Summary
تم إجراء تلطيخ الكيمياء المناعية وتسلسل جين الحمض النووي الريبي الريبوسومي 16S (جين 16S rRNA) من أجل اكتشاف البكتيريا والتمييز بينها في أنسجة المبيض السرطانية وغير السرطانية في الموقع. تم التنبؤ بالاختلافات التركيبية والوظيفية للبكتيريا باستخدام BugBase والتحقيق النباتي للمجتمعات عن طريق إعادة بناء الدول غير الملمة (PICRUSt).
Abstract
نظرية "عقيمة" الجهاز التناسلي العلوي الإناث تواجه معارضة متزايدة بسبب التقدم في الكشف عن البكتيريا. ومع ذلك، لم يتم بعد تأكيد ما إذا كان المبيضان يحتويان على البكتيريا. هنا، تم إدخال تجربة للكشف عن البكتيريا في أنسجة المبيض. اخترنا مرضى سرطان المبيض في مجموعة السرطان والمرضى غير السرطانيين في مجموعة التحكم. 16S تم استخدام تسلسل الجينات rRNA للتمييز بين البكتيريا في أنسجة المبيض من السرطان ومجموعات التحكم. وعلاوة على ذلك، توقعنا التكوين الوظيفي للبكتيريا التي تم تحديدها باستخدام BugBase وPICRUSt. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة في الأحشاء والأنسجة الأخرى منذ العديد من الأجهزة قد ثبت لإيواء البكتيريا في السنوات الأخيرة. قد يساعد وجود البكتيريا في الأحشاء والأنسجة العلماء على تقييم الأنسجة السرطانية والعادية وقد يساعد في علاج السرطان.
Introduction
في الآونة الأخيرة ، تم نشر عدد متزايد من المقالات التي تثبت وجود البكتيريا في الأحشاء الصلبة في البطن ، مثل الكلى والطحال والكبد والمبيض1،2. جيلر وآخرون وجدت البكتيريا في أورام البنكرياس, وكانت هذه البكتيريا مقاومة لgemcitabine, دواء العلاج الكيميائي2. S. مانفريدو فييرا وآخرون خلصت إلى أن المكورات المعوية gallinarum المحمولة إلى الغدد الليمفاوية, الكبد والطحال, ويمكن أن تدفع المناعة الذاتية3.
وبما أن عنق الرحم يلعب دورا كمدافع، فقد تم إجراء أبحاث طفيفة على البكتيريا الموجودة في الجهاز التناسلي العلوي للأنثى، والتي تحتوي على الرحم وقناتي فالوب والمبيضين. ومع ذلك، تم وضع بعض النظريات الجديدة في السنوات الأخيرة. البكتيريا قد يكون الوصول إلى تجويف الرحم خلال الدورة الشهرية بسبب التغيرات في mucins4,5. بالإضافة إلى ذلك، أكد زيرفومنولاكيس وآخرون أن الرحم، جنبا إلى جنب مع قناتي فالوب، هو مضخة تمعج يسيطر عليها نظام الغدد الصماء في المبيضين، وهذا الترتيب يمكن البكتيريا من دخول بطانة الرحم وقناتي فالوب والمبيضين6.
لم يعد الجهاز التناسلي العلوي لغزا بعد الآن بفضل تطوير طرق الكشف البكتيرية. Verstraelen وآخرون استخدم الباركود المقترن نهاية طريقة التسلسل لاكتشاف البكتيريا الرحمية من خلال استهداف في منطقة V1-2 hypervariable من الجين RNA 16S7. فانغ وآخرون تستخدم تسلسل الباركود في المرضى الذين يعانون من الاورام الحميدة بطانة الرحم وكشفت عن وجود البكتيريا داخل الرحم المتنوعة8. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام الجين RNA 16S، مايلز وآخرون وتشن وآخرون وجدت البكتيريا في الجهاز التناسلي للنساء الذين خضعوا لاستئصال السالبنغو-oophorectomy واستئصال الرحم، على التوالي5،9.
اكتسبت البكتيريا في أنسجة الورم اهتماما متزايدا في السنوات الأخيرة. اكتشف بانيرجي وآخرون أن توقيع الميكروبيوم يختلف بين مرضى سرطان المبيض ويتحكمفي 10. وارتبطتنوكسيناترونوم سيبيريكوم مع مرحلة الورم, ويمكن استخدام ميثانوسارسينا vacuolata لتشخيص سرطان المبيض11. بالإضافة إلى سرطان المبيض، أثبتت أنواع السرطان الأخرى، مثل المعدة والرئة والبروستاتا والثدي وعنق الرحم والبطانة، أنها مرتبطة بالبكتيريا12و13و14و15و16و17و18. اقترح Poore وآخرون فئة جديدة من تشخيص الأورام القائم على الميكروبات ، وتوقع في مرحلة مبكرة من فحص السرطان19. في هذا البروتوكول، قمنا بالتحقيق في الاختلافات بين أنسجة المبيض السرطانية والعادية من خلال مقارنة تكوين ووظيفة البكتيريا في هذين النسيجين.
تم إجراء تلطيخ الكيمياء المناعية وتسلسل الجينات 16S rRNA لتأكيد وجود البكتيريا في المبيضين. تمت دراسة الاختلافات والوظائف المتوقعة لبكتيريا المبيض في أنسجة المبيض السرطانية وغير السرطانية. وأظهرت النتائج وجود البكتيريا في أنسجة المبيض. كانت مرتبطة Anoxynatronum سيبيريكوم وVacuolata ميتانوساركينا إلى المرحلة وتشخيص سرطان المبيض، على التوالي. تمت مقارنة ستة وأربعين مسارا مختلفا بشكل كبير ل KEGG كانت موجودة في كلتا المجموعتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت على هذه الدراسة لجنة الأخلاقيات المؤسسية الطبية التابعة لأول مستشفى منتسب لجامعة شيان جياوتونغ (رقم XJTUIAF2018LSK-139). وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المرضى المسجلين.
1. معايير دخول مجموعة السرطان ومجموعة المكافحة
- بالنسبة لمجموعة السرطان ، تسجيل المرضى الذين يتم تشخيصهم في المقام الأول بسرطان المبيض ، وبعد استئصال البطن ، ثبت أنهم مصابون بسرطان المبيض المصلي من خلال النتائج المرضية.
- بالنسبة لمجموعة التحكم ، قم بتسجيل المرضى الذين يتم تشخيصهم في المقام الأول بالورم النخاعي الرحمي أو غد الرحم ، دون تقديم أي حالة المبيض ، والذين خضعوا لاستئصال الرحم واستئصال المبيض.
ملاحظة: هذا المعيار غير محدد. كما يمكن تسجيل المرضى الذين يعانون من أمراض لا تؤثر على المبيضين الذين يخضعون لاستئصال الرحم واستئصال السالبنغو أوفورو. - استبعاد المرضى الذين يعانون من واحد أو أكثر من المعايير التالية:
النساء الحوامل أو المرضعات.
تناول المضادات الحيوية قبل شهرين من الجراحة.
وجود حمى أو علامات التهابية مرتفعة.
وجود التهاب من أي نوع.
بعد أن خضع للعلاج الكيميائي neoadjuvant.
2. جمع العينات
- أثناء الجراحة، ضع المبيضين المستئصالين في أنبوب معقم وضع الأنبوب في النيتروجين السائل لنقله. تجنب لمس أي شيء آخر طوال العملية بأكملها.
- فصل المبيضين إلى عينات الأنسجة سميكة ما يقرب من 1 سم مع زوج من ملاقط عقيمة جديدة تحت خزانة تدفق صفح. بعد الانفصال، احتفظ بالعينات عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: جميع إجراءات جمع العينات هي مطهرة، بما في ذلك فصل المبيضين.
3. تسلسل الجين 16S rRNA
- استخراج الحمض النووي.
- إضافة 1.2 مل من العازلة EX تمنع في أنبوب الطرد المركزي 2 مل. ثم، إضافة 180-220 ملغ من العينات في الأنبوب. دع العينة تختلط بالكامل (70 درجة مئوية حمام مائي لمدة 5 دقائق ثم دوامة لمدة 15 s).
- الطرد المركزي أنبوب لمدة 1 دقيقة في 600 × ز.
- ضع 550 ميكرولتر من الناطور في أنبوب جديد سعة 1.5 مل، وطارد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 600 × ز.
- نقل 400 ميكرولتر من supernatant مع 30 ميكرولتر من البروتين K إلى أنبوب آخر 1.5 مل.
- إضافة 400 ميكرولتر من AL العازلة واستخدام خلاط دوامة لمدة 15 ثانية.
- حضانة في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 400 ميكرولتر من الكحول 96-100٪. استخدام خلاط دوامة لمدة 15 ق.
- نقل 600 ميكرولتر من الخليط إلى عمود امتصاص وطارد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 13700 غرام. تبادل أنبوب أقل. كرر هذه الخطوة 11 مرة.
- أضف 500 ميكرولتر من AW1 العازلة، والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 13700 × غرام، وغير الأنبوب السفلي.
- أضف 500 ميكرولتر من AW2 العازلة، والطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 13700 × ز، وغير الأنبوب السفلي.
- جهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 13,700 x g.
- نقل الخليط إلى أنبوب جديد 1.5 مل، إضافة 200 ميكرولتر من ATE العازلة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 13700 × ز.
- اختبار الجودة. استخدام 1٪ سيفروز هلام الكهربائي لاختبار الجودة. إضافة 400 نانوغرام من العينة، 120 V، 30 دقيقة. النتيجة المثالية: تركيز الحمض النووي: ≥ 10 نانوغرام/ميكرولتر، نقاء الحمض النووي: A260/A280 = 1.8-2.0، الحمض النووي الإجمالي: ≥ 300 نانوغرام.
- إعداد المكتبات باستخدام مجموعة تسلسل metagenomic 16S وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- تنفيذ PCR. باختصار، كل تفاعل PCR 25 ميكرولتر يحتوي على 12.5 نانوغرام من عينة الحمض النووي كمدخل، 12.5 ميكرولتر من 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix و 5 ميكرولتر من كل التمهيدي في 1 ميكرومتر.
- تنفيذ PCR باستخدام البروتوكول التالي: خطوة التشبع الأولية التي أجريت في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق تليها 25 دورات من التشبع (95 درجة مئوية، 30 ق)، والتمليس (55 درجة مئوية، 30 s) وتمديد (72 درجة مئوية، 30 ق)، والاطالة النهائية من 5 دقائق في 72°C.
- تنظيف المنتج PCR من مزيج التفاعل مع الخرز المغناطيسي باستخدام تعليمات الشركة المصنعة.
- كرر الخطوتين 3.3.1 و3.3.2.
- اختبار الجودة. يرجى الرجوع إلى الخطوة 3.2.
- كرر الخطوة 3.3.3.
- اختبار الجودة. استخدام 1٪ سيفروز هلام الكهربائي لاختبار النجاسة، والمطياف لاختبار النقاء، والفلورومتر لاختبار التركيز، وعدة فحص الحمض النووي الريبي لاختبار السلامة. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة. تطبيع وتجميع المكتبات؛ ثم تسلسل (2 × 300 نقطة أساس المقترنة نهاية إعداد القراءة) باستخدام 600 دورة V3 خلايا التدفق القياسية، وإنتاج ما يقرب من 100،000 المقترنة نهاية 2 × 300 يقرأ قاعدة.
ملاحظة: تسلسل التمهيدي كامل الطول: 16S أمبيرليكون بوليمراز سلسلة من ردود الفعل (PCR) التمهيدي الأمامي: 5 ' TCGTCGGGCGCGTGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGG CWGCAG] و16S أمبيرليكون PCR التمهيدي العكسي: 5 'GTCTCGTGGGCTCGGGAGGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGTATCTAATCC].
4. تحليل 16S rRNA بيانات تسلسل الجينات
- تصفية قراءات الخام من كل عينة على أساس جودة التسلسل مع حزمة البرمجيات QIIME 2-20180220.
- نسخ ثلاثة ملفات في الدليل: emp-المقترنة-end-sequences_01
ملف .gz forward.fastq واحد يحتوي على قراءة التسلسل للأمام،
ملف واحد عكس.fastq.gz يحتوي على قراءة التسلسل العكسي،
ملف واحد barcodes.fastq.gz يحتوي على الرمز الشريطي المقترن يقرأ - أعدم
استيراد أدوات qiime \
--اكتب EMPPairedEndSequences \
--input-path emp-يقترن-نهاية-sequences_01 \--إخراج-مسار emp-المقترن-نهاية-sequences_02.qza
- نسخ ثلاثة ملفات في الدليل: emp-المقترنة-end-sequences_01
- إزالة التمهيدي ومحول تسلسل.
qiime قطعة تقليم يقترن \
--i-demultiplexed-تسلسلات demultiplexed-seqs_02.qza \
--ف الجبهة و GCTACGGGGGG \
-- ف الجبهة ص GCTACGGGGGG \
--p-معدل الخطأ 0 \
--الجودة قطع 25 \
--o-قلصت تسلسل قلصت-seqs_03.qza \
--مطول - تقصير تسلسل يقرأ فيها كل من الصفات المقترنة نهاية أقل من 25. انظر أعلاه -- الجودة قطع 25
- تحليل بيانات التسلسل.
- جمع تسلسل لتشكيل وحدات التصنيف التشغيلية (OTUs) مع قطع التشابه في 97٪.
qiime vsearch تسلسلات dereplicate \
--i-تسلسل قلصت-seqs_03.qza \
-- س dereplicated الجدول table_04.qza \
--o-تسلسلات dereplicated-rep-seqs_04.qza
qiime vsearch الكتلة ميزات مغلقة المرجع \
--i-الجدول table_04.qza \
--i-تسلسل مندوب seqs_04.qza \
--i-تسلسل مرجع 97_otus.qza \
--p-perc-الهوية 0.97 \
-- س جدول متفاوت المسافات - cr - 97.qza \
--o-متفاوتة-تسلسلات مندوب-seqs-cr-97.qza \
--o-لا مثيل لها تسلسل لا مثيل لها cr-97.qza - بالنسبة ل OTUs، احسب الوفرة النسبية في كل عينة. وفرة المعلومات في الجدول cr-97.qza
- جمع تسلسل لتشكيل وحدات التصنيف التشغيلية (OTUs) مع قطع التشابه في 97٪.
- توظيف مصنف بايزي الأصلي، الذي يهدف إلى مجموعة التدريب RDP (الإصدار 9؛ http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)، لفرز جميع التسلسلات. معلومات التصنيف المعينة في الجدول cr-97.qza
- ضمن وحدة الإرسال الكبرى المعينة، قم بتعيين تصنيف يعكس التماسك الرئيسي للتسلسلات إلى وحدات OTUs. ثم قم بمحاذاة وحدات OTUs. انظر الجدول cr-97.qza وممثل-seqs-cr-97.qza
- استنادا إلى معلومات مجموعة العينة، قم بأداء فهارس ألفا المتنوعة (بما في ذلك فهارس تشاو 1، ACE، شانون، سيمبسون و Evenness) وتحليل الإحداثيات الرئيسية المستندة إلى UniFrac (PCoA).
تصدير أدوات qiime \
--الإدخال المسار الجدول cr-97.qza \
--output-مسار تصدير-ميزة-جدول
تصدير ميزة الجدول
qiime التنوع ألفا \
--i جدول-cr-97.qza \
--p-متري observed_otus \
-- o-ألفا التنوع observed_otus_vector.qza
qiime التنوع بيتا \
--i جدول-cr-97.qza \
--p متري برايكورتس \
--o مصفوفة المسافة unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. التنبؤ بالوظيفة البكتيرية
- للتنبؤ بالتمثيل ذي الصلة لخصائص البكتيريا ، استخدم BugBase21. يتم إعداد جدول OTU الإدخال ل BugBase باستخدام الأوامر التالية.
biom تحويل -i otu_table.biom -o otu_table.txt --إلى tsv
biom تحويل -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --الجدول نوع = "OTU الجدول" -- إلى json
ملاحظة: يستند التنبؤ إلى ست فئات من النمط الظاهري (Ward et al. غير منشورة) (https://bugbase.cs.umn.edu/): تلطيخ الغرام، وتحمل الأكسجين، والقدرة على تشكيل الأغشية الحيوية، ومحتوى العنصر المتنقل، والتسبب في الأمراض، وتحمل الإجهاد التأكسدي. - التنبؤ التكوين الوظيفي للميتاجينوم من قبل PICRUSt مع استخدام البيانات الجينية علامة وقاعدة بيانات تحتوي على الجينوم المرجعي22.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt-t/mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f-i metagenome_predictions.biom-c KEGG_Pathways-l 1-o metagenome_predictions. L1.txt - تحليل الاختلافات في الوظائف بين كل مجموعة بمساعدة STAMP23،24. يرجى الرجوع إلى الاستشهادات لتشغيل البرنامج.
6. البيانات
- استخدام البرامج الإحصائية لحساب أهمية النتائج. وينبغي تحديد الإشارة إلى الأهمية الإحصائية على أنها P < 0.05.
- تقييم الفروق في العمر والتكافؤ حسب اختبار الطالب t. تقييم الاختلافات في حالة انقطاع الطمث، وتاريخ ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري عن طريق اختبار تشي مربع. تقييم الاختلافات في عدد من الأنواع البكتيرية المبيض من قبل اختبار مان ويتني يو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المرضي
وشملت الدراسة ما مجموعه 16 مريضا مؤهلا. وشملت مجموعة المراقبة 10 نساء مع تشخيص ورم الرحم الحميد (من بينها، تم تشخيص 3 مرضى مع الورم النخاعي الرحمي، وتم تشخيص 7 مرضى مع غد الرحم). وفي الوقت نفسه، احتوت مجموعة السرطان على 6 نساء مصابات بتشخيص لسرطان المبيض المصلي (من بينهن مريضان تم تشخيصإصابتهما بالمرحلة الثانية، وتم تشخيص حالتين منهن بالمرحلة الثالثة). لم تظهر الخصائص التالية أي اختلافات بين المرضى في المجموعة الرقابية ومجموعة السرطان: العمر، وحالة انقطاع الطمث، والتكافؤ، وتاريخ ارتفاع ضغط الدم، وتاريخ مرض السكري (الجدول 1).
الجدول 1: إحصائيات المرضى يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
ثراء وتنوع الأنواع البكتيرية المبيض في كلتا المجموعتين
وقد ظهر وجود البكتيريا باستخدام تلطيخ الكيمياء المناعية في الشكل 1. تم تحليل تنوع ألفا من الميكروبات كوسيلة للكشف عن ثراء وتنوع الأنواع البكتيرية المبيض. كان عدد الأنواع التي لوحظت في أنسجة سرطان المبيض أقل من عدد الأنواع في مجموعة التحكم ، دون فرق كبير. ثراء (ممثلة في مؤشر تشاو 1 وACE) والتنوع (ممثلة شانون، سيمبسون، ومؤشر التساوي) من الأنواع البكتيرية على حد سواء لم تكن مختلفة بشكل كبير بين مجموعة السرطان ومجموعة التحكم(الشكل 2).
الشكل 2: 16S rRNA تسلسل الجينات يظهر الاختلافات بين السرطان ومجموعات التحكم في الثراء البكتيري والتنوع. (أ) مؤشر الأنواع الملاحظ(P = 0.06، مان ويتني U اختبار)؛ (ب) مؤشر تشاو 1 (P = 0.06، اختبار مان ويتني U)؛ (C) مؤشر ACE (P = 0.06، اختبار مان ويتني U)؛ (د) مؤشر شانون (P = 0.32، اختبار مان ويتني U؛ E. مؤشر التعادل (P = 0.48، مان ويتني U اختبار)؛ (F) مؤشر سيمبسون (P = 0.46 ، مان ويتني يو اختبار). حصلنا على إذن إعادة الطباعة من الناشرين السابقين. وقد تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وصف بكتيريا المبيض
تم إجراء التسلسل العميق لمنطقة الجينات V3-V4 16S rRNA على جميع العينات للحصول على فهم أفضل لبكتيريا المبيض. وأظهرت النتائج أن Proteobacteria كان الفيلوم الأكثر وفرة (67.10٪ في مجموعة التحكم و 67.20٪ في مجموعة السرطان)، وكان Firmicutes ثاني أكثر فيلوم وفرة (23.7 7٪ في المجموعة المكافحة و23.82٪ في مجموعة السرطان)، والثالث الأكثر وفرة كان البكتيريا (3.26٪ في مجموعة المكافحة و3.41٪ في مجموعة السرطان). وعند تحليل أنواع مجموعة التحكم، تألف التركيب الرئيسي من هالوباكتيريز هالوبايوس (14.53 في المائة)، يليه جيماتا غامضة غلوبوس (11.07 في المائة) وميثيلوبروفوندوس الرسوبي (10.69 في المائة). وبالنسبة لمجموعة السرطان، كانت جيماتا غامضة الغلوبس الأغنى في المجموعة (13.89 في المائة)، تليها هالوباكتيريدوس هالوبيوس (11.99 في المائة) وميثيلوبروفنوس الرسوبي (11.12 في المائة)(الشكل 3).
الشكل 3:وفرة نسبية من فيلا (> 1٪) ومن أفضل 12 نوعا في عينات المبيض. (أ) وفرة النسبية للphyla (> 1٪) في المبيضين من المرضى في المجموعة السيطرة. (ب) وفرة النسبية للphyla (> 1٪) في المبيضين من المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض. (ج) وفرة النسبية من الأنواع البكتيرية 12 الأكثر وفرة في المبيضين من المرضى السيطرة. (د) وفرة النسبية من الأنواع البكتيرية 12 الأكثر وفرة في المبيضين من مرضى سرطان المبيض. حصلنا على إذن إعادة الطباعة من الناشرين السابقين. وقد تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تركيبات مختلفة من بكتيريا المبيض بين المجموعتين
وأجريت مقارنة بين المجتمعات البكتيرية المختلفة من قبل PCoA باستخدام PERMANOVA. وأظهرت النتائج أن البكتيريا في مجموعة التحكم تختلف عن تلك الموجودة في مجموعة السرطان، P < 0.05(الشكل 4).
الشكل 4:يكتشف برنامج العمل الإنمائي مجموعات من المجتمعات المحلية، وتتجمع الوفرة النسبية لمجتمعات أنوكسيناترونوم سيبيريكوم وميثانوساركينا فاكولاتا.(أ) باستخدام PCoA. يتم رسم PC1 و PC2 على محاور س و ص. تشير الكتلة الحمراء إلى عينة في مجموعة سرطان المبيض. تشير الدائرة الزرقاء إلى عينة في مجموعة التحكم. تم فصل العينات من مجموعة سرطان المبيض من عينات أخرى في مجموعة التحكم. (ب) المجتمعات المحلية المتجمعة باستخدام برنامج العمل الشامل. يتم رسم PC1 و PC2 على محاور س و ص. تشير الكتلة الحمراء إلى عينة في مجموعة سرطان المبيض. تشير الدائرة الصلبة الزرقاء إلى عينة من مريض مصاب بالورم النخاعي الرحمي ، والدائرة الزرقاء المجوفة تساوي عينة من مريض مصاب بداء الغدة الرحمية. (ج) وفرة النسبية من Anoxynatronum sibiricum (مجموعة التحكم: ن = 10، مجموعة السرطان: ن = 6، P = 0.034، مان ويتني U اختبار). (د) وفرة النسبية من Vacuolata ميتانوساركينا (مجموعة التحكم: ن = 10، مجموعة السرطان: ن = 6، P = 0.001، مان ويتني U اختبار). حصلنا على إذن إعادة الطباعة من الناشرين السابقين. وقد تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تكوين بكتيري المبيض في السرطان ومجموعات التحكم من وجهات نظر مختلفة
تم إجراء تحليل لتكوين بكتيري المبيض من وجهات نظر مختلفة لمزيد من الكشف عن الاختلافات في بكتيريا المبيض المحددة. في الجدول 2، تم النظر في مستويات الفيلوم والطبقة والنظام والأسرة وال جنس والأنواع ، ويتم توفير الإحصاءات في الرسم البياني. على وجه الخصوص ، كان هناك ارتباط بين وفرة النسبية من Anoxynatronum sibiricum ومرحلة الورم ، وكان ميثانوساركينا vacuolata علامة محددة عند تشخيص سرطان المبيض(الجدول 2).
الحفاظ على Phenotypic من بكتيريا المبيض في المجموعتين على أساس الوظائف المتوقعة
في مجموعة السرطان ، تم زيادة التعبير عن الجينات المتعلقة بالأنماط الظاهرية التي يحتمل أن تكون مسببة للأمراض والأكسدة المتسامحة مع الإجهاد مقارنة بمجموعة التحكم (اختبار ويلكوكسون الموقع ، P = 0.02 و P = 0.002). لم يتم العثور على فرق كبير بين سرطان المبيض ومجموعات التحكم في الجوانب التالية: الأنماط الظاهرية للبكتيريا الهوائية واللاهوائية واللاهوائية من الناحية الكلية وإيجابية الغرام والسلبية للجرام؛ والبكتيريا اللاهوائية من الناحية الكلية، والبكتيريا الإيجابية للجرام، والبكتيريا السالبة للجرام؛ والبكتيريا اللاهوائية، والبكتيريا التي لا تتبع الجرامات؛ والبكتيريا اللاهوائية. عناصر متنقلة؛ وتشكيل بيو فيلم من البكتيريا المبيض (الشكل 5). تم تحديد 46 مسارا مختلفا ل KEGG بين البكتيريا في المبيضين في مجموعات السرطان والسيطرة. أظهر المبيضان في مجموعة السرطان 26 مسارا متزايدا. ومن بينها، كانت أكثر المسارات ارتباطا هي الناقلات. من ناحية أخرى ، أظهرت البكتيريا في أنسجة سرطان المبيض 20 مسارا مخفضا. وكانت الوظائف الأكثر صلة كما يلي: نظام إفراز، وظائف غير معروفة، ونظام مكونين. وتظهر بقية المسارات في الشكل 6.
الشكل 1:LPS التعبير المناعي الهسيميائي في المبيضين. (أ) مجموعة التحكم (10 x). أشرطة المقياس، 200 ميكرومتر (ب) مجموعة التحكم (40 x). أشرطة مقياس، 50 ميكرومتر (C) مجموعة السرطان (10x). أشرطة المقياس، 200 ميكرومتر (D) مجموعة السرطان (40 x). أشرطة المقياس، 50 ميكرومتر. تشير الأسهم إلى تلطيخ LPS في أنسجة المبيض. حصلنا على إذن إعادة الطباعة من الناشرين السابقين. وقد تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:المولدات الفوقية المتوقعة التي حللتها BugBase. تم زيادة التعبير عن بعض الجينات في مجموعة السرطان مقارنة مع تلك الموجودة في مجموعة التحكم. ارتبطت هذه الجينات بالأنماط الظاهرية المحتملة للأمراض (اختبار ويلكوكسون الموقع، P = 0.02) والأنماط الظاهرية المتسامحة مع الإجهاد التأكسدي للمبيضين. (ويلكوكسون موقعة رتبة اختبار، P = 0.002). حصلنا على إذن إعادة الطباعة من الناشرين السابقين. وقد تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: PICRUSt تحليل مسارات KEGG مختلفة بين السرطان ومجموعات التحكم. حصلنا على إذن إعادة الطباعة من الناشرين السابقين. وقد تم تعديل هذا الرقم من وانغ وآخرون11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 2: الثراء (ممثلة في مؤشر تشاو 1 وACE) والتنوع (ممثلة في مؤشر شانون، سيمبسون، والالتساوي) من الأنواع البكتيرية يرجى النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سرطان المبيض له تأثير ملحوظ على خصوبة المرأة25. يتم تشخيص معظم مرضى سرطان المبيض في المراحل المتأخرة، ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات هو أقل من 30٪18. وقد نشر تأكيد للبكتيريا في الأحشاء الصلبة في البطن، بما في ذلك الكبد والبنكرياس والطحال. يحدث وجود البكتيريا في الجهاز التناسلي الأنثوي العلوي لأن عنق الرحم غير مغلق2،3،4،5. ومع ذلك، لم يتم بعد تحديد ما إذا كان المبيضان، وهما أحشاء صلبة في البطن، معقمين أم لا. بالإضافة إلى ذلك، ما إذا كانت البكتيريا في المبيضين مرتبطة بسرطان المبيض هو أيضا سؤال مهم.
تمت مقارنة الاختلافات الكبيرة في البكتيريا التي وجدناها بين مجموعات مختلفة. وكانت جميع الإجراءات المذكورة أعلاه خالية من الجراثيم تماما، بما في ذلك الأجهزة والكواشف والمعدات وتشغيل البروتوكول بأكمله. والأهم من ذلك، استخدمنا المبيضين من المرضى الذين يعانون من مرض الرحم الحميد كمجموعة مراقبة لمواجهة التلوث المحتمل. ومع ذلك، لا يمكن تجنب التلوث في هذا البروتوكول. وهكذا، بما أن مجموعة السرطان ومجموعة المكافحة تم تحليلهما في نفس البيئة التجريبية، فقط من خلال مقارنة الاختلافات بين هاتين المجموعتين، يمكننا الحصول على أدلة أولية حول الأصل الميكروبيولوجي لسرطان المبيض.
قد تبدأ نتائج البكتيريا في أنسجة المبيض مجالا جديدا للتحقيق في البكتيريا التي تؤثر على سرطان المبيض. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي الوجود الفريد للبكتيريا وتكوينها في أنسجة المبيض السرطانية إلى توجيه التسرطن لسرطان المبيض، والأهداف العلاجية والتكهناتية للبكتيريا. من بين مسارات KEGG ال 46 ، لفتت الوظائف المتعلقة بالانضال الحيوي للمضادات الحيوية لمجموعة فانكومايسين اهتماما خاصا. وهذا قد يوفر المزيد من خيارات العلاج لسرطان المبيض.
ومع ذلك، كان البروتوكول بعض القيود. أولا، لم يكن من الممكن جمع العينات من الأشخاص الأصحاء لأسباب أخلاقية. كانت مجموعة التحكم هي المبيضين للمرضى الذين يعانون من مرض الرحم الحميد (بما في ذلك الورم النخاعي الرحمي وداء الغدة). ثانيا، يجب أن يكون عدد العينات أكبر. وقد يعوق حجم العينة المحدود للدراسة دقة النتائج. ثالثا، على الرغم من أن مجموعة السرطان ومجموعة المكافحة كانتا تحت نفس الظروف، لم تكن هناك ضوابط سلبية أو إيجابية. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تجنب التلوث. حتى الآن، دراسة بكتيريا المبيض في المرضى الذين يعانون من سرطان المبيض لا تزال في مرحلة مبكرة. هناك حاجة إلى دراسة على نطاق أوسع مع المزيد من العينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال جائزة البحوث السريرية لأول مستشفى تابع لجامعة شيان جياوتونغ، الصين (XJTU1AF-2018-017، XJTU1AF-CRF-2019-002)، مشروع البحوث الأساسية الرئيسية للعلوم الطبيعية في إدارة العلوم والتكنولوجيا الإقليمية شنشي (2018JM7073، 2017ZDJC-11)، المشروع الرئيسي للبحث والتطوير التابع لإدارة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة شنشي (2017ZDXM-SF-068، 2019QYPY-138)، مشروع الابتكار التكنولوجي التعاوني لمقاطعة شنشي (2 017XT-026, 2018XT-002), ومشروع البحوث الطبية لخطة شيان لتوجيه التنمية الاجتماعية (2017117SF/YX011-3). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار نشر المخطوطة أو إعدادها.
نشكر الزملاء في قسم أمراض النساء في المستشفى التابع الأول لجامعة شيان جياوتونغ على مساهماتهم في جمع العينات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
References
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al.
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
