (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1, et la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) accorde à DEQ20170336756. MMM est soutenu par la Subvention Fondation Vaincre Alzheimer FR-16055p, et par la Subvention France Alzheimer AAP SM 2019 n°2023. Jas a été soutenu par le programme horizon 2020 de recherche et d’innovation de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 675737, et la subvention FDT201904008210. SB a été soutenu par la subvention frm FDT201805005465.

Nous remercions tous les membres du laboratoire Janke, en particulier J. Souphron, ainsi que G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) et A. Gautreau (Ecole Polytechnique) pour leur aide lors de l’établissement du protocole. Nous tenons à remercier l’établissement animalier de l’Institut Curie pour son aide à l’élevage et aux soins de la souris.

L’anticorps 12G10, développé par J. Frankel et M. Nelson, a été obtenu de la Developmental Studies Hybridoma Bank développée sous les auspices du NICHD et maintenue par l’Université de l’Iowa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M MgCl2  Sigma #M1028
1-L cell culture vessels Techne F7610  Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells.
1.5- and 2-ml tubes
14-ml round-bottom tubes
15-cm-diameter sterile culture dishes
15-ml screw-cap tubes
2-mercaptoethanol  Sigma  #M3148 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood.
4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride  Sigma  #A8456
40% Acrylamide  Bio-Rad  #161-0140
5-, 10- 20-ml syringes
5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes
50-ml screw-cap tubes
Ammonium persulfate (APS) Sigma #A3678
Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10  Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa dilution: 1/500
Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335  AdipoGen  #AG-20B-0020 dilution: 1/20,000
Aprotinin  Sigma  #A1153
Balance (0.1 – 10 g)
Beckman 1-l polypropylene bottles  For collecting spinner cultures
Beckman Avanti J-26 XP centrifuge For collecting spinner cultures
Biological stirrer  Techne MCS-104L  Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells
Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide  Bio-Rad  #161-0201
Blender IKA Ultra-Turrax®  For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma  #A7906
Bromophenol blue  Sigma  #1.08122
Carboxypeptidase A (CPA) Sigma #C9268 Concentration: 1.7 U/µl
Cell culture hood
Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  Sigma  #D8418 DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection.
DMEM medium  Life Technologies  #41965062
DTT, DL-Dithiothreitol  Sigma  #D9779
EDTA Euromedex #EU0007-C
EGTA Sigma  #E3889
Ethanol absolute  Fisher Chemical  #E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS) Sigma  #F7524
French pressure cell press  Thermo electron corporation  #FA-078A with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber).
Glycerol  VWR Chemicals  #24388.295
Glycine Sigma #G8898
GTP  Sigma  #G8877
Heating block  Stuart  #SBH130D
Hela cells  ATCC® CCL-2™
Hela S3 cells  ATCC ATCC® CCL-2.2™
Hydrochloric acid (HCl ) VWR #20252.290
Inverted microscope  With fluorescence if cell transfection is to be verified
Isopropanol  VWR  #20842.298
jetPEI Polyplus  #101
JLA-8.1000 rotor  For collecting spinner cultures
KOH  Sigma  #P1767 KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection.
L-Glutamine  Life Technologies  #25030123
Laboratory centrifuge for 50-ml tubes Sigma 4-16 K 
Leupeptin  Sigma #L2884
Liquid nitrogen 
Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips
Micropestles Eppendorf #0030 120.973
Mouse brain tissue  Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines.
Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm Terumo #18G
Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm Terumo #20G
Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm B.Braun #466 5643
Parafilm
PBS  Life Technologies  #14190169
Penicillin-Streptomycin  Life Technologies  #15140130
pH-meter
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma  #P7626 PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions.
PIPES  Sigma  #P6757
Pipette-boy
Rotors Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55
SDS-PAGE electrophoresis equipment  Bio-Rad  #1658001FC
SDS, Sodium dodecyl sulphate  VWR  #442444H For preparing Laemmeli buffer 
SDS, Sodium dodecyl sulphate  Sigma  #L5750 For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels
Sonicator  Branson #101-148-070 Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used.
Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes Eppendorf 5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine  Sigma #9281
Trichostatin A (TSA) Sigma #T8552
Triton X-100  Sigma  #T9284
Trizma base (Tris) Sigma  #T1503
Trypsin  Life Technologies #15090046
Ultracentrifuge rotors  TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Ultracentrifuge tubes  Beckman #357448  for using with TLA-55 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #349622 for using with TLA-100.3 rotor
Ultracentrifuge tubes  Beckman #355631  for using with 70.1 Ti rotor
Ultracentrifuges Beckman Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment 
Vortex mixer
Water bath equipped with floaters or tube holders Set at 30°C 

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References

  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
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Biochimie numéro 165 Microtubules reconstitution in vitro tubuline purification de la tubuline polymérisation dynamique des microtubules code tubulin isotypes de tubuline culture de suspension modifications posttranslationnelles de la tubuline
Purification de la tubuline avec modifications posttranslationnelles contrôlées et isotypes à partir de sources limitées par des cycles de polymérisation et de dépolymérisation
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Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles. J. Vis. Exp. (165), e61826, doi:10.3791/61826 (2020).

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