Summary
이 프로토콜은 탈세포 쥐 신장을 사용하여 발판을 개발하는 방법을 소개합니다. 이 프로토콜에는 생체 이용률을 확인하기 위한 탈세포화 및 재세포화 프로세스가 포함됩니다. 탈세포화는 트리톤 X-100 및 나트륨 도데킬 황산염을 사용하여 수행됩니다.
Abstract
조직 공학은 생물 의학의 최첨단 분야입니다. 세포 배양 기술은 질병또는 손상된 기관을 대체하기 위하여 기능적인 조직 및 기관의 재생을 위해 적용될 수 있습니다. 비폴드는 생체 내에서 분화 된 줄기 세포를 사용하여 3 차원 기관 또는 조직의 생성을 용이하게하기 위해 필요합니다. 이 보고에서는, 우리는 탈세포쥐 신장을 사용하여 혈관 비계를 개발하기 위한 새로운 방법을 기술합니다. 8주된 스프라그-Dawley 쥐는 이 연구에서 사용되었고, 헤파린이 신장 혈관으로 유입되는 것을 용이하게 하기 위해 심장에 주입되어 헤파린이 신장 혈관으로 침투할 수 있게 했습니다. 복강이 열리고 왼쪽 신장이 수집되었습니다. 수집된 신장은 트리톤 X-100 및 나트륨 도데실 황산염과 같은 세제를 사용하여 9시간 동안 침투하여 조직을 탈세포화했다. 탈세포 신장 비계는 세포 파편 및 화학 잔류물을 제거하기 위해 1 % 페니실린 / 연쇄 상절제술 및 헤파린으로 부드럽게 세척되었습니다. 탈세포화된 혈관 비계를 가진 줄기 세포의 이식은 새로운 기관의 생성을 용이하게 할 것으로 예상된다. 따라서, 혈관비계는 미래에 장기 이식의 조직 공학을 위한 기초를 제공할 수 있다.
Introduction
세포 배양 기술은 질병또는 손상된 기관을 대체하기 위하여 기능적인 조직 및 기관의 재생을 위해 적용됩니다. 동종 성 장기 이식은 현재 돌이킬 수없는 장기 손상에 대한 가장 흔한 치료법입니다. 그러나, 이 접근법은 이식된 기관의 거부를 방지하기 위하여 면역 억제의 사용을 요구합니다. 더욱이, 이식 면역학에 있는 어드밴스에 있는 어드밴스에 도불구하고, 이식 수령인의 20%는 5 년 안에 심각한 거부를 경험할 수 있고, 이식 후에 10 년 안에, 수령인의 40%는 그들의 이식한 이식편을 분실하거나1을정지할 수 있습니다.
조직 공학 기술의 발전은 분화 된 줄기 세포를 사용하여 면역 거부없이 새로운 기관의 이식을위한 새로운 패러다임에서 산출했다. 줄기 세포 분화 후, 합성 세포 외 매트릭스라고 불리는 비계는 3 차원 장기의 생성을 용이하게하고 새로운 조직이 받는 사람 내에서 번창 할 수 있도록 하는 데 필요합니다. 탈세포 된 네이티브 장기에서 스캐폴드는 세포의 확립과 줄기 세포 증식의 향상을위한 보다 효과적인 환경을 포함하여 장점이 있지만 이러한 메커니즘은 완전히 해명되지 않았습니다2. 특히, 신장은 줄기세포 설립을 위한 풍부한 순환과 틈새 시장을 가지고 있기 때문에 스캐폴드 생성에 적합한 기관이다. 또한 신장의 복잡한 구조 로 인해 장기 이식을 위해 신장을 인위적으로 재생하기가 어렵습니다.
이 보고서에서는 조직 공학 을 위해 미래의 동물 연구를 용이하게하기 위해 쥐 모델에서 탈세포 기관을 사용하여 혈관으로 된 비계를 개발하는 방법을 소개합니다.
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Protocol
이 연구는 부산국립의과대학의 행정에 의해 승인되었으며 동물의 사용과 관리에 대한 윤리적 지침에 따라 수행되었습니다. (인증서 번호 2017-119). 동물 연구에 앞서 제도적 승인을 받아야 합니다.
참고: 성공적인 수술 프리젠 테이션 및 복부 장기의 이미징에 권장되는 모든 수술 및 마취 기구 / 장비 및 시약은 표 1에자세히 설명되어 있습니다.
1. 쥐 신장 수확 준비 절차
- 수술을 준비하기 위해 8주된 스프라그-Dawley 쥐(200-250g의 무게)를 온난화 패드에 놓습니다. 직장 온도계 프로브를 직장에 배치하여 코어 온도를 모니터링합니다.
- 이소플루란 가스의 5%의 혼합물로 쥐를 마취시킵니다(유도: 5%, 유지 보수: 3%).
- 수술을 시작하려면 마취 투여 후 쥐를 척추 위치에 놓습니다. 테이프로 작동 테이블에 쥐의 네 개의 사지를 장착합니다.
- 세균성 비누로 기증자 쥐의 복부를 면도하고 청소하십시오. 2% 베타딘을 1-2분 이상 바르고 70% 에탄올 용액으로 닦아냅니다. 이 시퀀스를 세 번 반복합니다.
- 멸균 펜에스테디드 드레이프로 수술장을 덮어보아 보입니다.
- 수직 복부 절개를 하고 왼쪽 신장, 요관, 복부 대어타 및 열등한 베나 카바를 노출시하십시오.
- 페디클을 절단하기 직전에 왼쪽 신장, 요관, 복부 대동맥 및 열등한 베나 카바를 시각화하고 해부합니다.
2. 경내 관류
- 수술 전에 관류 용액을 준비하십시오.
- 쥐 당 관류 용액 50mL를 만드십시오.
- 약 10 U / mL 헤파린과 1 x PBS를 혼합 (1 25 kU 바이알은 PBS + Hep의 2.5 L을 만들 것입니다).
- 동일한 볼륨8% 파라포름알데히드를 1x PBS와 혼합하여 4% PFA/1xPBS 솔루션을 만듭니다.
참고: 물로 만든 8% PFA는 최대 2개월 동안 4°C로 보관할 수 있습니다. 그러나 PBS에서 희석된 PFA의 4%는 4°C에서 1주일 동안만 안정적입니다. 희석을 신선하게 만듭니다.
- 수직 복부 절개를 미친 듯이 확장합니다. 내부 장기에 손상을 입히는 것을 피하기 위해 절단 할 때 장기에서 가위를 멀리 그려야합니다.
- 흉곽을 통해 절개를 계속 한 다음 흉골을 들어 올려 다이어프램을 잘라냅니다.
- 피부의 느슨한 플랩을 방해하지 않고 집게로 결합 조직을 찢어서 심장을 풀어 놓습니다.
주의: 가위를 사용하여 심장을 해방시키지 마십시오. - 인산염 완충식식염(PBS) 라인을 열고 바늘을 왼쪽 심실에 넣기 전에 라인이 흐르는지 확인합니다. 무딘 집게로 심장을 부드럽게 잡고, 바늘을 제어하는 hemostat을 사용합니다. 바늘은 1/4 인치 이하를 삽입해야합니다.
참고: 1/4 인치보다 큰 삽입은 조직의 다른 쪽으로 천포를 초래할 수 있습니다. - 바늘과 헤모스타트로 심장을 지탱하는 동안, 오른쪽 아트리움을 찾아 iridectomy 가위로 스니핑하십시오. 쥐의 몸에 hemostat을 휴식, 바늘은 여전히 심장 내부에 위치 되어 있는지 확인.
참고 : 절단이 충분하면, 쥐로 흐르는 PBS의 압력이 완화됨에 따라 신체 구멍에 혈액이 있어야합니다. - 조심스럽게 앞발과 피부 플랩을 해제합니다.
- 신장과 간에서 아직도 보이는 혈액이 있는 경우에 4 분 이상 PBS를 퍼플 계속합니다.
3. 신장 수확 및 탈세포화
- 복부 대오르타와 열등한 베나 카바를 곁들인 왼쪽 신장을 수확하십시오.
- 요관, 흉부 대어타, 우수한 베나 카바 및 복부 대어타 가지를 리게이트하십시오.
- 10cm 페트리 접시에 덜벡코의 PBS(DPBS)에서 수분을 공급하는 오르간을 보관하십시오.
- 23 게이지 카테터로 복부 대오르타와 열등한 베나 카바를 캔터. 잔류 혈액을 제거하려면, 연동 펌프와 캐뉼라를 연결하고, 37 °C에서 5 rpm의 속도로 90 분 동안 DPBS (500 mL) 및 16 U / mL 헤파린으로 세척하십시오.
- 신장을 탈세포화하기 위하여는, 신장을 3시간 동안 1% 트리톤 X-100(1 L)으로, 그리고 0.75% 나트륨 도데실 황산염(SDS) 용액(2L)을 6h에 40mmHg의 일정한 압력으로 퍼피한다.
참고 : 신장은 8 시간 후에 투명해질 것입니다. - 잔류 SDS를 제거하려면 18시간(1박)에 증류수(6L)에 페니실린1%의 페니실린을 사용한 다음 멸균 DPBS(500mL) 및 16 U/mL 헤파린을 90분 동안 분리한다.
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Representative Results
쥐 신장의 총 형태는 어두운 빨간색이었다(도 1A). 탈세포화 후 신장은 창백하고 반투명하게되었다(도 1D). 잔류 유전체 DNA는 제조업체의 지시에 따라 상용 키트로 평가되었으며, 세포탈신장 비계에서, 그리고 네이티브 신장(대조군)과 비교하였다. 정량 분석은 조직 게놈 DNA가 탈세포화 후에 거의 제거되었다는 것을 확인했습니다. 14건에서, 평균 DNA 함량은 대조군을 위한 115.05 ng/μL이고 탈세포화된 비계에 대해 1.96 ng/μL이었다. 총 98.3%의 DNA가 제거되었다(도2),3차원구조가 유지되었지만, 세포세포 그로메룰리는 피질 적당한 종내(도3)에보존되었다.
그림 1: 신장 동맥 관류 탈세포화를 실시하는 쥐 신장. (A)탈세포화가 시작된 직후. (B)트리톤 X-100 치료 후. (C)SDS 버퍼 처리 후. (D)하룻밤 스캐폴드 세척 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 대조군 및 탈세포래 신장의 DNA 농도는 탈세포화 후 감소된 DNA 내용을 보여주는 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 헤마톡슬린과 에신의 통제 및 탈세포 신장 샘플. (A)대조피질(A) 탈세포피질(B) 대조군 메둘라(B) 탈세포화된 수질(C) 대조군정맥(C)탈세포정맥. 스케일 바, 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기관 및 기타 조직의 세포 탈세포화에 다양한 프로토콜이 사용되었습니다. 최적의 탈세포화 프로토콜은 세포외 매트릭스(ECM)의 3차원 아키텍처를 보존해야 한다. 일반적으로, 이러한 프로토콜은 물리적 처리 또는 이온 용액에 의해 세포막을 용인하고, 효소 처리 또는 세제에 의해 ECM으로부터 세포질 과 핵을 해리한 다음, 조직3으로부터세포 이물질을 제거하는 것으로 구성된다. 물리적 프로세스에는 스크레이핑, 용액 교반, 압력 그라데이션, 스냅 동결, 비열 영구 전기 기화 및 초임계 유체2가포함됩니다. 피부 또는 소장과 같은 조직 또는 장기의 외부 표면에 있는 세포는 효소4와결합된 기계적 과정에 의해 효율적으로 제거될 수 있다. 이온 또는 니어니언 세제는 DNA/단백질 상호작용, 지질 및 지단백질을 용해하지만 ECM 구조5를손상시킬 수 있다. 효소는 해리된 세포질 및 핵 물질을 제거하지만, 이러한 물질을 면역 반응을 일으킬 수 있는 ECM에 둡니다6. 탈세포화를 위한 최적 제제는 조직 두께 및 밀도 또는 탈세포 조직의 임상 적 사용에 의해 결정된다.
탈세포화를 위해, 우리는 nonionic와 이온 세제의 조합을 사용했습니다: Triton X-100 및 SDS. 트리톤 X-100은 니오니언 세제로서 지질/지질 및 지질/단백질 상호 작용을 효과적으로 방해합니다. 그러나 트리톤 X-100은 글리코아미노글리산(GAG), 라미닌 및 섬유네틴 함량의 손실로 인해 ECM 초구조를 파괴할 수도 있다. SDS는 이온 세제로서 핵 잔재와 세포질 단백질을 효과적으로 제거하지만 GAG 및 콜라겐3의손실로 ECM 초구조를 방해합니다. 이들 제제는 ECM, SDS 및 Triton X-100의 미세 구조를 파괴하지만 모든 DNA내용7,8을성공적으로제거한다. 이것은 발판 안에 남아 있는 DNA 콘텐츠가 면역 거부를 일으키는 원인이 될 수 있기 때문에 필수적입니다. 제대로 탈세포화 된 조직에서 DNA 함량은 50 ng / mg9미만이어야하며10.
이 방법에서, 탈세포화 관류의 압력은 40mmHg이었다. 세포 분해 관류에는 압력 제어가 필요합니다. 최적의 관류 압력은 장기마다 다르며, 60 mmHg는 인간 및 돼지 신장 또는 심장탈세포화(11)에대한 최적의 압력이다. 쥐에서, 40 mmHg는 탈세포화 관류(12)에충분하다고 여겨진다.
동종 이식 이식을 대체하기위한 하나의 유망한 치료는 혈관 비계를 사용하여 줄기 세포의 이식입니다. 우리는 장기 탈세포화를 위한 이 프로토콜이 미래 조직 공학 연구 결과를 위한 기초를 제공할 수 있기를 바랍니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 부산대학교병원의 생물의학연구소 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
References
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