Summary
Denne studien hadde som mål å presentere en strategi for å identifisere legemiddel-peptid interaksjoner. Strategien innebærer biopanning av legemiddel-gjenkjenne korte peptider basert på en kvarts-krystall mikrovekt (QCM) biosensor, etterfulgt av bioinformatikk analyse for kvantitativt vurdere informasjon innhentet for narkotika anerkjennelse og merknad av narkotikabindende områder på proteiner.
Abstract
Reseptorer og enzymproteiner er viktige biomolekyler som fungerer som bindende mål for bioaktive små molekyler. Dermed er den raske og globale valideringen av legemiddel-protein interaksjoner svært ønskelig for ikke bare å forstå molekylære mekanismer underliggende terapeutisk effekt, men også for å vurdere narkotika egenskaper, som adsorpsjon, distribusjon, metabolisme, utskillelse, og toksisitet (ADMET) for klinisk bruk. Her presenterer vi en biosensorbasert strategi for høy gjennomstrømning for biopanning av T7 phage-viste korte peptider som lett kan vises på phage capsid. Etterfølgende analyse av aminosyresekvensene av peptider som inneholder korte segmenter, som "ødelagte relikvier", av de legemiddelbindende stedene ved hjelp av bioinformatikkprogrammer i reseptorligand kontakt (RELIC) suite, vises også. Ved å bruke denne metoden på to klinisk godkjente legemidler, en anti-tumor irinotekan, og en anti-influensa oseltamivir, er den detaljerte prosessen for å samle de legemiddel gjenkjennende peptidsekvensene og fremheve de legemiddelbindende stedene til målproteinene forklart i dette papiret. Strategien som er beskrevet her, kan brukes på små molekyler av interesse.
Introduction
Identifisering av legemiddelbindende mål er avgjørende for utvikling av legemidler, samt for å forstå de molekylære mekanismene for sykdommer. Spesielt er reseptor- og enzymproteiner de viktigste molekylære målene for bioaktive små molekyler1. Selv om affinitetsfangst er en veletablert teknikk for å identifisere de legemiddelbindendeproteinene 2,hindrer tekniske begrensninger, for eksempel lav løselighet av proteiner, ofte valideringen av legemiddelmål2. Viktigst av alt mister de immobiliserte små molekylene graden av frihet som er nødvendig for dokking og kan være utilgjengelig for de internt beliggende bindingsstedene på større målproteiner. Videre, protein misfolding, manglende evne til å analysere co-krystallisering forhold, og begrensninger på grunn av molekylær størrelse ofte hemme bruk av røntgenkrystallografi, kjernemagnetisk resonans (NMR), og andre slike eksperimentelle analyser for studier av narkotika-protein interaksjoner.
Bruken av T7 phage display biopanning er en effektiv måte å bestemme bindingsstedet på proteiner for små molekylagn3. Spesielt er et T7 phage-vist tilfeldig peptidbibliotek, som kan konstrueres ved å sette syntetisk DNA inn i et flerkloningsted, effektiv. Sammenlignet med T7 phage biblioteket viser proteiner, kan de korte peptidene lett konstrueres for å bli vist på T7 phage capsid uten fysiske restriksjoner, som kan sterisk kontakt med noen små molekylstoff fast på en solid støtte2. Videre tillater innføringen av en kvartskrystallmikrovekt (QCM) biosensor i T7 phage display biopanning-plattformen identifisering av slike svake, men spesifikke interaksjoner av korte peptider med legemidler ved å overvåke reduksjonen i QCMfrekvens 4,5. Den bundne T7 phage blir deretter direkte gjenopprettet ved å infisere verten Escherichia coli (BLT5615), og DNA-sekvensen i regionen som koder affinitet-valgt peptid som skjuler narkotika-gjenkjenne korte segmenter bestemmes. Etterfølgende analyse av aminosyresekvensen av peptidpopulasjonen gir informasjon om legemiddelgjenkjenning. I silico parvis justering av de reddet aminosyre sekvenser kan brukes til å få informasjon om det biologiske målet for stoffet i en valgt proteome. Denne høye gjennomstrømningen identifisering av proteinfragmenter med affinitet mot et stoff kan brukes til å rekonstruere det narkotikabindende stedet på en måte som ligner på å rekonstruere en gammel artefakt fra keramikkskår6. Spesielt kan denne unike tilnærmingen være nyttig når konvensjonelle proteomics tilnærminger mislykkes.
Her presenterer vi en biosensorbasert strategi for biopanning av T7 phage-viste peptider og bioinformatikk analyse for målvalidering av de små molekylene. Utover tekniske begrensninger på konvensjonelle metoder, gjør denne strategien det mulig å identifisere legemiddelbindende steder på målproteiner for ethvert lite molekyl av interesse under den samme protokollen.
Protocol
MERK: Følgende er fremgangsmåten for screening av legemiddel gjenkjenne t7 phages ved hjelp av en QCM biosensor og gjenopprette screenede phages via E. coli (BLT5615) infeksjon. Protokollene for syntese av et derivat av et lite molekyl som danner en selvmontert monolayer (SAM) og for bygging av T7 phage-vist 15-mer tilfeldig peptid bibliotek kan bli funnet andresteder 6,7.
1. Tilberedning av QCM-sensorbrikken
- Fest en keramisk sensorbrikke på oscillatoren til et 27 MHz QCM-apparat, og registrer egenfrekvensen (Hz) i luftfasen før små molekylimmobilisering.
- Løsne brikken og slipp 20 μL av en løsning (1 mM i 70% etanol) av et lite molekylderivat som danner SAM på sensorbrikkens gullelektrode ved hjelp av en pipette.
FORSIKTIG: Sensorbrikkekrystallen der gullelektroden (Au, 0,1 mm tykk, 2,5 mm i.d., 4,9 mm2) er ekstremt tynn og kan sprekke lett (SiO2, 0,06 mm tykk, 9 mm i.d.). Derfor pipette nøye. - La stå i 1 time ved romtemperatur (rundt 20 °C) i en petriskål med fuktet vev og skjermet mot romlys.
- Vask elektrodeoverflaten forsiktig med ultrarent vann; fjern deretter vanndråpene ved å blåse luft med en sprøyte eller luftstøver.
- Sett opp sensorbrikken for QCM-apparatet og registrer reduksjonen i frekvens i luftfasen for å måle mengden av det lille molekylet som er immobilisert.
MERK: Minst, 100 Hz iboende frekvens er nødvendig for vellykket liten molekyl immobilisering (1 Hz immobiliserer 30 pg).
2. Biopanning av T7 phage biblioteket ved hjelp av en QCM biosensor (Figur 1)
- Sett en cuvette med en dedikert magnetisk rører på QCM biosensor og hell 8 ml av reaksjonsbufferen (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) inn i cuvette.
- Fest QCM-sensorbrikken til oscillatoren og trekk ned armen på oscillatoren for å senke brikken ned i bufferen som omrøres ved 1000 o/min.
- Begynn å overvåke QCM-frekvensen på den personlige datamaskinen (PC) og vent til sensorgramet likevekter til rundt 3 Hz / min av frekvensdriften.
- Injiser 8 μL av et T7 phage bibliotek (1-2 ×10 10 pfu/ml) i cuvette (endelig konsentrasjon: 1-2 × 107 pfu/ml) og merk injeksjonspunktet på sensoren.
- Overvåk frekvensreduksjonen forårsaket av bindingen av T7-phages til det lille molekylet immobilisert på gullelektrodeoverflaten i 10 min.
- Stopp QCM-frekvensmonitoren, løsne sensorbrikken fra oscillatoren og fjern bufferen ved å blåse luft og/eller transportere bort med våtservietter.
- Sett sensorbrikken i en fuktig petriskål og slipp 20 μL av suspensjonen av E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5-1,0 etter risting ved 37 °C ved å legge til IPTG til 1 mM) vertsceller i loggfasen på gullelektroden.
- Lukk lokket på parabolen og dekk det med aluminiumsfolie for å blokkere ut lys.
- Inkuber fatet ved 37 °C i 30 min på en 96-brønns mikroplatemikser (1000-1500 o/min) for å øke utvinningen av de bundne T7-phages.
- Gjenopprett oppløsningens 20 μL og suspender den i 200 μL LB medium.
MERK: Prøvene som er oppnådd i dette trinnet kan bevares ved 4 °C med en uke. - Forbered en fortynningsserie av phage-løsningen for plakkisolering og DNA-sekvensering i henhold til den generelle prosedyren som er beskrevet i produsentensinstruksjoner 8,9.
- Tørk av gullelektrodeoverflaten med en bomullspinne gjennomvåt med 1% natrium dodecylsulfatoppløsning.
- Vask gulloverflaten med ultrarent vann fra vaskeflasken og fjern deretter vanndråper ved å blåse luft med en sprøyte eller luftstøver.
- Slipp 5 μL pirajaoppløsning (Konk. H2SO4:30% H2O2 = 3:1) på gulloverflaten og la stå i 5 min.
- Vask gulloverflaten igjen med vann og tørk deretter ved å blåse luft og /eller transportere bort med kluter.
- Gjenta trinn 2.14 og 2.15.
FORSIKTIG: Klargjør pirajaoppløsningen umiddelbart før bruk. Bruk denne væsken forsiktig, da det er en veldig sterk syre. Behandling i mer enn 5 min eroderer sensorbrikken.
3. Bioinformatikk analyse ved hjelp av Reseptor Ligand Kontakt (RELIC) program suite (Figur 2)10,11
- Pakk ut det frittstående RELIC-programmet på en PC med et MS Windows-operativsystem.
- Juster aminosyresekvensene til de 15-mer peptider affinitet-valgt ved hjelp av stoffet eller tilfeldig valgt fra uskjermet overordnet bibliotek i hver tekstformatfil (navn.txt).
- Skriv inn aminosyresekvensen til enkelt- eller flere proteiner i hver tekstfil med FASTA-format, eller last ned databasetekstfilene i FASTA-format fra en hvilken som helst proteindatabase (f.eks. UniProt (http://www.uniprot.org/) eller DrugBank (https://www.drugbank.ca/).
- Plasser tekstfilene (og PDB-filene for HETEROalign) i mappen som er nødvendig for å kjøre hvert RELIC-program.
- Klikk den kjørbare filen (program.exe) for AADIV, INFO, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon og FASTAskan i den uavhengige mappen for å åpne den personlige versjonen av FTN95.
- Skriv inn riktig filnavn, sammen med filtypen (navn.txt), i kommandomeldingen for å kjøre hvert program og få den nødvendige tekstformatfilen.
- Eksporter den resulterende tekstfilen til en regnearkprogramvare (f.eks. Excel) for å generere et plott med informasjonsinnhold (INFO) eller kumulative likhetspoeng beregnet ved hjelp av en BLOSUM62 (MATCH, HETEROalign).
MERK: Den opprinnelige RELIC-serveren (http://relic.bio.anl.gov) er ikke lenger tilgjengelig, og noen frittstående RELIK-programmer som fungerer på PCer med en Windows-plattform, kan fås fra den tilsvarende forfatteren (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).
Representative Results
De representative resultatene for to klinisk godkjente legemidler er vist i figur 3. Irinotecan (Figur 3A), en vannløselig prodrug av naturlig camptothecin som brukes til behandling av avansert kolorektal kreft og ikke-småcellet lungekreft, omdannes til SN-38 i leveren, noe som hemmer topoisomerase I i kreftceller12. Videre hemmer denne forbindelsen direkte acetylkolinsterase (AChE)13,14. Gjennom strategien ble 29 peptider som anerkjente Iri immobilisert som en SAM identifisert av QCM biosensorbaserte en-syklus biopanning undergrupper. Påfølgende justering av de 29 peptidene og AChE ga maksimal score for Y121, Q225, F290, E327, H440 og Y442 og fremhevet delen i den tredimensjonale strukturen. Disse aminosyrerester var i samsvar med de som utgjør Iri-bindende stedet for AChE. Det samme delsettet av peptider identifiserte E99, L100, L252, L305, I387 og V474 i nærheten av den katalytiske triaden (S221, E353 og H467) i carboxylesterase (CE), noe som indikerer at disse aminosyrene danner et stillas for Iri anerkjennelse under avsterifisering av Iri15. Slike aminosyrerester på det katalytiske stedet kan ikke identifiseres direkte ved hjelp av konvensjonell røntgenkrystallografi eller NMR-analyse, da enzymreaksjonen fortsetter jevnt og danner ikke det statiske komplekset stabilt under generelle eksperimentelle forhold. Dermed, at kombinatorisk påvisning av narkotikabindende steder av flere proteiner, inkludert de i mellomliggende komplekser muligens dannet med enzymer under metabolske reaksjoner for et bestemt stoff, er mulig å bruke affinitet-utvalgte peptider bestemt for ett stoff.
Figur 3B viser de andre resultatene oppnådd for oseltamivir (Osel), et anti-influensa stoff som er aktivert for oseltamivir karboksylat, som igjen hemmer neuraminidase (NA) avinfluensaviruset 16. De 27 peptidene som gjenkjente Osel som dekket QCM-sensoren chip gull elektrode overflaten vellykket oppdaget Osel-bindende området i NA16. Dette bindingsstedet består av ustrukturerte peptidløkker som potensielt gjennomgår dynamisk bevegelse mens du dokker med Osel. Osel-gjenkjennende peptider på T7 phage capsid kan etterligne denne dynamiske dokking når binding til Osel festet på gull elektrode overflaten av QCM sensor chip. Nevropsykiatriske bivirkninger (NPAE) er identifisert hos unge pasienter med influensa, som effekt på pasienter er muligens relatert til selve sykdommen i stedet for stoffet. Studier har vist at Osel aktivt eksporteres fra sentralnervesystemet (CNS) av gnagere via multidrugresistens (MDR) protein i blod-hjernebarrieren (BBB)17. Faktisk viste et av proteinene i klassen av denne MDR en høy score (topp 5% av 4396 i DrugBank 1.0 proteindatabase18),i tillegg til andre transportører, nevrotransmitterrelaterte enzymer og reseptorer, i vår studie. Den farmakologiske betydningen av disse proteinene med hensyn til utseendet av bivirkninger av Osel undersøkes.
Så langt har enkelt- og flere små molekylbindende steder på målproteinene blitt identifisert for seks små molekylmedisiner brukt vår strategi (figur 4). For Brz2001 og roxithromycin (RXM) ble identiske legemiddelbindende steder på et målprotein identifisert ved hjelp av forskjellige bassenger av peptider, tallene og aminosyresekvensene som varierte helt7,19. Videre førte enkelt peptid bassenger oppnådd for Iri, RXM og Osel til identifisering av flere bindende steder på forskjellige proteiner for hvert legemiddel, som AChE og CE for Iri (Figur 3A)20, angiomotin og CYP3A4 for RXM19,21, og NA og MDR-assosiert protein for Osel. Et ukjent molekylært mål ble identifisert for anti-tumor forbindelsen doksorubicin (FANCF)22,og anti-angiogen makrolid antibiotika RXM (angiomotin)19.
Figur 1:Skjematisk representasjon av QCM biosensorbasert biopanning av T7 phage-vist peptid bibliotek. Et T7 phage bibliotek som viser tilfeldige peptider injiseres i cuvette som inneholder bufferen (under omrøring) der QCM biosensor chip er nedsenket og frekvensen er stabilisert. Etter å ha overvåket frekvensreduksjonen på grunn av bindingen av T7-phages til små molekyler immobilisert på gullelektrodeoverflaten til sensorbrikken, løsnes sensorbrikken fra oscillatoren. DNA fra den bundne T7 phage blir deretter direkte gjenopprettet etter vert E. coli (BLT5615) infeksjon. De resulterende T7 phages er isolert via plakk dannelse og, til slutt, aminosyre sekvensen av stoffet affinitet-valgt peptid som vises på T7 phage capsid bestemmes i henhold til den generelle phage display metoden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk representasjon av den kvantitative vurderingen av sekvenssammenligningen mellom legemiddelvalgte peptider og enkelt- eller flere proteiner. Legemiddelvalgte peptidsekvenser er henholdsvis justert med de primære aminosyresekvensene av enkelt- og flere proteiner, og likheten i hvert 3-5 aminosyresett er kumulativt scoret via parvis justering i henhold til en modifisert BLOSUM62 matrise. Den resulterende tomten eller diagrammet indikerer rester eller deler som utgjør et potensielt legemiddelbindende sted på proteinet. Videre analyse ved hjelp av et passende RELIC-program fremhever bindingsområdet på den tredimensjonale strukturen (hvis PDB-filen er tilgjengelig) eller rangerer hele proteiner som muligens er bindende mål (HETEROalign-programmet er for øyeblikket utilgjengelig). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3:Representative resultaterav peptidsamling og påfølgende bioinformatikkanalyse. (A)Irinotecan (anti-tumor prodrug, topoisomerase I hemmer). T7 phage interaksjon ble overvåket i 10 min som en reduksjon i QCM frekvens. DNA av den bundne T7 phage ble gjenfunnet og sekvensert for å bestemme tilsvarende aminosyre sekvens. Aminosyresekvensene på 29 15-mer peptider, samlet ved hjelp av en undergruppe av en syklus biopanning, fremhevet aminosyrene som utgjør Iri-bindende stedet for AChE [PDB ID 1U65]. Videre vurdering ved hjelp av de samme 29 peptider fremhevet de nærliggende aminosyrerester (stillasrester for de-esterification) av katalytisk triade i CE, et leverenzym som konverterer Iri til SN-38 (aktiv form) [PDB ID: 1K4Y]. Likhetspoeng på 103 tilfeldig utvalgte peptider fra det uskjermede overordnedebiblioteket 7,19 har blitt trukket fra disse poengsummene for å fjerne bibliotekbias. Disse tallene er gjengitt fra Ref. 20, med tillatelse fra Elsevier. (B) Oseltamivir (anti-influensa narkotika). De 27 peptidene som inneholder Osel-gjenkjennende aminosyrer fremhevet uorden deler av Osel-bindende stedet for neuraminidase (NA) (virusenzym) [PDB ID: 2HT7]. Global validering av sekvensen likhet mellom 27 peptider og 4396 proteiner i DrugBank 1.018 viste NA å være innenfor topp 5% rekkevidde, i tillegg til verten menneskelige proteiner forbundet med funksjonene i sentralnervesystemet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4:Sammendrag av desmå molekylene, hvis bindende mål ble identifisert ved hjelp av denne strategien. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Her har en strategi for QCM biosensorbasert biopanning av legemiddel gjenkjennende peptider, etterfulgt av bioinformatikkanalyse for validering av legemiddelproteininteraksjoner ved hjelp av de identifiserte peptidene, blitt presentert. Utforming av de små molekylderivatene for immobilisering på biosensorens gullelektrode er et viktig skritt, da den introduserte linkeren kan hindre binding og innsamling av peptidet som gjenkjenner stoffet. For å unngå dette er derivater med forskjellige posisjoner av den introduserte linker forberedt23. Alternativt, for immobilisering av hydrofobe små molekyler, er sensorbrikken nedsenket i bulkvann i en 10 cm petriskål, og en 20 μL løsning av det lille molekylet (10 mM løsning i dimetylsulfoksid) slippes ned på biosensorens gullelektrode, for å dekke overflaten og inkuberes i 5 min. Dette gjør det mulig å retensjon av en sub-hundre hertz egen frekvens av små molekyler, som holdes i minst 10 min under biopanning. Faktisk, ved hjelp av en slik immobilisering, fremhevet Osel affinitet-valgte peptider tydelig Osel-bindende området i NA (figur 3).
T7 phage brukes til å forberede peptid biblioteket her er genetisk konstruert ved hjelp av NNK15 kassett som koder 32 codons for alle 20 av standard aminosyrer og undertrykker fremveksten av 2 stopp codons (UAA, UGA) og fremstår bare UAG (Figur 1)6,7. Dette er viktig for å vise 15-mer full lengde peptider og øke mangfoldet av biblioteket. T7 phage display systemet har en teknisk skjermgrense på 107-109 T7 phages. Imidlertid er mangfoldet av 15-mer peptid biblioteket teoretisk 2015 (3,27 × 1019); Dermed kan den ikke brukes til komplett bibliotekkonstruksjon. Likevel, likhet søk eller gruvedrift av bevarte motiver tillater påvisning av aminosyrer som består av narkotikabindende steder av proteiner selv med dette begrensede mangfoldet av peptider i biblioteket. I tillegg strekker 3-5 aminosyrer innenfor biblioteket peptid (utseende frekvensen er mellom 1/203 og 1/ 205, som kan realiseres ved hjelp av T7 phage display system) er involvert i anerkjennelse av små molekylmedisiner; Derfor er det ikke nødvendig med en 100% match av peptidsekvensene med 15-mer aminosyresekvenser som utgjør legemiddelbindingsstedet for målproteinet. Faktisk, ca 30 affinitet-utvalgte peptider vellykket fremhevet bindende stedet for målet protein for hvert stoff testet (Figur 4). Dermed kan mangfoldet i det overordnede T7 phage biblioteket som brukes (1,7 × 107 pfu / ml) brukes til å rekonstruere det legemiddelbindende stedet.
Vanligvis, 3-5 kopier av T7 phages som viste de samme sekvensene som de av de 15-mer aminosyre sekvenser som huser narkotika-gjenkjennende aminosyre strekninger dukket opp innenfor de 16 plakk vilkårlig isolert, noe som indikerer suksessen til affinitet utvalg under vår protokoll. Dette indikerer at 18-30 forskjellige legemiddel-gjenkjenne peptid sekvenser samles inn i 96 plakk isolert (tallet er forbundet med mikroplate format), som identifiseres senere ved hjelp av sekvensering av DNA og oppnå tilsvarende aminosyre sekvens. I den nåværende strategien er injeksjon av 8 μL av T7 phage-biblioteket i cuvette som inneholder 8 ml buffer (1000 ganger fortynning av biblioteket) egnet for å redusere den ikke-spesifikke bindingen av T7-faser. For å øke mangfoldet av affinitetsvalgte peptider, gjenta en syklus valg flere ganger og bruke 16 eller 32 plakk isolasjoner per screening viste seg å være mer effektiv enn isolasjon fra en enkelt løsning om gangen. For eksempel, for å effektivt samle ca 30 forskjellige sekvenserte affinitet-utvalgte peptider, 3-6 sett med en syklus valg ble utført, 16 eller 32 plaketter ble isolert i hvert eksperiment. Utseende av identiske sekvenser i alle 16 eller 32 T7 phage plakk er indikert utilsiktet påvisning av bakgrunn eller kan kontaminering som en overføring. I motsetning, fraværet av T7 phages med samme sekvens eller utseende av mange T7 phages med kortere peptider enn 15-mer lengde indikerer at T7 phages i befolkningen ikke-spesifikt dukket opp med høy sannsynlighet. Som QCM frekvensreduksjon oppstår i samme grad selv i slike tilfeller, bør suksessen til valget evalueres grundig ved å sekvensere DNA av den isolerte T7 phage, etterfulgt av bioinformatikk analyse av aminosyresekvensene av peptidene. Videre, i motsetning til den konvensjonelle T7 phage display protokollen, gjenta runder av valg er mindre effektiv, som variasjonen og antall T7 phages er små og er ikke konsentrert selv etter å ha gjentatt forsterkning og utvalg trinn23.
Viktigere er denne metoden gjelder for gruvedrift av små molekylbindende steder i proteomer av mennesker, patogene virus og til og med planter. Interessant, muligens ustrukturert kort skjerm lengde peptider på T7 phage capsid kan etterligne molekylær dynamikk av peptider av proteiner under dokking med et lite molekyl; dette kan gjenspeile dynamisk binding24. Utover de tekniske begrensningene av konvensjonelle metoder, denne strategien, som gjelder for identiske protokoller for små molekyler, kan utvide druggable proteome samt gi mer detaljnivå om narkotika-protein interaksjon analyse.
Visse tekniske begrensninger av denne tilnærmingen bør vurderes. Organisk syntese er nødvendig for små molekylimmobilisering på gullelektrodeoverflaten til biosensorbrikken. For de ikke-eksperter i organisk kjemi er noen immobiliseringsreagenser kommersielt tilgjengelige for å mekanisk fikse det lille molekylet ved kobling. Videre, visse tull deler av peptider kan resultere i påvisning av en del av proteinet ikke relevant for narkotika docking som falske positive. Dette tilsvarer empirisk til beta-ark eller leucinrike domener rik på leucin eller valinrester, som er kodet av flere kodoner enn andre standard aminosyrer, når kopier av T7 phage produseres. Kontrollere biblioteket peptid lengde kan kontrollere forekomsten av falske positive. I motsetning kan det være tilfeller der aminosyrerester i det legemiddelbindende stedet som er involvert i dokking, som demonstrert ved hjelp av røntgenkrystallografi eller NMR-analyse, ikke oppdages. Dette kan løses ved å samle et større antall av de legemiddel gjenkjennende peptidene eller endre retningen for å feste de små molekylene på gullelektroden.
Mange legemiddel-protein interaksjoner som er relatert til de viktigste og sekundære effektene av narkotikabruk kan ennå være uidentifisert i proteome; i tillegg kan enzymer og transportører som er ansvarlige for legemiddelabsorpsjon, distribusjon, metabolisme, utskillelse og toksisitet, også fortsatt være uidentifisert. Proteinbinding er ikke alltid ansvarlig for bioaktiviteten til et stoff. Dermed vil en kombinasjon av annen informasjon fra biologiske analyser forbedre identifiseringen av essensielle legemiddelmål som er ansvarlige for de viktigste og negative effektene av narkotika. Ytterligere tilpasninger av denne konsise teknikken vil øke det praktiske og gjennomstrømningen for gruvedrift av proteinbindende steder av et bredt spekter av små molekylmedisiner. Metoden som presenteres her, vil i stor grad bidra til ikke bare å utføre grunnleggende undersøkelser på de relaterte feltene, men også klargjøre de molekylære mekanismene som ligger til grunn for terapeutisk effekt eller andre biologiske effekter av legemidler i klinisk bruk.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatteren takker Drs. Yujiro Hayashi og Hayato Ishikawa for å gi oseltamivir, og Dr. Lee Makowski for å gi de frittstående RELIC-programmene. Forfatteren anerkjenner også Tetsuya Kawagoe for teknisk assistanse fra QCM-eksperimentet. Dette arbeidet ble delvis støttet av JSPS KAKENHI Grant Number 17K01363 (Y.T.).
ERKLÆRING OM TILGJENGELIGHET AV DATA
De frittstående RELIC-programmene og sekvensdataene for affinitetsvalgte peptider for legemidler samt proteinsekvensene fra proteomdatabasen som brukes i dette papiret, er tilgjengelige fra denne forfatteren på forespørsel (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFFINIXQN | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCM2008-STKIT | Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC |
| AADIV | Northeastern University (Lee Makowski) |
AADIV.exe | Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library. |
| Ceramic Sensor Chip | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMST27C | 4 sensor chips/package |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
D8418 | |
| Ethanol | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 09-0850 | |
| FASTAcon | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAcon.exe | Identifies proteins from a population with short consensus sequences. |
| FASTAskan | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAskan.exe | Lists proteins with high similarity to a peptide population. |
| Immiblization kit for AFFINIX | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMIMKT | SAM reagent and amine coupling reagent |
| INFO | Northeastern University (Lee Makowski) |
INFO.exe | Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule). |
| Liquid LB medium | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
L3522 | Autoclave for 20 min |
| MATCH | Northeastern University (Lee Makowski) |
MATCH.exe | Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length). |
| MOTIF1 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF1.exe | Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population. |
| MOTIF2 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF2.exe | Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths. |
| NaCl | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | S3014 | |
| Receptor ligand contacts (RELIC) | Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA) |
https://www.relic.anl.gov | Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request) |
| Tris | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 252859 |
References
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack. Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Piggott, A. M., Karuso, P. Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display. Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule. Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).
- Takakusagi, Y., et al. Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display. ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).
- Novagen. T7 Select® System Manual. Novagen. , TB178 1009JN (2009).
- Novagen. OrientExpressTM cDNA Manual. Novagen. , TB247 1109JN (2009).
- Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. RELIC--a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites. Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).
- Makowski, L. Phage Nanobiotechnology. Petrenko, V. A., Smith, G. P. , RSC Publishing. Ch. 3 33-54 (2011).
- Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins. Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).
- Harel, M., et al. The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action. Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).
- Dodds, H. M., Rivory, L. P. The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11). Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).
- Bencharit, S., et al. Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases. Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).
- Kim, C. U., et al. Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity. Journal of the American Chemical Society. 119 (4), 681-690 (1997).
- Hoffmann, G., et al. Nonclinical pharmacokinetics of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in the central nervous system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4753-4761 (2009).
- Wishart, D. S., et al. DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018. Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).
- Takakusagi, K., et al. Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).
- Takakusagi, Y., et al. Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).
- Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device. World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).
- Kusayanagi, T., et al. The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).
- Takakusagi, Y., et al. Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).
- Rodi, D. J., et al. Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).
