Summary
Denne protokollen tar sikte på å decellularisere hjerte og lunger av mus. De resulterende ekstracellulære matrisen (ECM) stillaser kan immuniseres og avbildes for å kartlegge plasseringen og topologien til komponentene.
Abstract
Vi presenterer her en decellulariseringsprotokoll for musehjerte og lunger. Den produserer strukturelle ECM stillaser som kan brukes til å analysere ECM topologi og sammensetning. Den er basert på en mikrokirurgisk prosedyre designet for å kateterisere luftrøret og aorta av en euthanized mus for å parfyme hjertet og lungene med decellulariserende midler. Det decellulariserte kardiopulmonale komplekset kan deretter immuniseres for å avsløre plasseringen av strukturelle ECM-proteiner. Hele prosedyren kan fullføres om 4 dager.
ECM stillaser som følge av denne protokollen er fri for dimensjonale forvrengninger. Fraværet av celler muliggjør strukturell undersøkelse av ECM-strukturer ned til submikronoppløsning i 3D. Denne protokollen kan brukes på sunt og sykt vev fra mus så unge som 4 uker gamle, inkludert musemodeller av fibrose og kreft, og åpner veien for å bestemme ECM-ombygging forbundet med kardiopulmonal sykdom.
Introduction
ECM er et tredimensjonalt nettverk laget av proteiner og glykaner som rommer alle celler i en multicellulær organisme, noe som gir organer sin form og regulerer celleadferd gjennom livet1. Fra eggbefruktning og utover bygger og ombygger cellene ECM, og styres i sin tur strengt av den. Formålet med denne protokollen er å åpne en måte å analysere og kartlegge musen ECM, da mus er den mest brukte modellorganismen i pattedyr patofysiologi.
Utviklingen av denne metoden var drevet av behovet for å karakterisere og isolere metastase-assosiert innfødt ECM2. Ettersom svulster mangler riktig anatomisk vaskularisering og mus er relativt små organismer, ble mikrokirurgiske prosedyrer designet for å retrogradely kateterisere aorta, mens de isolerer sirkulasjonen av det store karet som fører til en svulst (f.eks. lungeårene), og dermed fokusere reagensstrømmen og tillate tumordecellularisering. Denne metoden produserer ECM stillaser med en bevart struktur2 som kan immuniseres og avbildes, slik at ECM strukturkartlegging i submikron detalj. For å utføre denne protokollen er det nødvendig å tilegne seg kirurgiske og mikrokirurgiske ferdigheter (disseksjon, mikrosuging og kateterisering) som kan representere en potensiell begrensning i bruken. Så vidt vi vet representerer denne metoden toppmoderne for opprinnelig ECM-strukturavbildningsanalyse2,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som inngår her er gjennomgått og godkjent av etikkkomiteen som regulerer eksperimentell medisin ved Københavns Universitet og er enige i dansk og europeisk lovgivning. For å demonstrere denne protokollen har vi brukt kvinnelige BALB/cJ-mus på 8-12 uker og en MMTV-PyMT kvinnelig mus på 11 uker.
MERK: Unngå bakteriell kontaminering av det decellulariserte ECM-stillaset gir det beste bildebehandlingsresultatet og tillater langsiktig prøvelagring. Det er derfor viktig å holde alle trinnene sterile. Som sådan må alle instrumenter og kirurgisk materiale, inkludert sutur, mikro-sutur, løsninger, rør, Luer-kontakter og katetre, være sterile. Overflater, inkludert en polystyrenbrett, må desinfiseres med 70% etanol, og perfusjonen bør fortrinnsvis utføres under en laminær strømningshette. Alle prosedyrer skjer ved romtemperatur med mindre annet er angitt.
1. Mikrokirurgi etter mortem
- Avlive musen ved hjelp av et CO2-kammer .
- Plasser musen i et 4 L kammer, og begynn å fylle med 100% CO2, som starter på 0,2 l / min i 2 minutter, og øker til den når en strøm på 0,8 l / min etter 3 minutter. Musen skal falle bevisstløs i løpet av de første 2 minutter, og deretter bør åndedrett opphøre (vanligvis rundt 5 min, men strømmen kan opprettholdes etter behov). Bekreft døden før du går videre til neste trinn.
- Barber thoraxen, magen og baksiden av musen med hårklipperen og desinfiser med 70% etanol. Barbering reduserer i stor grad antall artefakter på grunn av tilstedeværelsen av hår enten på prøver for avbildning eller biokjemisk analyse.
- Fest musen til en polystyrenbrett, som strekker for- og bakbenene, samt hodet og halen. Plasser den under mikroskopet for mikrokirurgi.
- Ved hjelp av en Mayo rett mønster saks etablere kirurgisk tilgang med et kutan snitt som går fra den submandibulære regionen til underlivet og dissekerer subkutant for å avsløre thoracic veggen og peritoneum.
- Bruk mikrokirurgisk saks, kutt pectoralis store og pectoralis mindre muskler langs det sjette intercostal rommet på begge sider av thoracic veggen.
- Bruk saks med rett mønster, kutt brystbenet langs de tidligere snittene, og fullfør deretter en sternotomi ved å kutte brystbenet langs sin lange akse, løft og fest begge sider av thoracic-veggen for å eksponere kardiopulmonalkomplekset.
- Ved hjelp av runde mikro-tang (eller Dumont mikro-tang), slukk thymus og omkringliggende fettvev ved å trekke dem delikat av vedleggene. Dette vil avsløre de store fartøyene.
- Bruk cautery, cauterize den synkende cava venen og, ved hjelp av rett mønster saks, kutte spiserøret.
- Ved hjelp av skarpe mikro-tang, skille brachiocephalic årer og brachiocephalic, venstre vanlig karotis og venstre subklave arterier fra det underliggende vevet for å lette ligasjon og cauterization.
- Ved hjelp av mikronålholder, skarpe mikro-tang og 9-0 sutur sted masker over fremveksten av brachiocephalic, venstre vanlig karotis og venstre subklavisiske arterier.
- Cauterize brachiocephalic årer.
- Skill submandibulære spyttkjertler langs midtlinjen for å eksponere nakkemuskulaturen og luftrøret. Skill musklene for å eksponere cricothyroid ligament. Bruk mikrosaks, åpne en inngang ved å seksjonere ligamentet.
- Introduser et 27 G kateter i luftrøret og skyv forsiktig til luftrøret forgrener seg inn i bronkiene (dvs. til motstanden mot kateteret er oppfylt, og trekk deretter 3 mm tilbake). Vær forsiktig så du ikke forstyrrer bronkiene. Bruk en 6-0 sutur, plasser 3 masker rundt luftrøret for å feste kateteret.
- Seksjon musen i høyden av den tolvte thoracic vertebra. Den synkende aorta går fremre til ryggraden og bør seksjoneres her sammen med ryggraden. Sett den nedre halvdelen fra hverandre.
- Retrogradt kateterisere aorta og skyv kateteret til det når aortabuen. Bruk 9-0 sutur, plasser 4 masker rundt aorta, som begynner 5 mm under kateterspissen.
2. Decellularisering
- Koble musen til et pumpesystem ved hjelp av silikonrør og Luer-kontakter. Perfuse med deionisert vann ved 200 μL/min i 15 min. Oppretthold denne strømningshastigheten under decellularisering.
- Endre perfusjonsmiddelet til 0,5% natriumdeoksykollat (DOC) fortynnet i deionisert vann og parfyme over natten.
- Endre perfusjonsmiddelet til 0,1% natrium dodecylsulfat (SDS) fortynnet i deionisert vann og parfyme i 8 timer.
- Perfuse med deionisert vann over natten for å vaske bort SDS og DOC i 24 timer.
- Resect de decellularized hjerte og lunger ved å seksjonere sine vedlegg til thorax ved hjelp av en buet saks og lagre i en steril kryo-rør med deionisert vann med 1% (v / v) penicillin-streptomycin og 0,3 μM natriumazid ved 4 ° C. ECM stillaser kan lagres i minst 12 uker1. Hvis stillaset skal brukes til biokjemisk analyse (f.eks. massespektrometri), må du fryse i flytende nitrogen.
3. Immunstaining
- Planlegg avbildningen: bestem primært antistoff (eller antistoffer) og kombinasjonen av fluorescerende konjugerte sekundære antistoffer for å matche hverandre og for å passe laserlinjene til fluorescensmikroskopet.
- Blokker prøven ved å fordype den i en kryotube som inneholder 6% (v / v) eselserum - 3% (m / v) bovint serumalbumin (BSA) over natten.
- Inkuber med primært antistoff (eller antistoffer) i 3% eselserum i PBS i 24 timer.
- Vask 5 ganger i 1 time hver gang i 0,05% tween 20 i PBS (PBST).
- Inkuber prøven med fluorescerende konjugert sekundært antistoff (eller antistoffer) i 3% eselserum i PBS i 24 timer.
- Vask 5 ganger i 1 time i 0,05% (PBST). Vent 1 time mellom hver vask.
- Tilsett deionisert vann og oppbevar ved 4 °C vekk fra direkte lys. På dette tidspunktet er stillaset klart til å bli avbildet.
4. Bildebehandling
- Legg prøven i en glassbunnet tallerken og fukt den med to dråper lagringsløsning (PBS eller deionisert vann).
- Forbered målet. Vi anbefaler å bruke et mål for vann nedsenking.
- Inspiser prøven ved hjelp av fluorescenslys.
- Bytt til datamaskinkontroll. Slå på lasere og juster laserintensitet, pinhole blenderåpning, detektorer bølgelengder, forsterkning, oppløsning og zoom. Angi tall og trinnstørrelse for z-stack og start anskaffelse. Vi anbefaler å bruke multifoton laser eksitasjon for å øke vev penetrasjon og for å minimere spredning av lys, bleking og vev skade.
5. Hematoksylin-eosin farging
- Excise 1 lunge lobe fra en euthanized mus.
- Plasser i en 10 mm x 10 mm x 5 mm kryonom og dekk den med ca. 500 μL OCT-forbindelse.
- Frys på tørris (-70 °C) og vedlikehold prøven ved den temperaturen.
- Excise en decellularisert lunge lobe fra en bearbeidet mus i henhold til trinn 2.5.
- Plasser i en kryonom med det største overflatearealet ned og dekk det med OCT-forbindelse som angitt i trinn 5.2.
- Frys på tørris (-70 °C) og vedlikehold prøven ved den temperaturen til det er nødvendig. Prøven kan lagres i minst 12 uker.
- Seksjon frosne vev blokker ved -20 °C i en kryostat med 5 μm tykkelse og plasser seksjoner på selvklebende glass lysbilder og lagre ved -80 °C.
- Ta sklier til romtemperatur til luften tørkes (ca. 20 min).
- Kort nedsenket i PBS og fikse ved å nedsenke lysbildene i 4% paraformaldehyd i PBS i 15 min. Vask en gang i PBS i 5 min, deretter to ganger i destillert vann i 5 min.
- Fordyp deg i Mayers hematoksylinløsning i 10 min. Denne gangen kan optimaliseres i henhold til vevskilde og flekkpreparat.
- Vask i en Coplin krukke under rennende destillert vann i 10 min.
- Dypp i eosinoppløsning i 7 min. Denne gangen kan optimaliseres i henhold til vevskilde og flekkpreparat.
- Dypp i 50% etanol for å fjerne overflødig Eosin og dehydrer ved å dyppe i 70% etanol, og i 96% og 100% etanol i 30 sekunder. Dypp i xylen flere ganger.
- Påfør få dråper DPX monteringsmedium og legg en glassdekslerlip.
- La skliene tørke over natten under en kjemisk hette.
- Skanne lysbilder i en lysbildeskanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kardiopulmonal decellularisering
Etter å ha fullført protokollen, vil hjertet og lungene, samt anneksvev som aortabuen, være fri for celler. Decellularisering kan valideres ved hematoksylin-eosinfarging (figur 1) av ECM stillaser som viser fjerning av kjernene som sammenligner med det opprinnelige vevet. Disse stillasene beholder dimensjonene til friske organer og dens uoppløselige ECM-struktur er intakt2. Figur 2 viser en skjematisk representasjon av de viktigste kirurgiske trinnene som kreves for å kunne parfyme muse-kardiopulmonalkomplekset.
ECM-bildebehandling
I en standardinnstilling kan sekundære antistoffer brukes i grønne, røde og fjernrøde fluorescenskanaler (dvs. 488 nm, 555nm/594 nm og 647 nm bølgelengdedeteksjon); Tillegg av andre harmoniske generasjon (SHG) bildebehandling ved hjelp av 2-foton eksitasjon vil avsløre fibrillar kollagen. Lasereksitasjon kan fremkalle vevs autofluorescens og forsiktighet må påføres når du bruker den med grønn fluorescens, da det kan forvirre bildedata. En enkel måte å validere autofluorescens på er å avbilde et ubegrunnet kontrollvev og angi laserintensitet og detektorforsterkning deretter og sammenligne dette med antistofffargingen. Imidlertid kan denne autofluorescensen brukes som en fordel, da den kan eksponere elastin i lunge stillaser.
ECM stillaser viste økt permeabilitet og lett gjennomførbarhet2. Bruk av denne protokollen med et motorisert mikroskopstadium gir mulighet for tredimensjonale, flislagte avbildninger av helmonterte prøver ved submikronoppløsning (figur 3). I tilfelle seksjonering av vevet er nødvendig (f.eks. for å avbilde hjertevegger eller dypt lungeparenchyma) skal vevet seksjoneres med en skarp skalpell før farging utføres.
Figur 1. Validerer decellularisering. Hematoksylin-Eosin farging av snap frosne prøver fra innfødte og decellulariserte lunger og hjerte. Legg merke til fraværet av kjerner i decellulariserte prøver. Alle vekter i mikroner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Mikrokirurgisk skjematisk som viser de viktigste trinnene som kreves for å decellularisere kardiopulmonalkomplekset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Representativ multippel proteinimmunisering av decellulariserte PyMT-muse lunger fra en 11 uker gammel kvinnelig mus. Flismosaikk som viser maksimal projeksjon av en z-stabel. Innsett 1 viser pleuraen. Innsett 2 viser normal parenchyma ECM. Innsettende 3 viser en bronkiole. Fargene er gjort tilgjengelige for fargeblind. Alle vekter i mikroner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Decellulariseringsteknikker basert på vevs agitasjon endrer ECM-strukturen, noe som gjør dem uegnet for ECM-strukturanalyse4. Perfusjon decellularisering, ved hjelp av en anatomisk rute som aorta av luftrøret, gjør det mulig å nå kapillærsengen, eller terminal alveoli, og letter levering av decellulariserende midler i hele orgelet. Bruken av zwitterionic, anioniske og ikke-ioniske vaskemidler for å decellularisere vev er rapportert4,5,6, men natrium dodecyl sulfat (SDS, anionisk) lineariserer fibrillar kollagen i musen fett pad2, men ikke i lungene; Dette antyder at valget av vaskemiddel må optimaliseres, tilpasse seg målvevet for å opprettholde ECM-strukturen. Vevsryddingsmetoder kan tenkes å bli brukt til ECM-analyse, selv om de krever kjemikalier som kan endre ECM krysskobling, og vevsdimensjoner7,8,9. Mens ervervet vevsgjennomsiktighet tillater forbedret mikroskopisk avbildning, forverrer tilstedeværelsen av celler antistoffpenetrasjon betydelig og kan dekke ECM-epitoper / proteiner. Isolering og avbildning intakt ECM tillater kvantitativ analyse av strukturen med analytiske verktøy2,10, kartlegger sammensetningen2 og åpner for videre ECM biokjemisk undersøkelse.
Disseksjon og ligasjon av store fartøy og følgelig isolering av koronar og lungesirkulasjon er nødvendig for å oppnå ensartet trykk av perfunderte løsninger gjennom vevet. Derfor er denne protokollen avhengig av hovedoperatørens mikrokirurgiske kompetanse. Det er viktig å operere med presisjon, for å bevare kar, lunger og hjerte intakt. Å utføre denne protokollen gjentatte ganger for å forstå thoraxens tredimensjonale anatomi er avgjørende for å oppnå konsistente resultater.
Den kirurgiske prosedyren som vises her oppsummerer de grunnleggende trinnene for å få tilgang til musens vaskulatur1,2 og organene i sitt territorium. Ved å endre ligaturmønsteret er det mulig å få tilgang til hode og nakke, forben og fettputer. Ved hjelp av de samme ferdighetene er det mulig å decellularisere subdiafragmatiske organer.
Like viktig er den forsiktige utformingen av immunstainingsoppsettet. Vi har tidligere utarbeidet en katalog over validerte antistoffer mot strukturelle ECM-proteiner3. Standardoppsettet kan avsløre opptil tre proteiner og fibrillar kollagen samtidig, noe som muliggjør kryssforhør.
Betydningen av denne metoden ligger i muligheten for å oppnå strukturelt og dimensjonalt intakte ECM stillaser. Dekonstruksjonen av et komplekst vev i diskrete komponenter er et av de grunnleggende målene for bioingeniør; mens det er relativt enkelt å isolere celler, eller blod, fra et organ, var det ingen metoder for å oppnå ECM stillas. Dette gjaldt spesielt svulster, men metoden som presenteres her åpner veien for ECM-isolasjon i enhver musestamme for anatomisk og biokjemisk analyse av ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker professor Ivana Novak og Dr. Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Københavns Universitet) for å ha gitt tilgang til mikroskopet. Dette arbeidet ble støttet av Det europeiske forskningsrådet (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR og JTE); stipendiatstilling fra Lundbeckstiftelsen (R286-2018-621; MR); Det svenske forskningsrådet (2017-03389; CDM); Det svenske kreftforeningen, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj og 190007; CDM); Tysk krefthjelp (Deutsche Krebshilfe; RR); og Det danske kreftforeningen (R204-A12454; RR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
