Summary
Questo protocollo mira a decellularizzare il cuore e i polmoni dei topi. Gli scaffold a matrice extracellulare (ECM) risultanti possono essere immunocolorati e ripresi per mappare la posizione e la topologia dei loro componenti.
Abstract
Presentiamo qui un protocollo di decellularizzazione per cuore e polmoni di topo. Produce scaffold ECM strutturali che possono essere utilizzati per analizzare la topologia e la composizione ECM. Si basa su una procedura microchirurgica progettata per cateterizzare la trachea e l'aorta di un topo eutanasizzato per perfondere il cuore e i polmoni con agenti decellularizzanti. Il complesso cardiopolmonare decellularizzato può successivamente essere immunocolorato per rivelare la posizione delle proteine ECM strutturali. L'intera procedura può essere completata in 4 giorni.
Gli scaffold ECM risultanti da questo protocollo sono privi di distorsioni dimensionali. L'assenza di cellule consente l'esame strutturale delle strutture ECM fino alla risoluzione submicron in 3D. Questo protocollo può essere applicato a tessuti sani e malati di topi di 4 settimane, compresi modelli murini di fibrosi e cancro, aprendo la strada a determinare il rimodellamento dell'ECM associato alla malattia cardiopolmonare.
Introduction
L'ECM è una rete tridimensionale fatta di proteine e glicani che ospita tutte le cellule in un organismo multicellulare, dando agli organi la loro forma e regolando il comportamento cellulare per tutta la vita1. Dalla fecondazione degli ovuli in poi, le cellule costruiscono e rimodellano l'ECM e sono a loro volta strettamente controllate da esso. Lo scopo di questo protocollo è quello di aprire un modo per analizzare e mappare l'ECM del topo, poiché i topi sono l'organismo modello più utilizzato nella fisiopatologia dei mammiferi.
Lo sviluppo di questo metodo è stato guidato dalla necessità di caratterizzare e isolare l'ECM2 nativo associato alle metastasi. Poiché i tumori mancano di un'adeguata vascolarizzazione anatomica e i topi sono organismi relativamente piccoli, le procedure microchirurgiche sono state progettate per cateterizzare retrogradamente l'aorta, isolando la circolazione del vaso principale che porta a un tumore (ad esempio, le vene polmonari), focalizzando così il flusso di reagenti e consentendo la decellularizzazione del tumore. Questo metodo produce scaffold ECM con una struttura conservata2 che possono essere immunocolorati e ripresi, consentendo la mappatura della struttura ECM nei dettagli submicronici. Per realizzare questo protocollo è necessario acquisire competenze chirurgiche e microchirurgiche (dissezione, microsuturazione e cateterizzazione) che possono rappresentare una potenziale limitazione al suo utilizzo. Per quanto ne sappiamo, questo metodo rappresenta lo stato dell'arte per l'analisi nativa della struttura ECM2,3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure qui incluse sono state riviste e approvate dal comitato etico che regola la medicina sperimentale dell'Università di Copenaghen e concordano con la legislazione danese ed europea. Per dimostrare questo protocollo, abbiamo utilizzato topi BALB/cJ femmina di 8-12 settimane di età e un topo femmina MMTV-PyMT di 11 settimane di età.
NOTA: evitare la contaminazione batterica dell'impalcatura ECM decellularizzata offre il miglior risultato di imaging e consente la conservazione a lungo termine del campione. È quindi importante mantenere sterili tutti i passaggi. Pertanto, tutti gli strumenti e il materiale chirurgico, tra cui sutura, micro-sutura, soluzioni, tubi, connettori Luer e cateteri, devono essere sterili. Le superfici, incluso un vassoio in polistirolo, devono essere disinfettate con etanolo al 70% e la perfusione deve essere effettuata preferibilmente sotto una cappa a flusso laminare. Tutte le procedure si svolgono a temperatura ambiente se non diversamente indicato.
1. Microchirurgia post mortem
- Eutanasia del mouse utilizzando una camera a CO2 .
- Posizionare il mouse in una camera da 4 L e iniziare a riempire con CO2 al 100%, a partire da 0,2 L / min per 2 minuti, aumentando fino a raggiungere un flusso di 0,8 L / min dopo 3 minuti. Il topo dovrebbe perdere conoscenza durante i primi 2 minuti, e poi la respirazione dovrebbe cessare (di solito circa 5 minuti, ma il flusso può essere mantenuto se necessario). Conferma la morte prima di procedere al passaggio successivo.
- Rasare il torace, l'addome e la parte posteriore del topo con il tagliacapelli e disinfettare con etanolo al 70%. La rasatura riduce notevolmente il numero di artefatti a causa della presenza di capelli su campioni per l'imaging o l'analisi biochimica.
- Fissare il mouse a un vassoio in polistirolo, estendendo gli arti anteriori e posteriori, nonché la testa e la coda. Mettilo sotto il microscopio microchirurgico.
- Utilizzando una forbice a modello dritto Mayo stabilire l'accesso chirurgico con un'incisione cutanea che va dalla regione sottomandibolare all'addome inferiore e sezionare per via sottocutanea per esporre la parete toracica e il peritoneo.
- Usando le forbici microchirurgiche, tagliare i muscoli pettorali maggiori e pettorali minori lungo il sesto spazio intercostale su entrambi i lati della parete toracica.
- Usando forbici a modello dritto, tagliare lo sterno lungo le incisioni precedenti, quindi completare una sternotomia tagliando lo sterno lungo il suo asse lungo, quindi elevare e fissare entrambi i lati della parete toracica per esporre il complesso cardiopolmonare.
- Usando micro-pinze a punta rotonda (o micro-pinze di Dumont), asportare il timo e il tessuto adiposo circostante estraendoli delicatamente dai loro attacchi. Questo rivelerà le navi principali.
- Usando la cauterizzazione, cauterizzare la vena cava discendente e, usando forbici a modello dritto, tagliare l'esofago.
- Usando micro-pinze affilate, separare le vene brachiocefaliche e quelle brachiocefale, le arterie carotidi e succlavia sinistra dal tessuto sottostante per facilitare la legatura e la cauterizzazione.
- Usando il supporto del micro-ago, la micro-pinza affilata e la sutura 9-0 posizionano i punti sopra l'emergere delle arterie brachiocefale, carotidi comuni e succlavia sinistra.
- Cauterizzare le vene brachiocefaliche.
- Separare le ghiandole salivari sottomandibolari lungo la linea mediana per esporre i muscoli del collo e la trachea. Separare i muscoli per esporre il legamento cricotiroideo. Usando micro-forbici, apri un ingresso sezionando il legamento.
- Introdurre un catetere da 27 G nella trachea e spingere delicatamente fino a quando la trachea si ramifica nei bronchi (cioè, fino a quando non viene raggiunta la resistenza al catetere, quindi ritirarsi di 3 mm). Fare attenzione a non interrompere i bronchi. Usando una sutura 6-0, posizionare 3 punti attorno alla trachea per fissare il catetere.
- Sezione il topo all'altezza della 12a vertebra toracica. L'aorta discendente corre anteriormente alla colonna vertebrale e dovrebbe essere sezionata qui insieme alla colonna vertebrale. Distingui la metà inferiore.
- Cateterizzare retrogradamente l'aorta e spingere il catetere fino a raggiungere l'arco aortico. Usando la sutura 9-0, posizionare 4 punti intorno all'aorta, iniziando 5 mm sotto la punta del catetere.
2. Decellularizzazione
- Collegare il mouse a un sistema di pompe utilizzando tubi in silicone e connettori Luer. Perfondere con acqua deionizzata a 200 μL/min per 15 min. Mantenere questa portata durante la decellularizzazione.
- Cambiare l'agente di perfusione allo 0,5% di sodio desossicolato (DOC) diluito in acqua deionizzata e perfondere durante la notte.
- Modificare l'agente di perfusione allo 0,1% di sodio dodecilsolfato (SDS) diluito in acqua deionizzata e perfondere per 8 ore.
- Perfondere con acqua deionizzata durante la notte per lavare via SDS e DOC per 24 ore.
- Resecare il cuore e i polmoni decellularizzati sezionando i suoi attaccamenti al torace usando una forbice curva e conservare in un criotubo sterile con acqua deionizzata con l'1% (v / v) di penicillina-streptomicina e 0,3 μM di azide di sodio a 4 ° C. Gli scaffold ECM possono essere conservati per almeno 12 settimane1. Se l'impalcatura verrà utilizzata per l'analisi biochimica (ad esempio, la spettrometria di massa), il congelamento a scatto in azoto liquido.
3. Immunocolorazione
- Pianificare l'imaging: determinare l'anticorpo primario (o anticorpi) e la combinazione di anticorpi secondari coniugati fluorescentemente per abbinarsi tra loro e adattarsi alle linee laser del microscopio a fluorescenza.
- Bloccare il campione immergendolo in un criotubo contenente il 6% (v/v) di siero d'asino - il 3% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) durante la notte.
- Incubare con anticorpi primari (o anticorpi) in siero d'asino al 3% in PBS per 24 ore.
- Lavare 5 volte per 1 ora ogni volta in 0,05% interpolazione 20 in PBS (PBST).
- Incubare il campione con anticorpi secondari coniugati fluorescenti (o anticorpi) in siero d'asino al 3% in PBS per 24 ore.
- Lavare 5 volte per 1 ora nello 0,05% (PBST). Attendere 1 ora tra ogni lavaggio.
- Aggiungere acqua deionizzata e conservare a 4 °C al riparo dalla luce diretta. A questo punto, l'impalcatura è pronta per l'immagine.
4. Imaging
- Posizionare il campione in un piatto con fondo di vetro e umidificarlo con due goccioline di soluzione di conservazione (PBS o acqua deionizzata).
- Prepara l'obiettivo. Si consiglia di utilizzare un obiettivo di immersione in acqua.
- Ispezionare il campione utilizzando la luce a fluorescenza.
- Passare al controllo del computer. Accendi i laser e regola l'intensità del laser, l'apertura stenopeica, le lunghezze d'onda dei rilevatori, il guadagno, la risoluzione e lo zoom. Imposta il numero e la dimensione del passo per z-stack e inizia l'acquisizione. Si consiglia di utilizzare l'eccitazione laser multifotonica per aumentare la penetrazione dei tessuti e ridurre al minimo la dispersione della luce, lo sbiancamento e il danno tissutale.
5. Colorazione dell'ematossilina-eosina
- Asportazione 1 lobo polmonare da un topo eutanasizzato.
- Posizionare in un criostampo di 10 mm x 10 mm x 5 mm e coprirlo con circa 500 μL di composto OCT.
- Congelare su ghiaccio secco (-70 °C) e mantenere il campione a tale temperatura.
- Asportare un lobo polmonare decellularizzato da un topo trasformato secondo il passaggio 2.5.
- Porre in un criostampo con la superficie più grande verso il basso e coprirlo con un composto OCT come specificato al punto 5.2.
- Congelare su ghiaccio secco (-70°C) e mantenere il campione a quella temperatura fino a quando non sarà altrimenti richiesto. Il campione può essere conservato per almeno 12 settimane.
- Sezione blocchi di tessuto congelato a -20 °C in un criostato con spessore di 5 μm e posizionare sezioni su vetrini adesivi e conservare a -80 °C.
- Portare le diapositive a temperatura ambiente fino a quando non si asciugano all'aria (circa 20 minuti).
- Immergere brevemente in PBS e fissare immergendo i vetrini nel 4% di paraformaldeide in PBS per 15 min. Lavare una volta in PBS per 5 minuti, quindi due volte in acqua distillata per 5 minuti.
- Immergere nella soluzione di ematossilina di Mayer per 10 minuti. Questo tempo può essere ottimizzato in base alla fonte del tessuto e alla preparazione delle macchie.
- Lavare in un barattolo coplin sotto acqua distillata corrente per 10 minuti.
- Immergere in soluzione di eosina per 7 min. Questo tempo può essere ottimizzato in base alla fonte del tessuto e alla preparazione delle macchie.
- Immergere in etanolo al 50% per rimuovere l'eccesso di Eosina e disidratarlo immergendo brevemente in etanolo al 70% e in etanolo al 96% e al 100% per 30 secondi. Immergere nello xilene più volte.
- Applicare alcune gocce di supporto di montaggio DPX e posizionare una copertura in vetro.
- Lasciare asciugare le diapositive durante la notte sotto un cappuccio chimico.
- Scansione delle diapositive in uno scanner di diapositive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularizzazione cardiopolmonare
Dopo aver completato con successo il protocollo, il cuore e i polmoni, così come il tessuto annesso come l'arco aortico, saranno privi di cellule. La decellularizzazione può essere convalidata mediante colorazione ematossilina-eosina (Figura 1) degli scaffold ECM che mostrano la rimozione dei nuclei rispetto al tessuto nativo. Queste impalcature mantengono le dimensioni degli organi freschi e la sua struttura ECM insolubile è intatta2. La Figura 2 mostra una rappresentazione schematica dei passaggi chirurgici chiave necessari per perfondere con successo il complesso cardio-polmonare del topo.
ECM Imaging
In un ambiente standard, gli anticorpi secondari possono essere utilizzati nei canali di fluorescenza verde, rosso e rosso lontano (ad esempio, rilevamento di lunghezze d'onda 488 nm, 555 nm / 594 nm e 647 nm); l'aggiunta di imaging di seconda generazione di armoniche (SHG) utilizzando l'eccitazione a 2 fotoni rivelerà il collagene fibrillare. L'eccitazione laser può incitare l'autofluorescenza tissutale e deve essere applicata cautela quando lo si utilizza con fluorescenza verde, in quanto potrebbe confondere i dati di imaging. Un modo semplice per convalidare l'autofluorescenza è quello di visualizzare un tessuto di controllo non macchiato e impostare l'intensità del laser e il guadagno del rilevatore di conseguenza e confrontarlo con la colorazione degli anticorpi. Tuttavia, questa autofluorescenza può essere utilizzata come vantaggio, in quanto può esporre l'elastina negli scaffold polmonari.
Gli scaffold ECM hanno mostrato una maggiore permeabilità e penetrabilità della luce2. L'utilizzo di questo protocollo con uno stadio di microscopio motorizzato consente l'imaging tridimensionale e piastrellato di campioni a montaggio intero) a risoluzione submicronica (Figura 3). Nel caso in cui sia necessario sezionare il tessuto (ad esempio, per visualizzare le pareti cardiache o il parenchima polmonare profondo), il tessuto deve essere sezionato con un bisturi affilato prima di condurre la colorazione.
Figura 1. Convalida della decellularizzazione. Colorazione di ematossilina-eosina di campioni congelati a scatto da polmoni e cuore nativi e decellularizzati. Si noti l'assenza di nuclei in campioni decellularizzati. Tutte le bilance in micron. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Schema di microchirurgia che mostra i passaggi chiave necessari per decellularizzare il complesso cardio-polmonare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immunocolorazione proteica multipla rappresentativa dei polmoni di topo PyMT decellularizzati da un topo femmina di 11 settimane. Mosaico di piastrelle che mostra la proiezione massima di una z-stack. L'inserto 1 mostra la pleura. L'inserto 2 mostra un parenchima ECM normale. L'inserto 3 mostra un bronchiolo. I colori sono stati resi accessibili per i daltonici. Tutte le bilance in micron. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le tecniche di decellularizzazione basate sull'agitazione tissutale alterano la struttura dell'ECM, rendendole inadatte all'analisi della struttura ECM4. La decellularizzazione perfusione, utilizzando una via anatomica come l'aorta della trachea, permette di raggiungere il letto capillare, o alveoli terminali, e facilita la consegna di agenti decellularizzanti in tutto l'organo. L'uso di detergenti zwitterionionici, anionici e non ionici per decellularizzare il tessuto è segnalato4,5,6, tuttavia, il sodio dodecil solfato (SDS, anionico) linearizza il collagene fibrillare nel grasso del topo pad2 ma non nei polmoni; questo suggerisce che la scelta del detergente deve essere ottimizzata, adattandosi al tessuto bersaglio per mantenere la struttura ECM. I metodi di compensazione dei tessuti potrebbero plausibilmente essere utilizzati per l'analisi ECM, sebbene richiedano sostanze chimiche che possono modificare la reticolazione ECM e dimensioni dei tessuti7,8,9. Mentre la trasparenza dei tessuti acquisiti consente una migliore imaging microscopico, la presenza di cellule peggiora significativamente la penetrazione degli anticorpi e può coprire gli epitopi / proteine ECM. L'isolamento e l'imaging di ECM intatti consente l'analisi quantitativa della sua struttura con strumenti analitici2,10, mappando la sua composizione2 e aprendo la strada a ulteriori esami biochimici ECM.
La dissezione e la legatura dei vasi principali e il conseguente isolamento della circolazione coronarica e polmonare è necessario per ottenere una pressione uniforme delle soluzioni perfuse in tutti i tessuti. Pertanto, questo protocollo dipende dall'esperienza microchirurgica dell'operatore principale. È fondamentale operare con precisione, in modo da preservare intatti vasi, polmoni e cuore. Eseguire questo protocollo ripetutamente per comprendere l'anatomia tridimensionale del torace è fondamentale per ottenere risultati coerenti.
La procedura chirurgica mostrata qui riassume i passaggi di base per accedere alla vascolarizzazione del topo1,2 e agli organi nel suo territorio. Cambiando il modello di legatura, è possibile accedere alla testa e al collo, agli arti anteriori e ai cuscinetti di grasso. Utilizzando le stesse abilità, è possibile decellularizzare gli organi sub-diaframmatici.
Altrettanto importante è l'attenta progettazione della configurazione immunocolorante. In precedenza abbiamo compilato un catalogo di anticorpi validati contro le proteine strutturali ECM3. La configurazione standard può rivelare fino a tre proteine e collagene fibrillare contemporaneamente, consentendo l'esame incrociato.
Il significato di questo metodo risiede nella possibilità di ottenere scaffold ECM strutturalmente e dimensionalmente intatti. La decostruzione di un tessuto complesso in componenti discreti è uno degli obiettivi fondamentali della bioingegneria; mentre è relativamente semplice isolare le cellule, o il sangue, da un organo, non c'erano metodi per ottenere la sua impalcatura ECM. Questo era particolarmente vero per i tumori, ma il metodo qui presentato apre la strada all'isolamento ECM in qualsiasi ceppo di topo per l'analisi anatomica e biochimica dell'ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la Prof.ssa Ivana Novak e la Dott.ssa Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Università di Copenaghen) per aver fornito l'accesso al microscopio. Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR e JTE); una borsa di dottorato della Lundbeck Foundation (R286-2018-621; MR); il Consiglio svedese della ricerca (2017-03389; CDM); la Swedish Cancer Society, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj e 190007; CDM); Aiuto tedesco contro il cancro (Deutsche Krebshilfe; RR); e la Danish Cancer Society (R204-A12454; RR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
