Summary
Этот протокол направлен на децеллюляризацию сердца и легких мышей. Полученные каркасы внеклеточного матрикса (ECM) могут быть иммуноокрашены и визуализированы для отображения местоположения и топологии их компонентов.
Abstract
Мы представляем здесь протокол децеллюляризации сердца и легких мыши. Он создает структурные каркасы ECM, которые можно использовать для анализа топологии и состава ECM. Он основан на микрохирургической процедуре, предназначенной для катетеризации трахеи и аорты усыпленной мыши для перфузии сердца и легких децеллюляризирующими агентами. Децеллюляризованный сердечно-легочный комплекс впоследствии может быть иммуноокрашен, чтобы выявить расположение структурных белков ECM. Вся процедура может быть завершена за 4 дня.
Каркасы ECM, полученные в результате этого протокола, свободны от размерных искажений. Отсутствие ячеек позволяет проводить структурное исследование структур ECM вплоть до субмикронного разрешения в 3D. Этот протокол может быть применен к здоровым и больным тканям мышей в возрасте от 4 недель, включая мышиные модели фиброза и рака, открывая путь к определению ремоделирования ECM, связанного с сердечно-легочным заболеванием.
Introduction
ECM представляет собой трехмерную сеть, состоящую из белков и гликанов, которая вмещает все клетки в многоклеточном организме, придавая органам их форму и регулируя поведение клеток на протяжении всей жизни1. Начиная с оплодотворения яйцеклеток, клетки строят и реконструируют ECM и, в свою очередь, строго контролируются им. Целью этого протокола является открытие способа анализа и картирования ECM мыши, поскольку мыши являются наиболее используемым модельным организмом в патофизиологии млекопитающих.
Развитие этого метода было обусловлено необходимостью охарактеризовать и изолировать связанный с метастазами нативный ECM2. Поскольку опухоли не имеют надлежащей анатомической васкуляризации, а мыши являются относительно небольшими организмами, микрохирургические процедуры были разработаны для ретроградной катетеризации аорты, при этом изолируя кровообращение основного сосуда, ведущего к опухоли (например, легочных вен), тем самым фокусируя поток реагентов и позволяя децеллюляризацию опухоли. Этот метод создает каркасы ECM с сохраненной структурой2, которые могут быть иммуноокрашены и визуализированы, что позволяет отображать структуру ECM в субмикронных деталях. Для выполнения этого протокола необходимо приобрести хирургические и микрохирургические навыки (рассечение, микрозащищение и катетеризация), которые могут представлять собой потенциальное ограничение его использования. Насколько нам известно, этот метод представляет собой современное состояние для анализа нативной структуры ECM2,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, включенные здесь, были рассмотрены и одобрены этическим комитетом, регулирующим экспериментальную медицину в Копенгагенском университете, и согласуются с датским и европейским законодательством. Чтобы продемонстрировать этот протокол, мы использовали самок мышей BALB / cJ в возрасте 8-12 недель и самку мыши MMTV-PyMT в возрасте 11 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвращение бактериального загрязнения децеллюляризированного каркаса ECM дает наилучший результат визуализации и позволяет длительное хранение образцов. Поэтому важно, чтобы все ступени были стерильными. Таким образом, все инструменты и хирургические материалы, включая шов, микрошов, растворы, трубки, соединители Luer и катетеры, должны быть стерильными. Поверхности, включая полистирольный лоток, должны быть продезинфицированы 70% этанолом, а перфузию предпочтительно проводить под ламинарной проточной вытяжкой. Все процедуры проходят при комнатной температуре, если не указано иное.
1. Посмертная микрохирургия
- Усыплите мышь с помощью камеры CO2 .
- Поместите мышь в камеру объемом 4 л и начните заполнять 100% CO2, начиная с 0,2 л/мин в течение 2 мин, увеличивая до достижения потока 0,8 л/мин через 3 мин. Мышь должна упасть без сознания в течение первых 2 мин, а затем дыхание должно прекратиться (обычно около 5 мин, но поток может поддерживаться по мере необходимости). Подтвердите смерть, прежде чем переходить к следующему шагу.
- Побрить грудную клетку, брюшко и спину мыши машинкой для стрижки волос и продезинфицировать 70% этанолом. Бритье значительно уменьшает количество артефактов за счет наличия волос либо на образцах для визуализации, либо на биохимическом анализе.
- Прикрепите мышь к полистирольному лотку, вытянув ее передние и задние конечности, а также голову и хвост. Поместите его под микроскоп микрохирургии.
- С помощью ножниц с прямым рисунком Майо устанавливают хирургический доступ с кожным разрезом, идущим от подчелюстной области к нижней части живота и рассекают подкожно, чтобы обнажить грудную стенку и брюшину.
- С помощью микрохирургических ножниц разрезают большую грудную клетку и малую грудную мышцы вдоль шестого межреберного пространства по обеим сторонам грудной стенки.
- Используя ножницы с прямым рисунком, разрезайте грудину вдоль предыдущих разрезов, а затем завершите стернотомию, разрезав грудину вдоль ее длинной оси, затем поднимите и закрепите обе стороны грудной стенки, чтобы обнажить сердечно-легочный комплекс.
- Используя микрощипцы с круглым наконечником (или микрощипцы Дюмона), иссечь тимус и окружающую жировую ткань, деликатно стягивая их с прикреплений. Это позволит выявить основные суда.
- С помощью прижигания прижигают нисходящую полую вену и, используя ножницы с прямым рисунком, разрезают пищевод.
- Используя острые микрощипцы, отделяют брахиоцефальные вены от брахиоцефальных и брахиоцефальных, оставляют общие сонные и левые подключичные артерии от подлежащей ткани, чтобы облегчить перевязку и прижигание.
- Используя микроигольчатый держатель, острые микрощипцы и 9-0 швов, накладывающих швы над появлением брахиоцефальной, левой общей сонной и левой подключичной артерий.
- Прижигают брахиоцефальные вены.
- Отделите подчелюстные слюнные железы вдоль средней линии, чтобы обнажить мышцы шеи и трахею. Отделите мышцы, чтобы обнажить крикотиреоидную связку. С помощью микроножек откройте вход, разрезав связку.
- Введите катетер 27 г в трахею и деликатно надавите до тех пор, пока трахея не разветвится в бронхи (т. е. до тех пор, пока не будет достигнуто сопротивление катетеру, затем отступите на 3 мм). Будьте осторожны, чтобы не нарушить работу бронхов. Используя шов 6-0, наложите 3 шва вокруг трахеи, чтобы закрепить катетер.
- Сечение мыши на высоте 12-го грудного позвонка. Нисходящая аорта проходит спереди к позвоночнику и должна быть разделена здесь вместе с позвоночником. Раздвиньте нижнюю половину.
- Ретроградно катетеризирует аорту и толкает катетер до тех пор, пока он не достигнет дуги аорты. Используя 9-0 швов, наложите 4 шва вокруг аорты, начиная с 5 мм ниже кончика катетера.
2. Децеллюляризация
- Подключите мышь к насосной системе с помощью силиконовых трубок и разъемов Luer. Перфузируйте с деионизированной водой при 200 мкл/мин в течение 15 мин. Поддерживайте эту скорость потока во время децеллюляризации.
- Замените перфузионный агент на 0,5% дезоксихолат натрия (DOC), разведенный в деионизированной воде и перфьюированный на ночь.
- Изменить перфузионный агент на 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), разбавленного в деионизированной воде и перфузионировать в течение 8 часов.
- Настаивайте на деионизированной воде в течение ночи, чтобы смыть SDS и DOC в течение 24 ч.
- Резецировать децеллюляризированное сердце и легкие путем разрезания его прикреплений к грудной клетке с помощью изогнутых ножниц и хранить в стерильной криотрубке с деионизированной водой с 1% (v/v) пенициллин-стрептомицином и 0,3 мкМ азида натрия при 4 °C. Каркасы ECM могут храниться не менее 12 недель1. Если каркас будет использоваться для биохимического анализа (например, масс-спектрометрии), заморозьте в жидком азоте.
3. Иммуноокрашивание
- Планируйте визуализацию: определите первичное антитело (или антитела) и комбинацию флуоресцентно конъюгированных вторичных антител, чтобы соответствовать друг другу и соответствовать лазерным линиям флуоресцентного микроскопа.
- Заблокируйте образец, погрузив его в криотрубу, содержащую 6% (v/v) ослиной сыворотки - 3% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (BSA) на ночь.
- Инкубировать с первичными антителами (или антителами) в 3% ослиной сыворотке в PBS в течение 24 ч.
- Промывайте 5 раз в течение 1 ч каждый раз в 0,05% анимации 20 в PBS (PBST).
- Инкубируйте образец с флуоресцентно конъюгированным вторичным антителом (или антителами) в 3% ослиной сыворотке в PBS в течение 24 ч.
- Стирать 5 раз в течение 1 часа по 0,05% (PBST). Подождите 1 ч между каждой стиркой.
- Добавьте деионизированную воду и храните при температуре 4 °C вдали от прямого света. На этом этапе каркас готов к созданию изображения.
4. Визуализация
- Поместите образец в стеклянную посуду и увлажните его двумя каплями раствора для хранения (PBS или деионизированной водой).
- Подготовьте цель. Мы рекомендуем использовать объектив погружения в воду.
- Осмотрите образец с помощью флуоресцентного света.
- Переключитесь на управление компьютером. Включите лазеры и отрегулируйте интенсивность лазера, диафрагму точечных отверстий, длины волн детекторов, коэффициент усиления, разрешение и масштабирование. Задайте число и размер шага для z-стека и начните сбор. Мы рекомендуем использовать многофотонное лазерное возбуждение для увеличения проникновения в ткани и минимизации рассеяния света, отбеливания и повреждения тканей.
5. Окрашивание гематоксилин-эозином
- Иссечение 1 доли легкого у усыпленной мыши.
- Поместите в криомольд размером 10 мм x 10 мм x 5 мм и накройте его приблизительно 500 мкл соединения OCT.
- Заморозить на сухом льду (-70 °C) и поддерживать образец при этой температуре.
- Иссечение одной децеллюляризированной доли легкого из обработанной мыши в соответствии с шагом 2.5.
- Поместите в криомольд с наибольшей площадью поверхности вниз и покройте его соединением OCT, как указано на этапе 5.2.
- Заморозить на сухом льду (-70°C) и поддерживать образец при этой температуре до тех пор, пока не потребуется иное. Образец может храниться не менее 12 недель.
- Сечение замороженных тканевых блоков при -20 °C в криостате толщиной 5 мкм и размещение срезов на клейких стеклянных слайдах и хранение при -80 °C.
- Доведите горки до комнатной температуры до высыхания на воздухе (примерно 20 мин).
- Коротко погрузитесь в PBS и исправьте, погрузив слайды в 4% параформальдегид в PBS на 15 минут. Промыть один раз в PBS в течение 5 мин, затем дважды в дистиллированной воде в течение 5 мин.
- Погрузить в раствор гематоксилина Майера на 10 мин. Это время может быть оптимизировано в соответствии с источником ткани и подготовкой пятна.
- Промыть в банке Коплина под проточной дистиллированной водой в течение 10 мин.
- Погрузить в раствор эозина на 7 мин. Это время может быть оптимизировано в соответствии с источником ткани и подготовкой пятна.
- Окуните в 50% этанол, чтобы удалить избыток эозина и обезвоживаться путем кратковременного погружения в 70% этанола, а также в 96% и 100% этанола в течение 30 секунд. Обмакните в ксилол несколько раз.
- Нанесите несколько капель монтажного носителя DPX и поместите стеклянную крышку.
- Оставьте горки сушиться на ночь под химическим капотом.
- Сканирование слайдов в сканере слайдов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сердечно-легочная децеллюляризация
После успешного завершения протокола сердце и легкие, а также аннексированная ткань, такая как дуга аорты, будут свободны от клеток. Децеллюляризация может быть подтверждена окрашиванием гематоксилин-эозином (рисунок 1) каркасов ECM, показывающих удаление ядер по сравнению с нативной тканью. Эти каркасы сохраняют размеры свежих органов, а их нерастворимая структура ECM неповреждена2. На рисунке 2 показано схематическое представление ключевых хирургических этапов, необходимых для успешной перфузии мышиного сердечно-легочного комплекса.
EcM-визуализация
В стандартных условиях вторичные антитела могут использоваться в зеленых, красных и дальнекрасных флуоресцентных каналах (т.е. 488 нм, 555 нм/594 нм и 647 нм при обнаружении длин волны); добавление второй генерации гармоник (SHG) с использованием 2-фотонного возбуждения выявит фибриллярный коллаген. Лазерное возбуждение может вызвать аутофлуоресценцию тканей, и при использовании его с зеленой флуоресценцией необходимо соблюдать осторожность, так как это может запутать данные визуализации. Простой способ проверки автофлуоресценции заключается в том, чтобы получить изображение незапятнанной контрольной ткани и соответственно установить интенсивность лазера и усиление детектора и сравнить это с окрашиванием антител. Тем не менее, эта автофлуоресценция может быть использована в качестве преимущества, так как она может подвергать воздействию эластина в каркасах легких.
Эшафоты ECM показали повышенную проницаемость и светопроницаемость2. Использование этого протокола с моторизованной ступенью микроскопа позволяет получать трехмерную, мозаичную визуализацию цельных образцов с субмикронным разрешением (рисунок 3). В случае, если необходимо разрезание ткани (например, для изображения сердечных стенок или глубокой легочной паренхимы), ткань должна быть разрезана острым скальпелем перед проведением окрашивания.
Рисунок 1. Проверка децеллюляризации. Окрашивание гематоксилин-эозином замороженных образцов из нативных и децеллюляризованных легких и сердца. Обратите внимание на отсутствие ядер в децеллюляризированных образцах. Все чешуйки в микронах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Схема микрохирургии, показывающая ключевые этапы, необходимые для децеллюляризации сердечно-легочного комплекса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Репрезентативное мультибелковое иммуноокрашивание децеллюляризованных легких мыши PyMT от 11-недельной самки мыши. Мозаика плитки, показывающая максимальную проекцию z-стека. Вставка 1 показывает плевру. Вставка 2 показывает нормальную паренхиму ECM. Вставка 3 показывает бронхиолу. Цвета были сделаны доступными для дальтоников. Все чешуйки в микронах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы децеллюляризации, основанные на тканевом перемешивании, изменяют структуру ECM, что делает их непригодными для анализа структуры ECM4. Перфузионная децеллюляризация с использованием анатомического пути, такого как аорта трахеи, позволяет достичь капиллярного русла или терминальных альвеол и облегчает доставку децеллюляризирующих агентов по всему органу. Сообщается об использовании цвиттерионических, анионных и неионных детергентов для децеллюляризации тканей4,5,6, однако додецилсульфат натрия (SDS, анионный) линеаризирует фибриллярный коллаген в жировой подушке мыши2, но не в легких; это говорит о том, что выбор моющего средства должен быть оптимизирован, адаптируясь к ткани-мишени для поддержания структуры ECM. Методы очистки тканей могут быть использованы для анализа ECM, хотя они требуют химических веществ, которые могут изменять сшивку ECM и размеры ткани7,8,9. В то время как приобретенная прозрачность тканей позволяет улучшить микроскопическую визуализацию, присутствие клеток значительно ухудшает проникновение антител и может охватывать эпитопы / белки ECM. Выделение и визуализация интактной ЭВМ позволяет проводить количественный анализ его структуры с помощью аналитических инструментов2,10, картировать его состав2 и открывает путь для дальнейшего биохимического исследования ЭВМ.
Рассечение и перевязка крупных сосудов и последующая изоляция коронарного и легочного кровообращения необходимы для достижения равномерного давления перфузированных растворов по всем тканям. Поэтому этот протокол зависит от микрохирургической экспертизы основного оператора. Очень важно работать с точностью, чтобы сохранить сосуды, легкие и сердце нетронутыми. Выполнение этого протокола многократно для понимания трехмерной анатомии грудной клетки имеет первостепенное значение для получения последовательных результатов.
Хирургическая процедура, показанная здесь, суммирует основные шаги для доступа к сосудистой системе мыши1,2 и органам на ее территории. Изменяя рисунок лигатуры, можно получить доступ к голове и шее, передним конечностям и жировым подушечкам. Используя те же навыки, можно децеллюляризировать субдиафрагмальные органы.
Не менее важным является тщательный дизайн установки иммуноокрашивания. Ранее мы составили каталог проверенных антител против структурных белков ECM3. Стандартная установка может выявить до трех белков и фибриллярного коллагена одновременно, что позволяет проводить перекрестный допрос.
Значимость данного метода заключается в возможности получения структурно и размерно неповрежденных каркасов ECM. Деконструкция сложной ткани на незаметные компоненты является одной из фундаментальных целей биоинженерии; в то время как относительно просто изолировать клетки или кровь из органа, не было никаких методов для получения его каркасов ECM. Особенно это касалось опухолей, но представленный здесь метод открывает путь для выделения ECM у любого штамма мыши для анатомического и биохимического анализа ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора Ивану Новак и доктора Нинн Майн Кристенсен (Центр усовершенствованной биовизуализации (CAB), Копенгагенский университет) за предоставление доступа к микроскопу. Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR и JTE); стипендия PhD от Фонда Лундбека (R286-2018-621; МР); Шведский исследовательский совет (2017-03389; МЧР); Шведское онкологическое общество, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, и 190007; МЧР); Немецкая онкологическая помощь (Deutsche Krebshilfe; РР); и Датское онкологическое общество (R204-A12454; РР).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
