Summary
Denna studie syftade till att presentera en strategi för att identifiera läkemedelspeptidinteraktioner. Strategin innebär biopanning av läkemedelskännande korta peptider baserade på en kvartskristallmikrobalans (QCM) biosensor, följt av bioinformatikanalys för kvantitativ bedömning av den information som erhållits för läkemedelsigenkänning och anteckning av läkemedelsbindande platser på proteiner.
Abstract
Receptorer och enzymproteiner är viktiga biomolekyler som fungerar som bindande mål för bioaktiva små molekyler. Således är snabb och global validering av läkemedelsproteininteraktionerna mycket önskvärt för att inte bara förstå de molekylära mekanismerna bakom terapeutisk effekt utan också för att bedöma läkemedelsegenskaper, såsom adsorption, distribution, metabolism, utsöndring och toxicitet (ADMET) för klinisk användning. Här presenterar vi en biosensorbaserad strategi för hög genomströmning för biopanning av T7 fag-visade korta peptider som enkelt kan visas på capsid. Efterföljande analys av aminosyra sekvenser av peptider som innehåller korta segment, som "brutna reliker", av de läkemedelsbindande platserna med hjälp av bioinformatik program i receptor ligand kontakt (RELIC) svit, visas också. Genom att tillämpa denna metod på två kliniskt godkända läkemedel, en antitumör irinotekan och en antiinfluensa oseltamivir, förklaras den detaljerade processen för att samla in de läkemedelskännande peptidsekvenserna och markera de läkemedelsbindande platserna för målproteinerna i detta dokument. Den strategi som beskrivs häri kan tillämpas för alla små molekyler av intresse.
Introduction
Identifiering av läkemedelsbindande mål är en viktig faktor för utvecklingen av läkemedel och för att förstå sjukdomars molekylära mekanismer. I synnerhet är receptor- och enzymproteiner de viktigaste molekylära målen för bioaktiva små molekyler1. Även om affinitetsfångst är en väletablerad teknik för att identifiera de läkemedelsbindandeproteinerna 2, hämmar tekniska begränsningar, såsom låg löslighet av proteiner, ofta valideringen av läkemedelsmål2. Viktigast av allt förlorar de immobiliserade små molekylerna den grad av frihet som krävs för dockning och kan vara otillgängliga för de internt belägna bindningsställena på större målproteiner. Dessutom hämmar protein missriktning, oförmåga att analysera samkristalliseringsförhållanden och begränsningar på grund av molekylär storlek ofta användningen av röntgenkristallografi, kärnmagnetisk resonans (NMR) och andra sådana experimentella analyser för att studera läkemedelsproteininteraktioner.
Användningen av T7 faage display biopanning är ett effektivt sätt att bestämma bindningsstället på proteiner för små molekylbeten3. I synnerhet är ett T7-fag-visat slumpmässigt peptidbibliotek, som kan konstrueras genom att föra in syntetiskt DNA i en multikloningsanläggning, effektivt. Jämfört med T7-faagebiblioteket som visar proteiner kan de korta peptiderna enkelt konstrueras för att visas på T7-fagen kapsejs utan fysiska begränsningar, som kan steriskt kontakt med något litet molekylläkemedel fixerat på ett fast stöd2. Införandet av en kvartskristall mikrobalans (QCM) biosensor i T7 phage display biopanning plattform gör det möjligt att identifiera sådana svaga men specifika interaktioner av korta peptider med droger genom att övervaka minskningen av QCM frekvens4,5. Den bundna T7-fagen återvinns sedan direkt genom att infektera värden Escherichia coli (BLT5615) och DNA-sekvensen i regionen som kodar den affinitetsvalda peptiden som hyser drogbekännande korta segment bestäms. Efterföljande analys av aminosyra sekvensen av peptidpopulationen ger information om läkemedelsigenkänning. I silico parvis justering av de räddade aminosyra sekvenser kan användas för att få information om det biologiska målet för läkemedlet inom en vald proteome. Denna höga genomströmningsidentifiering av proteinfragment med affinitet mot ett läkemedel kan användas för att heuristiskt rekonstruera den läkemedelsbindande platsen på ett sätt som liknar det att rekonstruera en gammal artefakt från keramikskärvor6. I synnerhet kan detta unika tillvägagångssätt vara användbart när konventionella proteomikmetoder misslyckas.
Här presenterar vi en biosensorbaserad strategi för biopanning av T7 fag-visade peptider och bioinformatikanalys för målvalidering av de små molekylerna. Utöver tekniska begränsningar av konventionella metoder möjliggör denna strategi identifiering av läkemedelsbindande platser på målproteiner för alla små molekyler av intresse enligt det identiska protokollet.
Protocol
OBS: Följande är stegen för screening av läkemedelskännande T7-fager med hjälp av en QCM-biosensor och återställa de screenade fagerna via E. coli (BLT5615) infektion. Protokollen för syntesen av ett derivat av en liten molekyl som bildar ett självmonterat monoskikt (SAM) och för konstruktionen av T7-fag-visade 15-mer slumpmässigt peptidbibliotek finns någon annanstans6,7.
1. Förberedelse av QCM-sensorchipet
- Fäst ett keramiskt sensorchip på oscillatorn på en 27 MHz QCM-apparat och registrera den inneboende frekvensen (Hz) i luftfasen före små molekyl immobilisering.
- Lossa chippet och släpp 20 μL av en lösning (1 mM i 70% etanol) av ett litet molekylderivat som bildar SAM på sensorchipets guldelektrod med en pipett.
VARNING: Sensorchipkristallen där guldelektroden (Au, 0,1 mm tjock, 2,5 mm d., 4,9 mm2) är placerad är extremt tunn och kan spricka lätt (SiO2,0,06 mm tjock, 9 mm d.). Därför pipett noggrant. - Lämna i 1 timme vid rumstemperatur (cirka 20 °C) i en petriskål med fuktad vävnad och avskärmad från rumsbelysning.
- Tvätta elektrodytan försiktigt med ultrapurvatten; ta sedan bort vattendroppar genom att blåsa luft med en spruta eller luftdyster.
- Ställ in sensorchipet för QCM-apparaten och registrera frekvensminskningen i luftfasen för att mäta mängden av den lilla molekylen som har immobiliserats.
OBS: Minst 100 Hz inneboende frekvens är nödvändig för framgångsrik småmolekyl immobilisering (1 Hz immobiliserar 30 pg).
2. Biopanning av T7-fagenbiblioteket med hjälp av en QCM-biosensor (figur 1)
- Ställ in en cuvette med en dedikerad magnetisk omrörare på QCM-biosensorn och häll 8 ml av reaktionsbufferten (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) i cuvette.
- Fäst QCM-sensorchipet på oscillatorn och dra ner oscillatorns arm för att sänka ner chipet i bufferten som rörs om vid 1000 varv/min.
- Börja övervaka QCM-frekvensen på persondatorn (PC) och vänta tills sensorgrammet balanserar till cirka 3 Hz/min av frekvensavdriften.
- Injicera 8 μL av ett T7-fagbibliotek (1–2 × 1010 pfu/ml) i cuvetten (slutlig koncentration: 1–2 × 107 pfu/ml) och markera injektionspunkten på sensorn.
- Övervaka frekvensreduktionen som orsakas av bindningen av T7-fager till den lilla molekylen immobiliserad på guldelektrodytan i 10 minuter.
- Stoppa QCM-frekvensmätaren, lossa sensorchipet från oscillatorn och ta bort bufferten genom att blåsa luft och/eller transportera bort med våtservetter.
- Lägg sensorchipet i en fuktig Petri-skål och släpp 20 μL av suspensionen av E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5-1,0 efter skakning vid 37 °C genom att lägga till IPTG till 1 mM) värdceller i stockfasen på guldelektroden.
- Stäng locket på skålen och täck den med aluminiumfolie för att blockera ljus.
- Inkubera skålen vid 37 °C i 30 min på en 96-brunns mikroplåtblandare (1000-1500 varv/min) för att förbättra återhämtningen av de bundna T7-fagerna.
- Återställ lösningens 20 μL och suspendera den i 200 μL LB-medium.
OBS: De prover som erhålls i detta steg kan bevaras vid 4 °C med en vecka. - Förbered en utspädningsserie av faglösningen för plackisolering och DNA-sekvensering enligt det allmänna förfarandet som beskrivs i tillverkarens instruktioner8,9.
- Torka av guldelektrodytan med en bomullspinne indränkt med 1% natriumdodecylsulfatlösning.
- Tvätta guldytan med ultrapurevatten från tvättflaskan och ta sedan bort vattendroppar genom att blåsa luft med en spruta eller luftdyster.
- Släpp 5 μL pirayalösning (Conc. H2SO4:30% H2O2 = 3:1) på guldytan och låt den vara i 5 minuter.
- Tvätta guldytan igen med vatten och torka sedan genom att blåsa luft och/eller veka bort med våtservetter.
- Upprepa steg 2.14 och 2.15.
VARNING: Förbered pirayalösningen omedelbart före användning. Använd denna vätska försiktigt, eftersom det är en mycket stark syra. Behandling längre än 5 min eroderar sensorchipet.
3. Bioinformatikanalys med receptor ligand kontakt (RELIC) programsvit(figur 2)10,11
- Packa upp det fristående RELIC-programmet på en dator med ett MS Windows-operativsystem.
- Justera aminosyrasekvenserna i de 15-mer peptider affinitet-valda med hjälp av läkemedlet eller slumpmässigt valt från oskärmat överordnat bibliotek i varje textformatfil (namn.txt).
- Skriv aminosyrasekvensen av enstaka eller flera proteiner i varje textfil med FASTA-format, eller ladda ner databastextfilerna i FASTA-format från någon proteindatabas (t.ex. UniProt (http://www.uniprot.org/) eller DrugBank (https://www.drugbank.ca/).
- Placera textfilerna (och PDB-filerna för HETEROalign) i den mapp som krävs för att köra varje RELIC-program.
- Klicka på den körbara filen (program.exe) för AADIV, INFO, MOTIV, MATCH, HETEROalign, FASTAcon och FASTAskan i den oberoende mappen för att öppna den personliga versionen av FTN95.
- Skriv lämpligt filnamn, tillsammans med tillägget (namn.txt), i kommandomeddelandet för att köra varje program och hämta den önskade textformatfilen.
- Exportera den resulterande textfilen till ett kalkylbladsprogram (t.ex. Excel) för att generera ett informationsinnehåll (INFO) eller kumulativa likhetspoäng beräknade med hjälp av en BLOSUM62 (MATCH, HETEROalign).
OBS: Den ursprungliga RELIC-servern (http://relic.bio.anl.gov) är inte längre tillgänglig och vissa fristående RELIC-program som fungerar på datorer med en Windows-plattform kan erhållas från motsvarande författare (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).
Representative Results
De representativa resultaten för två kliniskt godkända läkemedel visas i figur 3. Irinotecan (Figur 3A), en vattenlöslig prodrog av naturligt camptothecin som används för behandling av avancerad kolorektalcancer och icke-småcellig lungcancer, omvandlas till SN-38 i levern, vilket hämmar topoisomeras I i cancerceller12. Dessutom hämmar denna förening direkt acetylkolinsteras (AChE)13,14. Genom strategin identifierades 29 peptider som kände igen Iri immobiliserad som en SAM av QCM biosensorbaserade biopanningsundergrupper med en cykel. Efterföljande parvis justering av 29 peptider och AChE gav maximala poäng för Y121, Q225, F290, E327, H440 och Y442 och markerade delen i den tredimensionella strukturen. Dessa aminosyrarester överensstämde med dem som utgör Iri-bindande platsen för AChE. Samma delmängd av peptider identifierade framgångsrikt E99, L100, L252, L305, I387 och V474 i närheten av katalytisk triad (S221, E353 och H467) i karboxylesteras (CE), vilket indikerar att dessa aminosyror bildar en byggnadsställning för Iri-erkännande under de-esterifiering av Iri15. Sådana aminosyrarester i katalysatorområdet kan inte identifieras direkt med konventionell röntgenkristallografi eller NMR-analys, eftersom enzymreaktionen fortskrider smidigt och inte bildar det statiska komplexet stabilt under allmänna experimentella förhållanden. Således är den kombinatoriska upptäckten av läkemedelsbindande platser av flera proteiner, inklusive de i de mellanliggande komplexen som eventuellt bildas med enzymer under metaboliska reaktioner för ett visst läkemedel, möjlig med hjälp av de affinitetsvalda peptiderna som bestäms för ett läkemedel.
Figur 3B visar de andra resultat som erhållits för oseltamivir (Osel), ett antiinfluensaläkemedel som aktiveras för oseltamivirkarboxylat, vilket i sin tur hämmar neuraminidasen (NA) avinfluensaviruset 16. De 27 peptider som kände igen Osel som täckte QCM-sensorns chipguldelektrodyta upptäckte framgångsrikt Osel-bindande platsen i NA16. Denna bindningsplats består av ostrukturerade peptidslingor som potentiellt genomgår dynamisk rörelse vid dockning med Osel. De Osel-igenkännliga peptiderna på T7-fag capsid kan efterlikna denna dynamiska dockning när den binder till Osel fast på guldelektrodytan på QCM-sensorchipet. Neuropsykiatriska biverkningar (NPAEs) har identifierats hos unga patienter med influensa, vilket påverkar patienter är möjligen relaterade till själva sjukdomen snarare än läkemedlet. Studier har visat att Osel aktivt exporteras från centrala nervsystemet (CNS) av gnagare via multidrogresistensprotein (MDR) i blod- hjärnbarriären (BBB)17. Faktum är att ett av proteinerna i klassen för denna MDR visade en hög poäng (topp 5% av 4 396 i DrugBank 1.0 proteindatabas18), förutom andra transportörer, neurotransmittorrelaterade enzymer och receptorer, i vår studie. Den farmakologiska betydelsen av dessa proteiner med avseende på uppkomsten av negativa effekter av Osel undersöks.
Hittills har enstaka och flera små molekylbindande platser på målproteinerna framgångsrikt identifierats för sex små molekylläkemedel som har använt vår strategi (Figur 4). För Brz2001 och roxithromycin (RXM) identifierades identiska läkemedelsbindande platser på ett målprotein med hjälp av olika pooler av peptider, antalet och aminosyrasekvenserna för vilka varierade helt7,19. Dessutom ledde enstaka peptidpooler som erhållits för Iri, RXM och Osel till identifiering av flera bindande platser på olika proteiner för varje läkemedel, såsom AChE och CE för Iri (Figur 3A)20,angiomotin och CYP3A4 för RXM19,21, och NA och MDR-associerat protein för Osel. Ett okänt molekylärt mål identifierades för anti-tumor förening doxorubicin (FANCF)22, och anti-angiogenic macrolide antibiotikum RXM (angiomotin)19.
Figur 1: Schematisk representation av QCM biosensorbaserad biopanning av T7 phage-visade peptidbiblioteket. Ett T7-faagebibliotek som visar slumpmässiga peptider injiceras i cuvetten som innehåller bufferten (under omrörning) där QCM-biosensorchipet är nedsänkt och frekvensen stabiliseras. Efter övervakning av frekvensreduktionen på grund av bindning av T7-fager till små molekyler immobiliserade på sensorchips guldelektrodyta lossnar sensorchipet från oscillatorn. DNA från den bundna T7-fag återvinns sedan direkt efter värd E. coli (BLT5615) infektion. De resulterande T7-fagerna isoleras via plackbildning och slutligen bestäms aminosyrasekvensen av den läkemedelstillhörighetsvalda peptiden som visas på T7-fag capsid enligt den allmänna fagdisplaymetoden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Schematisk representation av den kvantitativa bedömningen av sekvensjämförelsen mellan läkemedelsvalda peptider och enstaka eller flera proteiner. Läkemedelsvalda peptidsekvenser är respektive i linje med de primära aminosyrasekvenserna av enstaka och flera proteiner, och likheten i varje 3-5 aminosyrauppsättningar poängsätts kumulativt via parvis justering enligt en modifierad BLOSUM62 matris. Det resulterande området eller diagrammet anger de rester eller delar som utgör ett potentiellt läkemedelsbindande område på proteinet. Ytterligare analys med hjälp av ett lämpligt RELIC-program belyser bindningsplatsen på den tredimensionella strukturen (om PDB-fil är tillgänglig) eller rangordnar hela proteiner som eventuellt är det bindande målet (HETEROalign-programmet är för närvarande inte tillgängligt). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa resultat av peptidsamling och efterföljande bioinformatikanalys. (A) Irinotecan (anti-tumor prodrug, topoisomerasE I inhibitor). T7 phage interaktion övervakades i 10 min som en minskning av QCM frekvens. DNA av den bundna T7 phage återfanns och sekvenserades för att bestämma motsvarande aminosyra sekvens. Aminosyrasekvenserna av 29 15-mer peptider, samlade med hjälp av en delmängd av biopanning med en cykel, belyste de aminosyror som utgör Iri-bindande platsen för AChE [PDB ID 1U65]. Ytterligare bedömning med samma 29 peptider belyste de närliggande aminosyra rester (byggnadsställning rester för de-esterifiering) av katalytisk triad i CE, ett lever enzym som omvandlar Iri till SN-38 (aktiv form) [PDB ID: 1K4Y]. Likhetspoäng på 103 slumpmässigt utvalda peptider från det okontrollerade föräldrabiblioteket7,19 har subtraherats från dessa poäng för att ta bort biblioteksfördomar. Dessa figurerar reproduceras från Referens. 20, med tillåtelse från Elsevier. B) Oseltamivir (läkemedel mot influensa). De 27 peptider som innehåller Osel-igenkännande aminosyror markerade oordnade delar av Osel-bindande platsen för neuraminidas (NA) (virusenzym) [PDB ID: 2HT7]. Global validering av sekvensens likhet mellan 27 peptider och 4 396 proteiner i DrugBank1,0 18 visade att NA ligger inom topp 5% -intervallet, förutom de mänskliga proteiner som är associerade med funktionerna i centrala nervsystemet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Sammanfattning av desmå molekylerna, vars bindande mål identifierades med hjälp av denna strategi. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Här har en strategi för QCM biosensorbaserad biopanning av läkemedelskännande peptider, följt av bioinformatikanalys för validering av läkemedelsproteininteraktioner med hjälp av identifierade peptider, presenterats. Design av de små molekylderivaten för immobilisering på biosensorns guldelektrod är ett viktigt steg, eftersom den introducerade länkaren kan hindra bindning och insamling av peptiden som känner igen läkemedlet. För att undvika detta bereds derivat med olika positioner hos den introducerade länkaren23. Alternativt, för immobilisering av hydrofoba små molekyler, är sensorchipet nedsänkt i bulkvatten i en 10 cm Petri-maträtt, och en 20 μL-lösning av den lilla molekylen (10 mM lösning i dimetylsulfoxid) släpps på biosensorns guldelektrod, för att täcka dess yta och inkuberas i 5 min. Detta möjliggör retention av en sub-hundra hertz inneboende frekvens av små molekyler, som hålls i minst 10 min under biopanning. Med hjälp av sådan immobilisering framhävde de Osel affinity-utvalda peptiderna tydligt Osel-bindande platsen i NA (figur 3).
T7-fagen som används för att förbereda peptidbiblioteket här är genetiskt konstruerad med NNK15-kassetten som kodar 32 kodoner för alla 20 standard aminosyror och förtränger uppkomsten av 2 stoppkodon (UAA, UGA) och framträder endast UAG (Figur 1)6,7. Detta är viktigt för att visa 15-mer fullängdspeptider och öka mångfalden i biblioteket. T7 phage display system har en teknisk visningsgräns på 107-109 T7 fager. Mångfalden i 15-mer peptidbiblioteket är dock teoretiskt 2015 (3,27 × 1019); Således kan den inte användas för fullständig bibliotekskonstruktion. Ändå tillåter likhetssökning eller brytning av bevarade motiv detektion av aminosyrorna som består av de läkemedelsbindande platserna för proteiner även med denna begränsade mångfald av peptider i biblioteket. Dessutom sträcker sig 3-5 aminosyra inom bibliotekets peptid (utseendegraden är mellan 1/203 och 1 / 205, som kan realiseras med hjälp av T7-fagdisplaysystemet) är involverade i erkännandet av små molekylläkemedel; Därför krävs inte en 100% matchning av peptidsekvenserna med 15-mer aminosyrasekvenser som utgör målproteinens läkemedelsbindningsställe. Faktum är att cirka 30 affinitetsvalda peptider framgångsrikt belyste bindningsstället för målproteinet för varje läkemedel som testades (figur 4). Mångfalden i det överordnade T7-fagbiblioteket som används (1,7 × 107 pfu/mL) kan därför användas för att heuristiskt rekonstruera det narkotikabindande området.
Vanligtvis framkom 3-5 kopior av T7-fager som visade samma sekvenser som de av de 15-mer aminosyrasekvenser som hyser läkemedelskännande aminosyrasträckor inom de 16 plack godtyckligt isolerade, vilket indikerar framgången för affinitetsvalet enligt vårt protokoll. Detta indikerar att 18-30 olika läkemedelskännande peptidsekvenser samlas in inom de 96 plack som isolerats (antalet är associerat med mikroplåtformatet), som identifieras senare med hjälp av sekvensering av DNA och erhålla motsvarande aminosyrasekvens. I den nuvarande strategin är injektionen av 8 μL av T7-fagbiblioteket i cuvetten som innehåller 8 ml buffert (1000-faldig utspädning av biblioteket) lämplig för att minska den icke-specifika bindningen av T7-fager. Att öka mångfalden av affinitet-utvalda peptider, upprepa en cykel urval flera gånger och använda 16 eller 32 plack isolering per screening visade sig vara effektivare än isolering från en enda lösning i taget. Till exempel, för att effektivt samla in cirka 30 olika sekvenserade affinitet-utvalda peptider, genomfördes 3-6 uppsättningar av en cykel urval, 16 eller 32 plack isolerades i varje experiment. Utseendet på identiska sekvenser i alla 16 eller 32 T7 phage plack anges oavsiktligt påvisande av bakgrunden eller kan kontamineras som en överföring. Däremot tyder frånvaron av T7-fager med samma sekvens eller utseende på många T7-fager med kortare peptider än 15-mer-längden på att T7-fager i populationen inte specifikt uppstod med hög sannolikhet. Eftersom QCM frekvens minskning sker i samma utsträckning även i sådana fall, bör framgången för urvalet utvärderas omfattande genom sekvensering av DNA för den isolerade T7 phage, följt av bioinformatik analys av aminosyra sekvenser av peptiderna. Dessutom, till skillnad från det konventionella T7-faagedisplayprotokollet, är upprepade urvalsrundor mindre effektiva, eftersom variationen och antalet T7-fager är små och inte koncentreras även efter att förstärknings- och urvalsstegenhar upprepats 23.
Viktigt är att denna metod är tillämplig för brytning av små molekylbindande platser i proteomer av människor, patogena virus och till och med växter. Intressant nog kan den eventuellt ostrukturerade korta visningslängden av peptider på T7-fagen capsid efterlikna den molekylära dynamiken hos peptider av proteiner under dockning med en liten molekyl; detta kan återspegla dynamisk bindning24. Utöver de tekniska begränsningarna för konventionella metoder kan denna strategi, som är tillämplig på identiska protokoll för små molekyler, expandera den läkemedelsbara proteomen samt ge mer granularitet när det gäller läkemedelsproteininteraktionsanalys.
Vissa tekniska begränsningar av detta tillvägagångssätt bör beaktas. Organisk syntes är nödvändig för små molekyler immobilisering på guldelektrodytan på biosensorchipet. För icke-experter inom organisk kemi är vissa immobiliseringsreagenser kommersiellt tillgängliga för att mekaniskt fixa den lilla molekylen genom koppling. Dessutom kan vissa nonsens delar av peptiderna resultera i påvisande av en del av proteinet som inte är relevant för läkemedelsdockning som falska positiva. Detta motsvarar empiriskt beta-ark eller leucinrika domäner rika på leucin eller valinrester, som kodas av fler kodoner än andra standard aminosyror, när kopior av T7-fag produceras. Kontroll av bibliotekets peptidlängd kan kontrollera förekomsten av falska positiva identifieringar. Däremot kan det finnas fall där aminosyrarester i det läkemedelsbindande området som är involverade i dockning, vilket visas med hjälp av röntgenkristallografi eller NMR-analys, inte detekteras. Detta kan lösas genom att samla ett större antal av de läkemedelskännande peptiderna eller ändra riktningen för fixering av de små molekylerna på guldelektroden.
Många läkemedelsproteininteraktioner som är relaterade till de viktigaste och sekundära effekterna av narkotikamissbruk kan fortfarande vara oidentifierade i proteomen; Dessutom kan enzymer och transportörer som ansvarar för läkemedelsabsorption, distribution, metabolism, utsöndring och toxicitet också vara oidentifierade. Proteinbindning är inte alltid ansvarig för ett läkemedels bioaktivitet. Således kommer en kombination av annan information från biologiska analyser att förbättra identifieringen av viktiga läkemedelsmål som är ansvariga för de viktigaste och negativa effekterna av droger. Ytterligare anpassningar av denna koncisa teknik kommer att öka praktiska och genomströmning för gruvdrift av proteinbindande platser i ett brett spektrum av små molekylläkemedel. Den metod som presenteras häri kommer till stor del att bidra till att inte bara bedriva grundforskning inom de relaterade områdena utan också klargöra de molekylära mekanismer som ligger till grund för terapeutisk effekt eller andra biologiska effekter av läkemedel vid klinisk användning.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författaren tackar Drs. Yujiro Hayashi och Hayato Ishikawa för att de tillhandahåller oseltamivir och Dr. Lee Makowski för att de tillhandahåller de fristående RELIC-programmen. Författaren erkänner också Tetsuya Kawagoe för det tekniska stödet från QCM-experimentet. Detta arbete stöddes delvis av JSPS KAKENHI Grant Number 17K01363 (Y.T.).
UTTALANDE OM DATATILLGÄNGLIGHET
De fristående RELIC-programmen och sekvensdata för affinitet-utvalda peptider för droger samt proteinsekvenser från proteome databas som används i detta dokument är tillgängliga från denna författare på begäran (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFFINIXQN | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCM2008-STKIT | Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC |
| AADIV | Northeastern University (Lee Makowski) |
AADIV.exe | Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library. |
| Ceramic Sensor Chip | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMST27C | 4 sensor chips/package |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
D8418 | |
| Ethanol | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 09-0850 | |
| FASTAcon | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAcon.exe | Identifies proteins from a population with short consensus sequences. |
| FASTAskan | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAskan.exe | Lists proteins with high similarity to a peptide population. |
| Immiblization kit for AFFINIX | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMIMKT | SAM reagent and amine coupling reagent |
| INFO | Northeastern University (Lee Makowski) |
INFO.exe | Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule). |
| Liquid LB medium | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
L3522 | Autoclave for 20 min |
| MATCH | Northeastern University (Lee Makowski) |
MATCH.exe | Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length). |
| MOTIF1 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF1.exe | Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population. |
| MOTIF2 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF2.exe | Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths. |
| NaCl | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | S3014 | |
| Receptor ligand contacts (RELIC) | Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA) |
https://www.relic.anl.gov | Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request) |
| Tris | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 252859 |
References
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack. Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Piggott, A. M., Karuso, P. Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display. Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule. Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).
- Takakusagi, Y., et al. Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display. ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).
- Novagen. T7 Select® System Manual. Novagen. , TB178 1009JN (2009).
- Novagen. OrientExpressTM cDNA Manual. Novagen. , TB247 1109JN (2009).
- Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. RELIC--a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites. Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).
- Makowski, L. Phage Nanobiotechnology. Petrenko, V. A., Smith, G. P. , RSC Publishing. Ch. 3 33-54 (2011).
- Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins. Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).
- Harel, M., et al. The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action. Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).
- Dodds, H. M., Rivory, L. P. The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11). Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).
- Bencharit, S., et al. Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases. Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).
- Kim, C. U., et al. Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity. Journal of the American Chemical Society. 119 (4), 681-690 (1997).
- Hoffmann, G., et al. Nonclinical pharmacokinetics of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in the central nervous system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4753-4761 (2009).
- Wishart, D. S., et al. DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018. Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).
- Takakusagi, K., et al. Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).
- Takakusagi, Y., et al. Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).
- Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device. World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).
- Kusayanagi, T., et al. The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).
- Takakusagi, Y., et al. Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).
- Rodi, D. J., et al. Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).
