Summary
Denne protokollen introduserer en metode for å utvikle et stillas ved hjelp av decellulariserte rotte nyrer. Protokollen inkluderer decellulariserings- og recellulariseringsprosesser for å bekrefte biotilgjengelighet. Decellularisering utføres ved hjelp av Triton X-100 og natrium dodecylsulfat.
Abstract
Vevsteknikk er en banebrytende disiplin innen biomedisin. Cellekulturteknikker kan brukes til regenerering av funksjonell vev og organer for å erstatte syke eller skadede organer. Stillas er nødvendig for å lette genereringen av tredimensjonale organer eller vev ved hjelp av differensierte stamceller in vivo. I denne rapporten beskriver vi en ny metode for å utvikle vaskulære stillaser ved hjelp av decellulariserte rotte nyrer. Åtte uker gamle Sprague-Dawley rotter ble brukt i denne studien, og heparin ble injisert i hjertet for å lette strømmen inn i nyrefartøyene, slik at heparin kunne parfyme inn i nyrefartøyene. Bukhulen ble åpnet, og venstre nyre ble samlet inn. De innsamlede nyrene ble perfundert i 9 timer ved hjelp av vaskemidler, som Triton X-100 og natriumdedylsulfat, for å decellularisere vevet. Decellulariserte nyre stillaser ble deretter forsiktig vasket med 1% penicillin / streptomycin og heparin for å fjerne cellulær rusk og kjemiske rester. Transplantasjon av stamceller med decellulariserte vaskulære stillasene forventes å lette genereringen av nye organer. Dermed kan de vaskulære stillasene gi grunnlag for vevsteknikk av organtransplantater i fremtiden.
Introduction
Cellekulturteknikker brukes til regenerering av funksjonell vev og organer for å erstatte syke eller skadede organer. Allogen organtransplantasjon er for tiden den vanligste behandlingen for irreversibel organskade; Denne tilnærmingen krever imidlertid bruk av immunsuppresjon for å forhindre avvisning av det transplanterte organet. Videre, til tross for fremskritt innen transplantasjonsimmunologi, kan 20% av transplantasjonsmottakerne oppleve akutt avvisning innen 5 år, og innen 10 år etter transplantasjon kan 40% av mottakerne miste sin transplanterte graft eller dø1.
Fremskritt innen vevsteknologier har gitt i et nytt paradigme for transplantasjon av nye organer uten immunavvisning ved hjelp av differensierte stamceller. Etter stamcelledifferensiering er det nødvendig med et stillas, kalt en syntetisk ekstracellulær matrise, for å lette genereringen av tredimensjonale organer og gjøre det nye vevet i stand til å trives i mottakeren. Stillaser fra decellulariserte innfødte organer har fordeler, inkludert et mer effektivt miljø for etablering av celler og forbedring av stamcelleproliferasjon, selv om disse mekanismene ikke er fullstendig belyst2. Spesielt er nyrene et passende organ for stillasgenerering fordi den har rikelig sirkulasjon og en nisje for stamcelleetablissement. I tillegg, på grunn av nyrens komplekse struktur, er det vanskelig å kunstig regenerere nyrer for organtransplantasjon.
I denne rapporten introduserer vi en metode for å utvikle vaskulære stillaser ved hjelp av decellulariserte organer i en rottemodell for å lette fremtidige dyrestudier for vevsteknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av administrasjonen av Pusan National University of Medicine og ble utført i samsvar med etiske retningslinjer for bruk og pleie av dyr. (sertifikat nr. 2017-119). Før noen dyrestudier bør institusjonell godkjenning oppnås.
MERK: Alle kirurgiske instrumenter og bedøvelsesmidler/utstyr og reagenser som anbefales for vellykket kirurgisk presentasjon og avbildning av bukorganer er beskrevet i tabell 1.
1. Forberedelsesprosedyrer for høsting av rotte nyrer
- Som forberedelse til operasjonen, plasser 8 uker gamle Sprague-Dawley rotter (veier 200-250 g) på en oppvarmingspute. Plasser en rektal termometerprobe i endetarmen for å overvåke kjernetemperaturen.
- Bedøv rotten med en 5% blanding av isoflurangass (induksjon: 5%, vedlikehold: 3%).
- For å starte operasjonen, plasser rotten i en liggende stilling etter administrering av anestesi. Monter de fire lemmer av rotten på operasjonsbordet med tape.
- Barber og rengjør magen til donorrotten med bakteriedrepende såpe. Påfør 2% betadin i minst 1-2 min, og tørk med en 70% etanoloppløsning. Gjenta denne sekvensen tre ganger.
- Dekk operasjonsfeltet med en steril fenestert gardin.
- Lag et vertikalt abdominal snitt og eksponer venstre nyre, urinleder, abdominal aorta og dårligere vena cava.
- Visualiser og disseker venstre nyre, urinleder, abdominal aorta og dårligere vena cava like før du kutter pedicle.
2. Transkardiale perfusjon
- Før operasjonen, forberede perfusjonsløsningen.
- Lag 50 ml perfusjonsløsning per rotte.
- Bland 1x PBS med ca. 10 U/ml heparin (1 25 kU hetteglass vil lage 2,5 L PBS+Hep).
- Bland like store mengder 8 % paraformaldehyd med 1x PBS for å lage 4 % PFA/1xPBS-oppløsning.
MERK: 8 % PFA laget i vann kan oppbevares ved 4 °C i opptil 2 måneder. Imidlertid er 4% PFA fortynnet i PBS bare stabil i 1 uke ved 4 °C. Gjør fortynning frisk.
- Utvid det vertikale abdominal snittet kranialt. Pass på å trekke saksen bort fra organene når du kutter for å unngå å skade de indre organene.
- Fortsett snittet gjennom ribbeburet, og kutt deretter gjennom membranen ved å løfte brystbenet.
- Fest den løse hudklaffen ut av veien, og frigjør hjertet ved å rive ethvert bindevev med tangene.
FORSIKTIG: Ikke bruk saksen til å frigjøre hjertet, og dette kan føre til uønsket blødning. - Åpne den fosfatbufrede saltvannslinjen (PBS) og sørg for at linjen flyter før du plasserer nålen i venstre ventrikel. Hold hjertet forsiktig med stumpe tang, og bruk en hemostat til å kontrollere nålen. Kanylen skal ikke settes inn mer enn 1/4 tommer.
MERK: Innsetting som er større enn 1/4 tomme kan føre til perforering på den andre siden av vevet. - Mens du støtter hjertet med nålen og hemostat, finn riktig atrium og klipp gjennom det med iridectomy saks. Hvil hemostaten på rottens kropp, og sørg for at nålen fortsatt er plassert inne i hjertet.
MERK: Hvis kuttet er tilstrekkelig, bør det være blod i kroppshulen da trykket fra PBS som strømmer inn i rotten er lettet. - Løsne forsiktig de fremer føttene og hudklaffen.
- Fortsett parfymerende PBS i 4 min eller lenger hvis det fortsatt er blod synlig i nyre og lever.
3. Nyrehøsting og decellularisering
- Høst venstre nyre med abdominal aorta og dårligere vena cava.
- Ligate urinlederen, thoracic aorta, overlegen vena cava, og grener av abdominal aorta.
- Oppbevar orgelet hydrert i Dulbeccos PBS (DPBS) i en 10 cm Petri-tallerken.
- Kanylere abdominal aorta og dårligere vena cava med et 23 Gauge kateter. For å fjerne gjenværende blod, koble kanylen med en peristaltisk pumpe, og vask med DPBS (500 ml) og 16 U / ml heparin i 90 minutter med en hastighet på 5 rpm ved 37 °C.
- For å decellularisere nyrene, perfuse nyrene med 1% Triton X-100 (1 L) i 3 timer og deretter med 0,75% natrium dodecyl sulfat (SDS) løsning (2 L) i 6 timer ved et konstant trykk på 40 mmHg.
MERK: Nyrene blir gjennomsiktige etter 8 timer. - For å fjerne gjenværende SDS, perse prøven med 1% penicillin i destillert vann (6 L) i 18 timer (over natten) og deretter med steril DPBS (500 ml) og 16 U / ml heparin i 90 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den grove morfologien til rotte nyrer var mørk rød (Figur 1A). Etter decellularisering ble nyrene ble bleke og gjennomskinnelige (Figur 1D). Resterende genomisk DNA ble vurdert med et kommersielt sett i henhold til produsentens instruksjoner, i decellulariserte nyrestillaser og sammenlignet med det i innfødte nyrer (kontroll). Kvantitativ analyse bekreftet at vevsgenomisk DNA nesten ble eliminert etter decellularisering. Fra 14 tilfeller var det gjennomsnittlige DNA-innholdet 115,05 ng/μL for kontrollen og 1,96 ng/μL for det decellulæriserte stillaset. Totalt ble 98,3% av DNA fjernet (Figur 2), selv om den tredimensjonale strukturen ble opprettholdt, og acellulær gromeruli ble bevart i kortikale parenchyma (Figur 3).
Figur 1: Rotte nyrer utsatt for nyrearteriell perfusjon decellularisering. (A) Umiddelbart etter starten av decellulariseringen. (B) Etter Triton X-100 behandling. (C) Etter SDS-bufferbehandling. (D) Etter nattlig stillasvask. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: DNA-konsentrasjoner i kontroll og decellulariserte rotte nyrer, som viser redusert DNA-innhold etter decellularisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Hematoksylin og eosinfarging av kontroll og decellulæriserte nyreprøver. (A) kontroll cortex (A ') decellularisert cortex (B) kontroll medulla ( B') decellularisert medulla (C) kontroll vene (C ') decellularisert vene. Skalalinje, 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ulike protokoller har blitt brukt til decellularisering av organer og andre vev. Den optimale decellulariseringsprotokollen bør bevare den tredimensjonale arkitekturen til den ekstracellulære matrisen (ECM). Generelt består slike protokoller av å lyse cellemembranen ved fysisk behandling eller ioniske løsninger, dissosiere cytoplasma og kjerne fra ECM ved enzymatisk behandling eller vaskemidler, og deretter fjerne cellulært rusk fra vevet3. Fysiske prosesser inkluderer skraping, løsnings agitasjon, trykkstigninger, snap-frysing, ikke-amerikansk permanent elektroporasjon og superkritiske væsker2. Celler på den ytre overflaten av et vev eller organ, som hud eller tynntarmen, kan effektivt fjernes av mekaniske prosesser kombinert med enzymer4. Ioniske eller ikke-ioniske vaskemidler oppløser DNA/ proteininteraksjoner, lipider og lipoproteiner, men kan skade ECM-strukturen5. Enzymer fjerner dissosiert cytoplasma og kjernefysisk materiale, men la disse materialene i ECM, noe som kan forårsake immunrespons6. De optimale midlene for decellularisering bestemmes av vevstykkelse og tetthet eller klinisk bruk av det decellulariserte vevet.
For decellularisering brukte vi en kombinasjon av ikke-ioniske og ioniske vaskemidler: Triton X-100 og SDS. Triton X-100, som et ikke-ionisk vaskemiddel, forstyrrer effektivt lipid/ lipid- og lipid / proteininteraksjoner. Triton X-100 kan imidlertid også ødelegge ECM ultrastruktur på grunn av tap av glykosaminoglykan (GAG), laminin og fibronektininnhold. SDS, som et ionisk vaskemiddel, fjerner effektivt kjernefysiske rester og cytoplasmatiske proteiner, men forstyrrer også ECM ultrastruktur ved tap av GAG og kollagen3. Selv om disse midlene ødelegger mikrostrukturen til ECM, fjerner SDS og Triton X-100 vellykket alt DNA-innhold7,8. Dette er viktig fordi gjenværende DNA-innhold i et stillas kan forårsake immunavvisning. I vev som har blitt riktig decellularisert, bør DNA-innholdet være mindre enn 50 ng / mg9,10.
I metoden var trykket av decellulariseringsperfusjonen 40 mmHg. Trykkkontroll er nødvendig for decellulariseringsperfusjon. Det optimale perfusjonstrykket varierer fra organ til organ, og 60 mmHg er det optimale trykket for human og porcin nyre eller hjertedecellularisering11. Hos rotter anses 40 mmHg tilstrekkelig for decellularisering perfusjon12.
En lovende behandling for å erstatte allografttransplantasjon er transplantasjon av stamceller ved hjelp av et vaskulært stillas. Vi håper at denne protokollen for organdecellularisering kan gi grunnlag for fremtidige vevsteknikkstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av et Biomedical Research Institute Grant fra Pusan National University Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
References
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al.
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
