Summary
该协议旨在使小鼠的心脏和肺部脱细胞。可以对所得的细胞外基质（ECM）支架进行免疫染色和成像，以绘制其组分的位置和拓扑结构。
Abstract
我们在这里提出了一种小鼠心脏和肺部的去细胞化方案。它产生可用于分析ECM拓扑和组成的结构ECM支架。它基于一种微外科手术，旨在对安乐死小鼠的气管和主动脉进行导管插入，以用去细胞化剂灌注心脏和肺部。随后可以对去细胞化的心肺复合物进行免疫染色，以揭示结构性ECM蛋白的位置。整个过程可以在4天内完成。
由该协议产生的ECM支架没有尺寸失真。由于没有细胞，可以对ECM结构进行结构检查，直至亚微米分辨率的3D。该协议可应用于来自4周龄小鼠的健康和患病组织，包括纤维化和癌症的小鼠模型，为确定与心肺疾病相关的ECM重塑开辟了道路。
Introduction
ECM是由蛋白质和聚糖组成的三维网络，可容纳多细胞生物体中的所有细胞，使器官具有形状并在整个生命中调节细胞行为1。从卵子受精开始，细胞建立和重塑ECM，并反过来受到它的严格控制。该协议的目的是开辟一种分析和绘制小鼠ECM的方法，因为小鼠是哺乳动物病理生理学中最常用的模式生物。
该方法的发展是由表征和分离转移相关天然ECM2的需求所驱动的。由于肿瘤缺乏适当的解剖血管形成，并且小鼠是相对较小的生物体，因此显微外科手术被设计为逆行导管主动脉，同时分离导致肿瘤的主要血管（例如，肺静脉）的循环，从而聚焦试剂流并允许肿瘤脱细胞。该方法产生具有保守结构2 的ECM支架，可以进行免疫染色和成像，从而允许亚微米级细节的ECM结构映射。为了执行该协议，有必要获得手术和显微外科技术（解剖，显微缝合和导管插入术），这可能代表其使用的潜在限制。据我们所知，这种方法代表了本机ECM结构成像分析的最新技术2，3。
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Protocol
这里包含的所有程序都经过哥本哈根大学管理实验医学伦理委员会的审查和批准，并同意丹麦和欧洲的立法。为了证明这一方案，我们使用了8-12周龄的雌性BALB / cJ小鼠和11周龄的MMTV-PyMT雌性小鼠。
注意：避免去细胞化的ECM支架的细菌污染可获得最佳的成像结果，并允许长期样品储存。因此，保持所有步骤无菌非常重要。因此，所有器械和手术材料，包括缝合线、微缝合线、溶液、导管、鲁尔连接器和导管，都必须是无菌的。表面，包括聚苯乙烯托盘，必须用70%乙醇消毒，灌注最好在层流罩下进行。除非另有说明，否则所有程序均在室温下进行。
1. 验尸显微外科
- 使用CO2 室对小鼠实施安乐死。
- 将鼠标放入4 L室中，并开始填充100%CO2，从0.2 L / min开始2分钟，增加直到3分钟后达到0.8 L / min的流量。小鼠应在前2分钟内失去知觉，然后呼吸应停止（通常在5分钟左右，但可以根据需要维持血流）。在继续下一步之前确认死亡。
- 用理发刀剃掉小鼠的胸部，腹部和背部，并用70%乙醇消毒。剃须大大减少了由于样品上存在头发以进行成像或生化分析而产生的伪影数量。
- 将鼠标固定在聚苯乙烯托盘上，伸展其前肢和后肢，以及头部和尾部。将其放在显微外科显微镜下。
- 使用Mayo直型剪刀建立手术通道，皮肤切口从下颌下区域延伸到下腹部，皮下剖腹以暴露胸壁和腹膜。
- 使用显微外科剪刀，沿着胸壁两侧的第六肋间间隙切除胸大肌和胸小肌。
- 使用直型剪刀，沿着先前的切口切开胸骨，然后沿着胸骨的长轴切割胸骨来完成胸骨切开术，然后抬高并固定胸壁的两侧以暴露心肺复合体。
- 使用圆头微钳（或Dumont微镊子），通过巧妙地将其从附着物上拉出胸腺和周围的脂肪组织来切除胸腺和周围的脂肪组织。这将揭示主要船只。
- 使用烧灼术，烧灼下降的卡瓦静脉，并使用直纹剪刀切开食道。
- 使用锋利的微钳，将臂头静脉和臂头静脉分开，将颈总动脉和锁骨下动脉与下层组织分开，以促进结扎和烧灼。
- 使用微针支架，锋利的微钳和9-0缝合线在臂头上方，左颈总动脉和左锁骨下动脉出现缝合线。
- 烧灼臂头静脉。
- 沿中线分离下颌下唾液腺，以暴露颈部肌肉和气管。分离肌肉以暴露环状甲状腺韧带。使用微型剪刀，通过切开韧带打开入口。
- 在气管中引入27 G导管，并小心地推动，直到气管分支进入支气管（即，直到遇到对导管的阻力，然后退去3mm）。注意不要破坏支气管。使用6-0缝合线，在气管周围缝3针以固定导管。
- 将鼠标切在第12胸椎的高度。降主动脉前向脊柱，应与脊柱一起在这里切开。将下半部分分开。
- 逆行导管导管并推动导管直至到达主动脉弧。使用9-0缝合线，在主动脉周围缝合4针，从导管尖端下方5mm开始。
2. 去细胞化
- 使用硅胶管和鲁尔连接器将鼠标连接到泵系统。用去离子水以200μL/分钟浸入15分钟。在去细胞化过程中保持这种流速。
- 将灌注剂换成0.5%脱氧胆酸钠（DOC），在去离子水中稀释并灌注过夜。
- 将灌注剂换成0.1%十二烷基硫酸钠（SDS），在去离子水中稀释，并灌注8小时。
- 用去离子水浸泡过夜，洗去SDS和DOC24小时。
- 使用弯曲的剪刀切除去细胞化的心脏和肺部，并将其与胸部的附着物分开，并储存在装有1%（v / v）青霉素 - 链霉素和0.3μM叠氮化钠的无菌冷冻管中，在4°C下。如果支架将用于生化分析（例如，质谱），请在液氮中快速冷冻。
3. 免疫染色
- 计划成像：确定一抗（或多种抗体）和荧光偶联的二抗的组合，以相互匹配并适合荧光显微镜的激光线。
- 通过将样品浸入含有6%（v / v）驴血清 - 3%（w / v）牛血清白蛋白（BSA）的冷冻管中过夜来阻断样品。
- 在PBS的3%驴血清中孵育一抗（或多种抗体）24小时。
- 在PBS（PBST）中，每次0.05%补间20洗涤5次，每次1小时。
- 将样品与荧光偶联的二抗（或抗体）在PBS中的3%驴血清中孵育24小时。
- 用0.05%（PBST）洗涤5次，每次1小时。每次洗涤之间等待1小时。
- 加入去离子水，储存在4°C，远离直射光。此时，基架已准备好进行映像。
4. 成像
- 将样品放入玻璃底培养皿中，并用两滴储存溶液（PBS或去离子水）加湿。
- 准备目标。我们建议使用水浸物镜。
- 使用荧光灯检查样品。
- 切换到计算机控制。打开激光并调整激光强度、针孔孔径、探测器波长、增益、分辨率和变焦。设置 z 堆栈的数量和步长并开始采集。我们建议使用多光子激光激发来增加组织穿透力，并最大限度地减少光的散射，漂白和组织损伤。
5. 苏木精-曙红染色
- 从安乐死小鼠身上切除1个肺叶。
- 放入10 mm x 10 mm x 5 mm低温注射器中，并用约500μLOCT化合物覆盖。
- 在干冰（-70°C）上冷冻并将样品保持在该温度。
- 根据步骤2.5从处理过的小鼠中切除一个去细胞化的肺叶。
- 放入具有最大表面积的低温器中，并按照步骤5.2的规定用OCT化合物覆盖。
- 在干冰（-70°C）上冷冻，并将样品保持在该温度，直到另有要求。样品可以储存至少12周。
- 在厚度为5μm的低温恒温器中，在-20°C下切割冷冻组织块，并将切片放在粘合剂载玻片上并储存在-80°C。
- 将载玻片置于室温直至风干（约20分钟）。
- 短暂浸入PBS中，并将载玻片浸入PBS中的4%多聚甲醛中15分钟来固定。在PBS中洗涤一次5分钟，然后在蒸馏水中洗涤两次5分钟。
- 浸入梅耶尔的苏木精溶液中10分钟。该时间可以根据组织来源和染色剂制备进行优化。
- 在Coplin罐中，在蒸馏水下洗涤10分钟。
- 浸入曙红溶液中7分钟。该时间可以根据组织来源和染色剂制备进行优化。
- 浸入50%乙醇中，去除多余的曙红，并通过在70%乙醇中短暂浸入96%和100%乙醇中30秒来脱水。浸入二甲苯中几次。
- 涂抹几滴 DPX 安装介质，然后放置玻璃盖玻片。
- 将载玻片放在化学罩下晾干过夜。
- 扫描玻片扫描仪中的载玻片。
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Representative Results
心肺脱细胞
成功完成实验方案后，心脏和肺部以及主动脉弧等附属组织将没有细胞。去细胞化可以通过ECM支架的血氧锡 - 曙红染色（图1）来验证，与天然组织相比，显示细胞核的去除。这些支架保留了新鲜器官的尺寸，其不溶性ECM结构完好无损2。 图2 显示了成功灌注小鼠心肺复合体所需的关键手术步骤的示意图。
ECM 成像
在标准设置中，二抗可用于绿色、红色和远红色荧光通道（即488 nm、555nm/594 nm和647 nm波长检测）;使用2光子激发添加二次谐波发生（SHG）成像将揭示原纤维胶原蛋白。激光激发会刺激组织自发荧光，当与绿色荧光一起使用时必须小心，因为它可能会混淆成像数据。验证自动荧光的一种简单方法是对未染色的对照组织进行成像，并相应地设置激光强度和检测器增益，并将其与抗体染色进行比较。然而，这种自发荧光可以用作一个优点，因为它可以在肺部支架中暴露弹性蛋白。
ECM支架的渗透率和光穿透性增加2。将此协议与电动显微镜载物台一起使用，可以亚微米分辨率对整个安装件样品进行三维平铺成像（图3）。如果需要切片组织（例如，对心壁或肺深部实质进行成像），在进行染色之前，应用锋利的手术刀切除组织。
图 1.验证去细胞化。 来自天然和去细胞化肺和心脏的速冻样品的苏木精 - 曙红染色。注意去细胞化样品中缺乏细胞核。所有秤均以微米为单位。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2.显微外科示意图显示了使心肺复合体去细胞化所需的关键步骤。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3.来自11周龄雌性小鼠的去细胞化PyMT小鼠肺的代表性多蛋白免疫染色。 显示 z 堆栈最大投影的磁贴马赛克。插图 1 显示胸膜。插图 2 显示实质 ECM 正常。插图 3 显示细支气管。颜色已可供色盲使用。所有秤均以微米为单位。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
基于组织搅拌的去细胞化技术改变了ECM结构，使其不适合ECM结构分析4。灌注去细胞化，使用解剖途径，如气管的主动脉，允许到达毛细血管床或肺泡末端，并促进脱细胞剂在整个器官的递送。据报道，使用两性离子，阴离子和非离子洗涤剂使组织去细胞化4，5，6，然而，十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子）线性化小鼠脂肪垫中的原纤维胶原2 ，但不在肺部;这表明洗涤剂的选择必须优化，适应目标组织以保持ECM结构。可以想象，组织清除方法可用于ECM分析，尽管它们需要可以改变ECM交联和组织尺寸的化学物质7，8，9。虽然获得的组织透明度允许增强显微成像，但细胞的存在显着恶化抗体渗透，并可能覆盖ECM表位/蛋白质。分离和成像完整的ECM允许使用分析工具对其结构进行定量分析2，10，绘制其组成图2 ，并为进一步的ECM生化检查开辟了道路。
主要血管的解剖和连接以及随之而来的冠状动脉和肺循环的分离对于在整个组织中实现灌注溶液的均匀压力是必要的。因此，该协议取决于主要操作员的显微外科专业知识。精确操作至关重要，以保持血管，肺和心脏的完整。反复执行该协议以了解胸部的三维解剖结构对于获得一致的结果至关重要。
这里显示的外科手术总结了进入小鼠脉管系统1，2 及其器官的基本步骤。通过改变结扎模式，可以进入头部和颈部，前肢和脂肪垫。使用相同的技能，可以使膈肌下器官脱细胞。
同样重要的是免疫染色设置的仔细设计。我们之前已经编制了一份经过验证的针对结构性ECM蛋白的抗体目录3。标准设置可以同时显示多达三种蛋白质和原纤维胶原蛋白，从而实现交叉检查。
这种方法的意义在于可以获得结构和尺寸完整的ECM支架。将复杂组织解构为谨慎的组件是生物工程的基本目标之一;虽然从器官中分离细胞或血液相对简单，但没有方法获得其ECM支架。对于肿瘤尤其如此，但这里提出的方法为任何小鼠品系中的ECM分离开辟了道路，用于ECM的解剖学和生化分析。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Ivana Novak教授和Nynne Meyn Christensen博士（哥本哈根大学高级生物成像中心（CAB））提供显微镜访问。这项工作得到了欧洲研究理事会（ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN;AEM-G，OW，RR和JTE）;伦德贝克基金会的博士奖学金（R286-2018-621;先生）;瑞典研究委员会 （2017-03389;清洁发展机制）;瑞典癌症协会，Cancerfonden（CAN 2016/783，19 0632 Pj和190007;清洁发展机制）;德国癌症援助组织（Deutsche Krebshilfe;RR）;和丹麦癌症协会（R204-A12454;RR）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
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