Summary
该协议引入了使用去细胞化的鼠肾开发脚手架的方法。该协议包括去细胞化和再细胞化过程，以确认生物可用性。脱细胞化使用三顿X-100和硫酸钠进行。
Abstract
组织工程是生物医学领域的前沿学科。细胞培养技术可用于功能组织和器官的再生，以取代患病或受损的器官。需要脚手架，以便于在体内使用分化干细胞产生三维器官或组织。在这份报告中，我们描述了一种使用去细胞化的老鼠肾脏开发血管化脚手架的新方法。这项研究使用了8周大的斯普拉格-道利大鼠，肝素被注射到心脏，以方便流入肾脏血管，使肝素渗透到肾脏血管中。腹腔被打开，左肾被收集。收集的肾脏使用洗涤剂，如Triton X-100和硫酸钠，以去细胞化组织，灌注了9小时。然后用1%青霉素/链霉素和肝素轻轻清洗去除细胞碎片和化学残留物。用去细胞化血管脚手架移植干细胞有望促进新器官的产生。因此，血管化脚手架可能为将来器官移植组织工程奠定基础。
Introduction
细胞培养技术应用于功能组织和器官的再生，以取代患病或受损的器官。同源器官移植是目前最常见的不可逆转器官损伤治疗方法：然而，这种方法需要使用免疫抑制，以防止移植器官的排斥。此外，尽管移植免疫学有所进展，但20%的移植接受者可能在5年内出现急性排斥，在移植后10年内，40%的接受者可能失去移植移植或死亡1。
组织工程技术的进步为移植新器官带来了新的范式，无需使用分化干细胞进行免疫排斥。干细胞分化后，需要一种称为合成细胞外基质的脚手架，以促进三维器官的生成，使新的组织在受体内茁壮成长。来自去细胞化原生器官的脚手架具有优势，包括建立细胞和增强干细胞增殖的更有效的环境，尽管这些机制尚未完全阐明2。特别是，肾脏是脚手架生成的合适器官，因为它具有丰富的循环和干细胞建立的利基。此外，由于肾脏结构复杂，很难人工再生肾脏进行器官移植。
在本报告中，我们介绍了一种利用大鼠模型中去细胞化器官开发血管化脚手架的方法，以促进未来用于组织工程目的的动物研究。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这项研究得到了釜山国立医科大学的批准，是按照动物使用和护理的道德准则进行的。（2017-119号证书）。在进行任何动物研究之前，应获得机构批准。
注：建议成功进行腹部器官手术演示和成像的所有手术和麻醉器/设备和试剂均详见表1。
1. 大鼠肾脏收获的准备程序
- 在准备手术时，将8周大的斯普拉格-道利大鼠（重200-250克）放在暖垫上。在直肠中放置直肠温度计探头以监测核心温度。
- 用5%的异氟烷气体混合物麻醉大鼠（诱导：5%，维护：3%）。
- 要开始手术，在麻醉后将大鼠置于苏平位置。用胶带将老鼠的四肢放在手术台上。
- 用杀菌肥皂剃光和清洁供体大鼠的腹部。使用2%的β丁至少1-2分钟，用70%的乙醇溶液擦拭。重复此序列三次。
- 用无菌的芬斯特化窗帘覆盖手术场。
- 做一个垂直的腹部切口，并暴露左肾，输尿管，腹主动脉，和劣质静脉卡瓦。
- 在切割足疗之前，可视化和解剖左肾、输尿管、腹部主动脉和劣质静脉卡瓦。
2. 心肌透注
- 手术前，准备灌注液。
- 每只大鼠制作50mL的灌注溶液。
- 将 1 倍 PBS 与大约 10 个 U/mL 肝素混合（1 25 kU 瓶将产生 2.5 升 PBS+Hep）。
- 将 8% 的副甲醛与 1 倍 PBS 混合等量，使 4% PFA/1xPBS 解决方案。
注：8%的PFA在水中可以储存在4°C长达2个月。但是，PBS 中稀释的 4% PFA 仅稳定 1 周，为 4 °C。 使稀释新鲜。
- 疯狂地伸展垂直腹部切口。切割时一定要把剪刀从器官上拔开，以免损坏内脏。
- 继续切口通过肋骨笼，然后通过抬起胸骨切开隔膜。
- 将松动的皮肤皮瓣固定在外，通过用钳子撕裂任何结缔组织来释放心脏。
注意： 不要用剪刀来释放心脏 ，这可能导致不必要的出血。 - 打开磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 线，确保线在将针头放入左心室之前流动。用钝钳轻轻握住心脏，并用血压器控制针头。针头的插入不应超过1/4英寸。
注意：插入大于 1/4 英寸可能导致组织另一侧穿孔。 - 在用针头和血浆支撑心脏的同时，找到合适的中庭，用虹膜切除术剪刀穿过心脏。将血化体放在大鼠身上，确保针头仍位于心脏内。
注意：如果切口足够，则应在体腔内有血液，因为流入大鼠的PBS压力会缓解。 - 小心地解开前脚和皮肤皮瓣。
- 如果肾脏和肝脏中仍有可见的血液，请继续灌注 PBS 4 分钟或更长时间。
3. 肾脏采集和去细胞化
- 用腹部主动脉和劣质静脉卡瓦收获左肾。
- 利盖特尿管，胸动脉，优越的静脉卡瓦，和腹部主动脉的分支。
- 将器官在杜尔贝科的 PBS （DPBS） 中保持水分，放在 10 厘米的培养皿中。
- 用23量表导管调节腹部主动脉和劣质静脉卡瓦。要去除残留血液，请将淋巴与围骨泵连接起来，然后用 DPBS （500 mL） 和 16 U/mL 肝素清洗 90 分钟，速度为 5 rpm，速度为 37 °C。
- 要去细胞化肾脏，用1%的Triton X-100（1 L）香水肾脏3小时，然后用0.75%钠硫酸钠（SDS）溶液（2升）6小时，恒定压力为40毫米汞。
注：肾脏将在8小时后变得透明。 - 要去除残留的 SDS，在蒸馏水中（6 L）中用 1% 青霉素将样品灌注 18 小时（过夜），然后用无菌 DPBS （500 mL） 和 16 U/mL 肝素灌注 90 分钟。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
老鼠肾的总形态是深红色（图1A）。去细胞化后，肾脏变得苍白和半透明（图1D）。残余基因组DNA根据制造商的说明，在去细胞化的肾脏脚手架中，并与本地肾脏（对照）进行比较，用商业套件进行评估。定量分析证实，组织基因组DNA在去细胞化后几乎被消灭。在14个病例中，控制的平均DNA含量为115.05 ng/μL，去细胞化脚手架的平均DNA含量为1.96 ng/μL。总共有98.3%的DNA被移除（图2），尽管三维结构得以维持，细胞腹股沟被保存在皮质帕奇马（图3）中。
图1：接受肾动脉输液去细胞化的鼠肾。（A） 在开始减细胞化后立即。（B） 经过特里顿X-100治疗。（C） 经过 SDS 缓冲处理。（D） 经过通宵脚手架清洗。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：控制和去细胞化大鼠肾脏的DNA浓度，显示去细胞化后DNA含量降低。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：血氧素和异丙辛染色控制和去细胞化肾脏样本。（A） 控制皮层（A'） 去细胞化皮层（B） 控制梅杜拉（B'） 去细胞化美杜拉（C）控制静脉（C'） 去细胞化静脉。比例栏， 100μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
各种协议已用于器官和其他组织的去细胞化。最佳的去细胞化协议应保留细胞外基质 （ECM） 的三维结构。一般来说，这种协议包括通过物理处理或离子溶液对细胞膜进行溶解，通过酶处理或洗涤剂将细胞质和细胞核从ECM中分离出来，然后从组织3中去除细胞碎片。物理过程包括刮伤、溶液搅拌、压力梯度、捕捉冻结、非热永久电波和超临界流体2。组织或器官外表面的细胞，如皮肤或小肠，可以通过机械过程与酶4结合有效去除。离子或非离子洗涤剂溶解DNA/蛋白质相互作用，脂质和脂蛋白，但可以破坏ECM结构5。酶去除分离的细胞质和核材料，但将这些材料留在ECM中，这可能导致免疫反应6。去细胞化的最佳制剂由组织厚度和密度或去细胞化组织的临床使用决定。
对于去细胞化，我们使用了非离子和离子洗涤剂的组合：特里顿X-100和SDS。Triton X-100 作为非离子洗涤剂，可有效破坏脂质/脂质和脂质/蛋白质的相互作用。然而，Triton X-100也可能破坏ECM超结构，由于糖氨基糖（GAG）、层氨酰氨基和纤维素含量的损失。SDS作为一种离子洗涤剂，有效地去除核残留物和细胞质蛋白，但也因GAG和胶原蛋白3的流失而破坏心电图超结构。虽然这些制剂破坏了ECM的微观结构，SDS和特里顿X-100成功地去除所有DNA成分7，8。这一点至关重要，因为脚手架内剩余的DNA含量会导致免疫排斥。在已正确去细胞化的组织中，DNA含量应小于50 ng/mg9，10。
在该方法中，去细胞化灌注的压力为40 mmHg。减分灌注需要压力控制。最佳的灌注压力因器官而异，60 mmHg是人与猪肾或心脏去细胞化的最佳压力。在大鼠中，40 mmHg被认为足以去细胞化灌注12。
取代异位移植的一个有希望的治疗方法是使用血管化脚手架移植干细胞。我们希望这个器官去细胞化协议能为未来的组织工程研究提供基础。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
这项研究得到了釜山国立大学医院的生物医学研究所资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (inject probes and vehicle solutions | Becton Dickinson | 305217 | |
| 10-0 ethilon for vessel anastomosis | Ethicon | 9032G | |
| 25 gauge inch guide needle(for vascular catheters) | Becton Dickinson | 305145 | |
| 3-0 PDS incision closure rat | Ethicon | Z316H | |
| 3-0 Prolene incision closure rat | Ethicon | 8832H | |
| 3-0 silk spool vascular access/ligation in rat | Braintree Scientific | SUT-S 110 | |
| 4-0 PDS incision closure mouse | Ethicon | Z773D | |
| 4-0 Prolene incision closure mouse | Ethicon | 8831H | |
| 5-0 silk spool vascular access/ligation in mouse | Braintree Scientific | SUT-S 106 | |
| Fine Scissors to cut fascia/connective tissue | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Kelly Hemostat for rats: muscle clamp to minimize bleeding when cut | Fine Science Tools | 13018-14 | |
| Polyethelyne 50 tubing, catheter tubing 100 ft | Braintree Scientific | .023" × .038” | |
| Schwartz microserrefine vascular clamps | Fine Science Tools | 18052-01 (straight) | |
| 18052-03 (curved) | |||
| Surgical Scissors to cut skin | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Vannas-Tubingen Spring scissors for arteriotomy | Fine Science Tools | 15003-08 |
References
- Kawai, T., et al. Brief report: HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. New England Journal of Medicine. 358 (4), 353-361 (2008).
- Rana, D., Zreiqat, H., Benkirane-Jessel, N., Ramakrishna, S., Ramalingam, M. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (4), 942-965 (2017).
- Fu, R. H., et al. Decellularization and recellularization technologies in tissue engineering. Cell Transplantation. 23 (4-5), 621-630 (2014).
- Hopkinson, A., et al. Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 14 (4), 371-381 (2008).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6 (2), 134-136 (2010).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Fernandez-Perez, J., Ahearne, M. The impact of decellularization methods on extracellular matrix derived hydrogels. Scientific Reports. 9 (1), 14933 (2019).
- Naik, A., Griffin, M., Szarko, M., Butler, P. E. Optimizing the decellularization process of an upper limb skeletal muscle; implications for muscle tissue engineering. Artificial Organs. 44 (2), 178-183 (2020).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Mason, C., Dunnill, P. A brief definition of regenerative medicine. Regenerative Medicine. 3 (1), 1-5 (2008).
- Guyette, J. P., et al.
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
