Summary
Protokollen har til formål at indføre brugen af et tredobbelt firdobbelt massespektrometer til multireaktionsovervågning (MRM) af proteiner fra kliniske prøver. Vi har leveret en systematisk arbejdsgang fra prøveforberedelse til dataanalyse for kliniske prøver med alle de nødvendige forholdsregler, der skal træffes.
Abstract
Den proteomic analyse af det menneskelige hjernevæv i løbet af det sidste årti har i høj grad forbedret vores forståelse af hjernen. Men hjernerelaterede lidelser fortsætter med at være en stor bidragyder af dødsfald rundt om i verden, hvilket kræver behovet for endnu større forståelse af deres patobiologi. Traditionelle antistofbaserede teknikker som vestlig blotting eller immunohistochemistry lider af at være lav gennemstrømning ud over at være arbejdskrævende og kvalitativ eller semi-kvantitativ. Selv konventionelle massespektrometri-baserede shotgun tilgange undlader at give afgørende beviser til støtte for en vis hypotese. Målrettede proteomics tilgange er stort set hypotese drevet og adskiller sig fra de konventionelle shotgun proteomics tilgange, der har været længe i brug. Flere reaktionsovervågning er en sådan målrettet tilgang, der kræver brug af et specielt massespektrometer kaldet tandem firedobbelt massespektrometer eller tredobbelt firdobbelt massespektrometer. I den aktuelle undersøgelse har vi systematisk fremhævet de vigtigste skridt, der er involveret i at udføre en vellykket tandem firedobbelt massespektrometri-baseret proteomics workflow ved hjælp af humant hjernevæv med det formål at introducere denne arbejdsgang til et bredere forskningsmiljø.
Introduction
I løbet af det sidste årti har den hurtige udvikling inden for massespektrometri (MS) kombineret med øget forståelse af kromatografiteknikker i høj grad bidraget til at fremme MS-baserede proteomik. Molekylærbiologi-baserede teknikker såsom vestlige blotting og immunohistochemistry har længe lidt af reproducerbarhed spørgsmål, langsom ekspeditionstid, inter-observatør variation og deres manglende evne til præcist at kvantificere proteiner, for at nævne nogle få. Til dette formål fortsætter den overlegne følsomhed af højoverførselsproteomics tilgange med at tilbyde molekylærbiologer et alternativt og mere pålideligt værktøj i deres søgen efter bedre at forstå proteinernes roller i celler. Men shotgun proteomics tilgange (Data afhængige Acquisition eller DDA) ofte undlader at opdage lav rigelige proteiner i komplekse væv ud over at være stærkt afhængige af følsomhed og opløsning af instrumentet. I løbet af de sidste par år har laboratorier rundt om i verden udviklet teknikker som Data Independent Acquisition (DIA), der kræver øget computerkraft og pålidelig software, der kan håndtere disse meget komplekse datasæt. Disse teknikker er dog stadig et igangværende arbejde og ikke særlig brugervenlige. Målrettede MS-baserede proteomics tilgange giver en perfekt balance mellem den høje gennemstrømning karakter af MS tilgange og følsomheden af molekylærbiologi tilgange som ELISA. Et målrettet massespektrometribaseret proteomics-eksperiment fokuserer på at detektere hypotesedrevne proteiner eller peptider fra opdagelsesbaserede shotgun proteomics-eksperimenter eller gennem tilgængelig litteratur1,2. Multiple Reaction Monitoring (MRM) er en sådan målrettet MS-tilgang, der bruger et tandem firedobbelt massespektrometer til nøjagtig detektion og kvantificering af proteiner / peptider fra komplekse prøver. Teknikken giver højere følsomhed og specificitet på trods af, at det kræver brug af et instrument med lav opløsning.
En quadrupole er lavet af 4 parallelle stænger, med hver stang forbundet til diagonalt modsatte stang. Et svingende felt skabes mellem de firedobbelte stænger ved at anvende vekslende RF- og DC-spændinger. Ionernes bane inde i quadrupole påvirkes af tilstedeværelsen af de samme spændinger på tværs af modsatte stænger. Ved at anvende RF til DC spænding, kan bane af ioner stabiliseres. Det er denne egenskab af quadrupole, der gør det muligt at bruge det som en masse filter, som selektivt kan lade specifikke ioner til at passere igennem. Afhængigt af behovet kan en firdoblet betjenes i enten statisk tilstand eller scanningstilstand. Den statiske tilstand tillader kun ioner med en bestemt m/ z at passere igennem, hvilket gør tilstanden meget selektiv og specifik for interessen. Scanningstilstanden på den anden side gør det muligt for ioner på tværs af hele m/ z-området at passere igennem. Således kan tandem firdobbelen massespektrometre fungere på 4 mulige måder: i) den første firdobbelige drift i statisk tilstand, mens den anden opererer i scanningstilstand; ii) den første firdobbeler, der kører i scanningstilstand, mens den anden arbejder i statisk tilstand iii) begge quadrupoles, der opererer i scanningstilstand; og iv) begge quadrupoles, der opererer i statisk tilstand3. I et typisk MRM-eksperiment opererer begge quadrupoler i statisk tilstand, så specifikke prækursorer og deres resulterende produkter efter fragmentering kan overvåges. Dette gør teknikken meget følsom og selektiv, hvilket giver mulighed for nøjagtig kvantificering.
For molekylærbiologer er det menneskelige hjernevæv og dets celler en guldgrube. Disse bemærkelsesværdige enheder af et stadigt interessant organ i den menneskelige krop kan give molekylær og cellulær indsigt i dens funktion. Proteomic undersøgelser af hjernevævet kan ikke kun hjælpe os med at forstå den systemiske funktion af en sund hjerne, men også de cellulære veje, der bliver dysreguleret, når de påføres af en vis sygdom4. Hjernevævet med al dets heterogenitet er imidlertid et meget komplekst organ at analysere og kræver en samordnet tilgang til en bedre forståelse af ændringerne på molekylært niveau. Følgende arbejde beskriver hele arbejdsgangen, der starter lige fra udvinding af proteiner fra hjernevæv, oprettelse og optimering af metoderne til MRM-analyse til validering af målene (Figur 1). Her har vi systematisk fremhævet de store skridt, der er involveret i et vellykket MRM-baseret eksperiment ved hjælp af menneskeligt hjernevæv med det formål at introducere teknikken og dens udfordringer til et bredere forskningsmiljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse omfatter hjernevævsprøver fra menneskelige deltagere, gennemgået og godkendt af TMH og IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Deltagerne gav deres informerede og skriftlige samtykke til at deltage i denne undersøgelse.
1 Proteinudvinding fra hjernevæv
- Der vejes ca. 50 mg hjernevæv, og vævet vaskes med 300 μL 1x fosfatbuffer saltvand (PBS) ved hjælp af en mikropipette.
BEMÆRK: Dette trin udføres for at fjerne blod på vævets ydre overflade og skal om nødvendigt gentages. Det er tilrådeligt at fjerne så meget blod fra væv som muligt, da det forstyrrer downstream protein skøn og forarbejdning. - Efter vask med PBS tilsættes 300 μL lysis buffer (Buffer A) til røret, der indeholder vævet. Buffer A indeholder 8 M urinstof, 50 mM Tris pH 8.0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2 og Protease-hæmmercocktail (i henhold til producentens anvisninger).
BEMÆRK: Proteinudbyttet varierer afhængigt af flere faktorer, der strækker sig fra de forhold, hvor prøverne opbevares, mængden af udgangsmateriale og effektiviteten af håndteringen af prøverne under behandlingen. Reducer mængden af buffer A proportionalt, når du arbejder med mængder væv under 50 mg. - Lys vævet ved hjælp af en sonde sonicator og samtidig holde røret på et isbad. Brug følgende parametre til sonikering: 40% amplitude, 5 sekunder til og fra cyklus i 2:30 min.
- Fortsæt med væv homogenisering ved hjælp af en perle tæppebanker til helt lyse vævet.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres ved medium hastighed i 90 sekunder efterfulgt af inkubation på is i 3-5 minutter. - Indholdet af røret centrifugeres ved 6.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Supernatanten overføres til et friskrør og blandes homogent.
BEMÆRK: Lav prøvens prøve og opbevar ved -80°C, indtil den anvendes yderligere.
2 Protein kvantificering og kvalitetskontrol
- Kvantificere prøverne før fordøjelsen ved hjælp af en standardgraf lavet med kendte koncentrationer af BSA.
BEMÆRK: Sørg for, at den analyse, der anvendes til proteinvurdering, er kompatibel med den buffer, der bruges til fremstilling af proteinlysat. Kontroller kvaliteten af protein lysatet ved at køre en SDS-PAGE gel.
3 Protein fordøjelse
- Der skal indtages 50 μg protein i et mikrocentrifugerør, og proteinerne reduceres ved at tilsætte Tris 2-carboxyethylphosphin (TCEP), således at den endelige koncentration er 20 mM. Indholdet inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Efter inkubationen alkylerer de reducerede proteiner ved at tilsætte iodoacetamid (IAA) til røret, således at dets endelige koncentration er 40 mM. Inkubat røret i mørke i 30 minutter.
BEMÆRK: Forbered IAS frisk lige før tilsætning til røret. - Buffer B til røret, der indeholder de reducerede og alkylerede proteiner, således at den endelige koncentration af urinstof i røret er mindre end 1 M.
BEMÆRK: Buffer B består af 25 mM Tris (pH 8.0) og 1 mM CaCl2 og bruges til fortynding af prøverne. Ved fortynding skal du sikre dig, at rørets indhold har en pH-kel på 8 for optimal protein fordøjelse efter tilsætning af trypsin. - Trypsin tilsættes i forholdet mellem 1:30 og proteinforholdet, og rørene inkuberes natten over ved 37 °C med konstant omrystning.
- Efter fordøjelsen skal det fordøjede produkt koncentreres i en vakuumkoncentrator. På dette trin kan peptider enten rekonstitueres og afsalteres eller opbevares ved -80 °C til fremtidig brug.
4 Afsaltning og peptid kvantificering
BEMÆRK: Afsaltning eller peptidoprydning er afgørende, før prøverne til LC-MS/MS. Salte og andre forurenende stoffer i prøven kan tilstoppe kolonnerne og også beskadige instrumentet. Processen kan udføres ved hjælp af kommercielt tilgængelige C18-trintip eller -kolonner.
- Trinspidsen aktiveres med 20 μL 50% acetonitrile (ACN) i 0,1% myresyre (FA). Centrifuge indholdet ved 1.000 x g i 1 minut og kassér strømmen igennem.
BEMÆRK: Betingelserne for centrifugering er de samme indtil procedurens afslutning. - Der tilsættes 20 μL på 100% ACN i 0,1% FA og centrifuge indholdet som i trin 4.1.
BEMÆRK: Aktiveringstrin kan gentages et par gange. - Efter aktiveringen passerer 20 μL rekonstitueret peptidprøve gennem trinspidsen og centrifuge som udført i trin 4.1.
BEMÆRK: Strømmen må ikke kasseres i dette trin. - Gentag trin 4.3 med gennemstrømningen mindst 5 gange for at sikre maksimal peptidbinding til scenespidsen.
- Der føres 20 μL 0,1 % FA gennem etapespidsen, og strømmen kasseres.
BEMÆRK: Gentag dette trin to gange mere for bedre resultater. - Elute de bundne peptider i et friskt mikrofugerør ved at passere stigende koncentrationer af ACN, dvs.
- Tør peptider i et vakuum koncentrator og fortsæt til peptid kvantificering.
- De tørrede peptider rekonstrueres i 0,1 % FA , og der kvantificeres ved hjælp af anvendelsesområdemetode5.
5 Overgangsliste udarbejdelse af endelige mål
BEMÆRK: En overgang henviser til par prækursorer (Q1) til produkt (Q3) m/ z værdier i en MRM eksperiment. En peptid kan have en til mange overgange med den samme Q1-værdi, men forskellige Q3-værdier. Et tredobbelt firdobbelt massespektrometer kræver oplysninger om overgangene for peptider og deres produkter, der skal påvises. Derfor skal der udarbejdes en overgangsliste, før du starter et målrettet eksperiment. Dette kan gøres ved hjælp af online-lageret af SRMAtlas6 (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) eller en open source-software kaldet Skyline7 (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).
- Download den seneste menneskelige proteome FASTA-fil fra UniProt (https://www.uniprot.org/), og opret en baggrundsproteomfil ved at indsætte den i Skyline. I peptidindstillinger skal du gå til rullelisten Baggrundsproteome og klikke på Tilføj feed i FASTA-sekvensfilen for det menneskelige proteom. Kontroller, at denne database er valgt, og at den tilladte mistede spaltningsværdi er angivet til 0, før du fortsætter til næste trin.
- Under fanen Filter i Peptide Settings afgrænser længden af accepterede peptider fra 8 til 25 aminosyrer.
- Under Fanen Filter under FanenFilter under Indstillinger for Ion-ion som 2,3 skal du angive Ion-gebyrer som 1 og angive Ion-typer til y. Produktioner kan vælges afhængigt af brugerens valg. Vælg N-terminal for at proline for specielle ioner og lade alle andre parametre være som standard.
BEMÆRK: Indstillingerne for peptid og overgang kan variere afhængigt af eksperimentet. - Indsæt peptider eller proteiner af interesse ved at klikke på Rediger og flytte til Indsæt. For at indsætte proteiner skal du kopiere deres tiltrædelses-id'er og indsætte specifikke peptider, kopiere peptidsekvenserne. Softwaren knytter tiltrædelses-id'erne til baggrundsproteomet, og overgangslisten oprettes baseret på peptid- og overgangsindstillingerne.
- Eksporter overgangslisten. Kontroller, at det rigtige instrument er markeret på rullelisten for Instrumenttype. I forbindelse med optimeringseksperimenter kan man vælge at opdele overgangslisterne i mindre tal ved at indstille det ønskede antal overgange pr. fil i Skyline. Dette vil sikre, at instrumentet ikke er overvældet til at screene for mange overgange i et enkelt løb. Antallet af overgange skal optimeres yderligere for at få en enkelt metode - dette nævner vi fremover under afsnittet om metodeforbedring.
6 LC-parametre
- Brug et binært opløsningsmiddelsystem med det vandige opløsningsmiddel, der indeholder 0,1% FA (Solvent A) og det organiske opløsningsmiddel, der indeholder 80% ACN (Opløsningsmiddel B).
- Indstil kolonnetemperaturen til 45 °C.
- Angiv en LC-hældning på 10 min. med en flowhastighed på 450 μL/min (som vist i tabel S1).
7 MS-parametre
BEMÆRK: Den forklarede analyse er udviklet og optimeret til TSQ Altis Triple Quadrupole Mass Spectrometer.
- Optimer kører parametre som Q1 og Q3 opløsning, dvæle tid og cyklus tid - en parameter ad gangen. Vi synes, at 0,7 opløsning for Q1 og Q3 fungerer bedst. Cyklustiden eller opholdstiden skal muligvis justeres i henhold til antallet af overgange og den gennemsnitlige topbredde af de peptider, der overvåges.
- Brug MS-parametrene i tabel S2 og tabel S3. Den samlede metodevarighed er 10 min.
BEMÆRK: Parametrene forbliver de samme for alle kørsler under og efter metodeforbedring, medmindre andet er nævnt. I forbindelse med et nyt eksperiment kan der være behov for at ændre visse parametre afhængigt af prøvens type og prøvebehandlingstrin.
8 Kør sekvens og Instrument QC
- Forbered en blanding af vand: methanol: isopropanol: acetonitrile i forholdet 1:1:1:1. Brug denne blanding som en tom.
- Forbered peptider til enhver standardprøve, der kan bruges til konsekvent at overvåge instrumentets ydeevne. Dette vil blive brugt som en QC-standard. Vi registrerer peptider fra BSA-digests, der er optimeret og giver god og ensartet respons over flere dage (Figur 2).
- For at køre prøver skal sekvensen starte med et par emner efterfulgt af QC-standarden og kliniske prøver. Sørg altid for, at der er en tom mellem to på hinanden følgende prøver.
- For at lette sammenligningen skal du sikre, at lige store mængder og mængder af hver prøve injiceres hver gang.
9 Metodejustering
- Analyser de foreløbige data fra de samlede prøver ved hjælp af Skyline. Se efter den rigtige top, overgange og parametre som topform og intensitet for at vælge de bedste resultater. Gem filen som et nyt Skyline-projekt.
- Brug et bibliotek til at finde den bedste matchende top, og derfor anbefales den bedst mulige overgangsliste. Et bibliotek er et sæt MS/MS-spidsbelastninger, der er tilgængelige fra litteratur eller interne eksperimenter.
- Eksporter en ny overgangsliste fra det nyligt gemte Skyline-projekt, og brug denne overgangsliste til at lave en ny metode. Anskaf data fra den nye metode, der er oprettet, og gentag processen med at finjustere overgangene ved hjælp af Skyline.
- Når listen over peptider og overgange er færdiggjort efter dataanalyse ved hjælp af Skyline, finjustere metoden ved at afprøve forskellige permutationer af cyklustid og opholdstid.
BEMÆRK: Brugen af tunge mærkede syntetiske peptider og indekserede retentionstid (iRT) peptider gør metodeforfinelse let8,9. Det er derfor tilrådeligt, at finjustering af metoden udføres ved hjælp af disse peptider. - Brug oplysningerne om opbevaringstid fra forbedringseksperimenterne til at oprette en endelig metode, der er planlagt (med et defineret anskaffelsesvindue).
- Forbered prøver til de enkelte forsøgspersoner. Der vil blive indhentet data for disse prøver ved hjælp af den endelige planlagte metode.
- Når dataene er indhentet, kan yderligere downstream-analyse og gruppemæssig sammenligning udføres ved at importere de rå filer til Skyline.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi udførte relativ kvantificering af 3 proteiner fra 10 prøver, 5 prøver fra hver gruppe af patienter med abnormiteter i hjernen. Disse proteiner omfattede Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) og Nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), som er kendt for at udføre forskellige roller i hjernecellerne. Post-run analyse af data blev udført ved hjælp af Skyline-daglige (Ver 20.2.1.286). I alt 10 peptider svarende til 3 proteiner blev overvåget. Disse omfattede 3 peptider for APOA-I, 4 peptider for VIM og 3 peptider for NAMPT. Det samlede antal overgange fra disse 10 peptider udgjorde 57. Prøverne blev grupperet i en af de to grupper afhængigt af den tilstand, de tilhørte. Ved hjælp af gruppesammenligningsfunktionen i skyline blev disse peptiders maksimale overflod sammenlignet, og relative kvantificeringsværdier blev beregnet (figur 3).
Figur 1: En oversigt over de trin, der er involveret i et eksperiment med overvågning af flere reaktioner. A. Det er ikke så lidt. Prøveforberedelse til et typisk proteomics-eksperiment involverer ekstraktion af proteiner (til illustration har vi vist vævsprøve) efterfulgt af fordøjelse ved hjælp af trypsin. De fordøjede peptider er i sidste ende afsaltet og gjort LC-MS klar. B. De skridt, der er involveret i et MRM-eksperiment, omfatter valg af prækursorer og produkter baseret på deres m/z-værdier. Kun de overgange, der viser god respons, kommer i betragtning til analyse. C. Dataanalysen i et MRM-eksperiment omfatter en detaljeret undersøgelse af topformer og spidsbelastningsområder. Dette efterfølges i sidste ende af en statistisk analyse af resultaterne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Konsistens som svar for BSA ved hjælp af en optimeret MRM-metode. A. Det er ikke så lidt. Kromatogram for en repræsentativ peptid af BSA viser ensartet topform og intensitet i løbet af de fem dage, eksperimentet blev udført. B. Retentionstidskonsistens observeret for peptid på alle de fem dage af eksperimentet C. Peak områder for peptid som set i løbet af fem dage i ugen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Differentialregulering af tre proteiner i to grupper af GBM-tumorprøver. A. Det er ikke så lidt. Repræsentative kromatogrammer for Apolipoprotein A-I og kumulativt topareal som vist efter sammenligning mellem grupper. B. Repræsentative kromatogrammer for Vimentin og kumulativt topareal som set efter sammenligning mellem grupper. C. Repræsentative kromatogrammer for Nicotinamidphoribosyltransferase og kumulativt topareal som set efter sammenligning mellem grupperne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel S1: Nærmere oplysninger om 10-minutters LC-hældning, der skal anvendes til alle prøver. Klik her for at hente denne tabel.
Tabel S2: Parameterindstillinger for ionkilden. Klik her for at hente denne tabel.
Tabel S3: Parameterindstillinger for MRM-metoden. Klik her for at hente denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikker som Immunohistochemistry og vestlig blotting blev betragtet som guldstandarder for validering af proteinmål i mange år. Disse metoder finder anvendelse selv i dag med mindre ændringer i protokollen og ringe afhængighed af teknologi, hvilket gør dem meget besværlige og kedelige. Derudover involverer de også brug af dyre antistoffer, som ikke altid viser den samme specificitet på tværs af partier og kræver stor ekspertise. Derudover har kun en lille brøkdel af proteiner, der er identificeret ved hjælp af højoverførselsteknikker som massespektrometri, kompatible antistoffer til rådighed, hvilket yderligere komplicerer hele proceduren. Derfor tages målrettede proteomiske analysemetoder langsomt op som den nye metode til validering af mål10. Med de fleste af de mål opdagelse sker på høj-throughput omics platforme, paneler af validerede mål er også under overvejelse for klinisk screening applikationer11,12,13.
De repræsentative resultater i denne artikel har valideret differentialudtrykket af proteiner Apolipoprotein A-I (APOA-I), Vimentin (VIM) og Nicotinamid phosphoribosyltransferase (NAMPT) under to forhold (betingelse 1 og tilstand 2) i hjernevævet. Apolipoprotein A-I er blevet rapporteret til at spille en central rolle i vedligeholdelsen af cerebrovaskulær integritet og reducere risikoen for Alzhiemers sygdom. Selvom ApoA-I ikke syntetiseres i hjernen, gør dens evne til at krydse blodhjernebarrieren (BBB) sin tilstedeværelse i hjernen vital14. Vimentinproteinet er blevet undersøgt i en række roller inde i hjernen. En af Vimentins vigtigste funktioner er imidlertid dets involvering i mikrogliaaktivering. Reduceret ekspression af Vimentin var forbundet med svækkelse af mikroglial aktivering15. Proteinet NAMPT er blevet rapporteret til at spille en central rolle i aldring relateret tab af neuroner og cerebral vaskulære endotel dysfunktioner16. Alle de tre proteiner er blevet rapporteret til at spille en lang række roller i normale hjerneceller og hjernerelaterede maligniteter. Derfor kan MRM-baseret validering for disse proteiner og deres peptider finde stor brug i klinisk diagnose relateret til forskellige hjernerelaterede lidelser.
En fuldt optimeret målrettet analyse kan nemt bruges til detektion af høj overførselshastighed og kvantificering af et målpanel. Det hastighedsbegrænsende trin er den indledende metodeoptimering, som er kedelig og varierer afhængigt af prøvetypen, protein/peptidmål, det anvendte instrument og detektionsbiasen for visse peptider. Det er afgørende, at overgangslisten er optimeret til en robust analyse. Enhver bruger interesseret i at udvikle en sådan analyse for humane hjernevæv prøver vil opdage, at ovenstående forklaret protokol minimerer disse variable faktorer. Den beskriver en optimeret protokol til peptidudtrækning fra denne unikke og kedelige vævsbiospecimen og optimale parametre, der skal anvendes i instrumentet med særlig vægt på afgørende kvalitetskontroltrin på forskellige punkter i protokollen. Som med enhver ny teknologi har forskerne leveret et sæt retningslinjer, som forfatterne skal fremlægge, eller hvilke trin de følger under eksperimentet. På denne front blev MCP's retningslinjer for rapportering af målrettede proteomics-assays og data i 2017 fastlagt17. Disse retningslinjer sikrer, at den rapporterede undersøgelse/analyse er pålidelig og reproducerbar, hvilket øger metodens anvendelighed. Ved at tage de rigtige forholdsregler og udnytte det sande potentiale i denne analyse, ville forskerne snart være i stand til at komme med klinisk relevante assays med enorme potentiale i diagnose og terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne modtog støtte fra Thermofisher til offentliggørelsesgebyret.
Acknowledgments
Vi anerkender MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projekt #34_IITB til SS og MASSFIITB Facility hos IIT Bombay støttet af Institut for Bioteknologi (BT/PR13114/INF/22/206/2015) til at udføre alle MS-relaterede eksperimenter.
Vi vil gerne rette en særlig tak til Mr. Rishabh Yadav for at lave og redigere hele videoen og Mr. Nishant Nerurkar for hans arbejde med at redigere lyden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC - Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Hosp, F., Mann, M. A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).
- Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry. , (1974).
- Kusebauch, U., et al. Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome. Cell. , (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).
- Escher, C., et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides. Proteomics. , (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).
- Whiteaker, J. R., et al. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma. Nature Biotechnology. , (2011).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).
- Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).
- Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity. Biochemistry. , (2001).
- Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. Journal of Neurochemistry. , (2012).
- Liu, L. Y., et al. Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases. PLoS ONE. , (2012).
- Abbatiello, S., et al. New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).
