Summary
A coloração imunohistoquímica e o sequenciamento do gene RNA ribossômico 16S (gene 16S rRNA) foram realizados a fim de descobrir e distinguir bactérias em tecidos ovarianos cancerígenos e não cancerígenos in situ. As diferenças composicionais e funcionais das bactérias foram previstas pelo uso do BugBase e da Investigação Filogenética das Comunidades por Reconstrução de Estados Não Observados (PICRUSt).
Abstract
A teoria de um trato reprodutivo superior feminino "estéril" vem encontrando crescente oposição devido aos avanços na detecção bacteriana. No entanto, ainda não foi confirmado se os ovários contêm bactérias. Aqui, um experimento para detectar bactérias em tecidos ovarianos foi introduzido. Escolhemos pacientes com câncer de ovário no grupo de câncer e pacientes não cancerígenos no grupo controle. O sequenciamento genético rRNA 16S foi usado para diferenciar bactérias em tecidos ovarianos dos grupos de câncer e controle. Além disso, previmos a composição funcional das bactérias identificadas usando BugBase e PICRUSt. Este método também pode ser usado em outras vísceras e tecidos, uma vez que muitos órgãos têm sido comprovados para abrigar bactérias nos últimos anos. A presença de bactérias em vísceras e tecidos pode ajudar os cientistas a avaliar tecidos cancerígenos e normais e pode ser ajuda no tratamento do câncer.
Introduction
Recentemente, foram publicados um número crescente de artigos que comprovam a existência de bactérias em vísceras sólidas abdominais, como rim, baço, fígado e ovário1,2. Geller et al. encontraram bactérias em tumores pancreáticos, e essas bactérias eram resistentes à gemcitabina, uma droga quimioterápica2. S. Manfredo Vieira et al. concluíram que Enterococcus gallinarum era portátil para os linfonodos, fígado e baço, e poderia conduzir autoimunidade3.
Como o colo do útero desempenha um papel como defensor, bactérias no trato reprodutivo feminino superior, que contém o útero, tubos de falópio e ovários, têm sido minimamente pesquisadas. No entanto, algumas novas teorias foram estabelecidas nos últimos anos. As bactérias podem ter acesso à cavidade uterina durante o ciclo menstrual devido a alterações nas mucinas4,5. Além disso, Zervomanolakis et al. confirmaram que o útero, juntamente com os tubos de falópio, é uma bomba peristáltica controlada pelo sistema endócrino dos ovários, e esse arranjo permite que as bactérias entrem no endométrio, tubos de falópio e ovários6.
O trato reprodutivo superior não é mais um mistério graças ao desenvolvimento de métodos de detecção bacteriana. Verstraelen et al. usaram um método de sequenciamento de ponta emparelhado em código de barras para descobrir bactérias uterinas mirando na região hipervariável V1-2 do gene RNA16S 7. Fang et al. utilizaram sequenciamento de código de barras em pacientes com pólipos endometrial e revelaram a presença de diversas bactérias intrauterinas8. Além disso, usando o gene RNA 16S, Miles et al. e Chen et al. encontraram bactérias no sistema genital de mulheres que haviam sido submetidas à salpingo-oofrectomia e histerectomia,respectivamente 5,9.
Bactérias nos tecidos tumorais têm ganhado cada vez mais atenção nos últimos anos. Banerjee et al. descobriram que a assinatura do microbioma diferia entre pacientes com câncer de ovário e controles10. Umsibiricum noxynatronum foi associado ao estágio tumoral, e a valcuolata de metanoossarcina pode ser usada para diagnosticar câncer de ovário11. Além do câncer de ovário, outros cânceres, como estômago, pulmão, próstata, mama, colo do útero e endométrio, têm sido comprovados associados às bactérias12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. propuseram uma nova classe de diagnósticos oncológicos baseados em microbianos, prevendo o rastreamento precoce do câncer19. Neste protocolo, investigamos as diferenças entre os tecidos cancerígenos e o ovário normal, comparando a composição e função das bactérias nesses dois tecidos.
A coloração imunohistoquímica e o sequenciamento genético de rRNA 16S foram realizados para confirmar a presença de bactérias nos ovários. As diferenças e as funções previstas das bactérias ovarianas nos tecidos ovarianos cancerosos e noncancerosos foram estudadas. Os resultados mostraram a existência de bactérias nos tecidos ovarianos. Anoxynatronum sibiricum e Methanosarcina vacuolata estavam relacionados ao estágio e ao diagnóstico de câncer de ovário, respectivamente. Foram comparadas 46 vias KEGG significativamente diferentes que estavam presentes em ambos os grupos.
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Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional Médica do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Xi'an Jiaotong (Nº. XJTUIAF2018LSK-139). O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes inscritos.
1. Critérios para entrar no grupo de câncer e no grupo controle
- Para o grupo de câncer, matricule pacientes que são diagnosticados principalmente com câncer de ovário, e após a laparotomia, eles são comprovadamente com câncer de ovário sérico por achados patológicos.
- Para o grupo controle, inscreva-se pacientes que são diagnosticados principalmente com mioma uterino ou adenomyose uterina, sem apresentar qualquer condição ovariana, e que tenham sido submetidos a histerectomia e salpingo-oophorectomia.
NOTA: Este padrão não é definitivo. Pacientes com doenças que não afetam os ovários submetidos à histerectomia e salpingo-oofrectomia também podem ser inscritos. - Exclua pacientes com um ou mais dos seguintes critérios:
Mulheres grávidas ou amamentando.
Tomando antibióticos 2 meses antes da cirurgia.
Ter febre ou marcadores inflamatórios elevados.
Ter qualquer tipo de inflamação.
Tendo sido submetido à quimioterapia neoadjuvante.
2. Coletar amostras
- Durante a cirurgia, coloque os ovários ressecados em um tubo estéril e coloque o tubo em nitrogênio líquido para transporte. Evite tocar em qualquer outra coisa durante todo o procedimento.
- Separe os ovários em amostras de tecido de aproximadamente 1 cm de espessura com um par de novas pinças estéreis sob um armário de fluxo laminar. Após a separação, preserve as amostras a -80 °C.
NOTA: Todos os procedimentos para coleta de amostras são assépticos, incluindo a separação dos ovários.
3. Sequencie o gene rRNA 16S
- Extrair DNA.
- Adicione 1,2 mL de tampão EX inibidor em um tubo de centrífuga de 2 mL. Em seguida, adicione 180-220 mg de amostras no tubo. Deixe a amostra misturar totalmente (banho de água de 70 °C por 5 minutos e, em seguida, vórtice para 15 s).
- Centrifugar o tubo por 1 min a 600 x g.
- Coloque 550 μL do supernaente em um novo tubo de 1,5 mL, e centrífuga por 1 min a 600 x g.
- Transfira 400 μL do supernante com 30 μL de proteinase K para outro tubo de 1,5 mL.
- Adicione 400 μL de AL tampão e use um misturador de vórtice para 15 s.
- Incubar a 70 °C por 10 min.
- Adicione 400 μL de 96-100% de álcool. Use uma batedeira de vórtice para 15 s.
- Transfira 600 μL de mistura em uma coluna de absorção e centrífuga por 1 min a 13700 g. Troque o tubo inferior. Repita este passo 11 vezes.
- Adicione 500 μL de tampão AW1, centrífuga por 1 min a 13.700 x g e troque o tubo inferior.
- Adicione 500 μL de tampão AW2, centrífuga por 3 min a 13.700 x g e troque o tubo inferior.
- Centrifugar por 3 min a 13.700 x g.
- Transfira a mistura para um novo tubo de 1,5 mL, adicione 200 μL de tampão ATE, incubar em temperatura ambiente por 5 min e centrífuga por 1 min a 13.700 x g.
- Teste de qualidade. Use 1% de eletroforese de gel sepharose para testar a qualidade. Adicione 400 ng de amostra, 120 V, 30 minutos. Resultado ideal: concentração de DNA: ≥ 10 ng/μL, pureza do DNA: A260/A280 = 1,8-2.0, DNA bruto: ≥ 300 ng.
- Prepare as bibliotecas usando um kit de sequenciamento metagenômico 16S de acordo com o protocolo do fabricante.
- Executar PCR. Resumidamente, cada reação pcr de 25 μL contém 12,5 ng de DNA amostral como entrada, 12,5 μL de 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix e 5 μL de cada primer a 1 μM.
- Realizar pcr utilizando o seguinte protocolo: uma etapa inicial de desnaturação realizada a 95°C por 3 min seguido de 25 ciclos de denaturação (95°C, 30 s), ressaramento (55°C, 30 s) e extensão (72°C, 30 s), e um alongamento final de 5 min a 72°C.
- Limpe o produto PCR da mistura de reação com contas magnéticas usando as instruções do fabricante.
- Repetir as etapas 3.3.1 e 3.3.2.
- Teste de qualidade. Por favor, consulte a etapa 3.2.
- Repita o passo 3.3.3.
- Teste de qualidade. Use 1% de eletroforese de gel sepharose para testar a impureza, um espectógrafo para testar a pureza, um fluorômetro para testar a concentração e um kit de ensaio de RNA para testar a integridade. Siga o protocolo do fabricante. Normalizar e agrupar as bibliotecas; em seguida, sequência (configuração de leitura final emparelhada de 2 x 300 bp) usando células de fluxo padrão V3 de 600 ciclos, produzindo aproximadamente 100.000 leituras de base de fim pareado 2 x 300.
NOTA: As sequências de primer de comprimento completo: 16S Amplicon polymerase chain reaction (PCR) Primer de frente: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGTGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGG GNGGCWGCAG] e 16S Amplicon PCR Primer Revers: 5' GTCTCGTGGGGAGATGTGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].
4. Analisar dados de sequenciamento genético de rRNA 16S
- Filtre as leituras brutas de cada amostra com base na qualidade de sequenciamento com o pacote de software QIIME 2-20180220.
- Copie três arquivos para o diretório: emp-paired-end-sequences_01
um arquivo forward.fastq.gz que contém a sequência para a frente diz,
um arquivo reverso.fastq.gz que contém a sequência reversa lê,
um arquivo de código de barras.fastq.gz que contém o código de barras associado lê - Executar
importação de ferramentas de qiime \
-tipo EMPPairedEndSequences \
--entrada-caminho emp-emparelhado-end-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
- Copie três arquivos para o diretório: emp-paired-end-sequences_01
- Remova as sequências de primer e adaptador.
qiime cutadapt trim-paired \
--i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
-p-front-f GCTACGGGG \
-p-front-r GCTACGGGG \
-p-taxa de erro 0 \
--corte de qualidade 25 \
--o-aparadas-seqüências aparados-seqs_03.qza \
--verbose - Encurtar a sequência lê em que ambas as qualidades de extremidade emparelhada são inferiores a 25. Veja acima --qualidade de corte 25
- Analise os dados de sequenciamento.
- Reúna sequências para formar unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com um corte de similaridade de 97%.
qiime vsearch dereplicato-seqüências \
--i-seqüências aparados-seqs_03.qza \
--o-dereplicated-table table_04.qza \
--o-dereplicated-seqüências rep-seqs_04.qza
qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
-i-table table_04.qza \
--i-seqüências rep-seqs_04.qza \
--i-referencia-seqüências 97_otus.qza \
-p-perc-identidade 0.97 \
--o-clustered-table-cr-97.qza \
--o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
--o-incomparável-seqüências incomparáveis-cr-97.qza - Para as OTUs, calcule a abundância relativa em cada amostra. Informações sobre abundância estão em table-cr-97.qza
- Reúna sequências para formar unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com um corte de similaridade de 97%.
- Empregue um classificador bayesiano nativo, que visa o conjunto de treinamento RDP (versão 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), para classificar todas as sequências. As informações sobre taxon mapeadas estão em table-cr-97.qza
- Dentro da OTU dada, atribua uma classificação que reflete a coerência principal das sequências às OTUs. Em seguida, alinhe as OTUs. Consulte table-cr-97.qza e rep-seqs-cr-97.qza
- Com base nas informações do grupo amostral, realize a diversidade alfa (incluindo os índices Chao 1, ACE, Shannon, Simpson e Evenness) e a análise principal de coordenadas baseadas na UniFrac (PCoA).
qiime ferramentas exportação \
--entrada-caminho tabela-cr-97.qza \
--saída-caminho exportado-tabela de recursos
tabela de recursos exportados
qiime diversidade alfa \
-i-tabela tabela-cr-97.qza \
-p-métrica observed_otus \
--o-alfa-diversidade observed_otus_vector.qza
qiime diversidade beta \
-i-tabela tabela-cr-97.qza \
-p-métrica braycurtis \
--o-distância-matriz unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. Prever a função bacteriana
- Para prever a representação relacionada das características das bactérias, use o BugBase21. A tabela OTU de entrada para BugBase é preparada usando os seguintes comandos.
biom converter -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
biom converter -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="tabela OTU" --to-json
NOTA: A previsão é baseada em seis categorias de fenótipo (Ward et al. inédito) (https://bugbase.cs.umn.edu/): Coloração de grama, tolerância ao oxigênio, capacidade de formar biofilmes, conteúdo de elementos móveis, patogenicidade e tolerância ao estresse oxidativo. - Prever a composição funcional de um metagenome pelo PICRUSt com o uso de dados genéticos marcadores e um banco de dados contendo genomas de referência22.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f-i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt - Analisar as diferenças de funções entre cada grupo com a ajuda do STAMP23,24. Consulte as citações para operar o software.
6. Dados
- Use software estatístico para calcular a importância dos achados. A indicação de significância estatística deve ser definida como P < 0,05.
- Avaliar diferenças de idade e paridade pelo teste t do Aluno. Avaliar diferenças no estado da menopausa, histórico de hipertensão e diabetes pelo teste qui-quadrado. Avalie as diferenças no número de taxas bacterianas ovarianas pelo teste Mann-Whitney U.
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Representative Results
Pacientes
No estudo, foram incluídos 16 pacientes qualificados. O grupo controle incluiu 10 mulheres com diagnóstico de tumor uterino benigno (entre elas, 3 pacientes foram diagnosticados com moma uterino, e 7 pacientes foram diagnosticados com adenomiatona uterina). Enquanto isso, o grupo de câncer continha 6 mulheres com diagnóstico de câncer de ovário sérico (entre elas, 2 pacientes foram diagnosticados com estágio II, sendo que 2 delas foram diagnosticadas com estágio III). As seguintes características não apresentaram diferenças entre os pacientes do grupo controle e da faixa do câncer: idade, estado da menopausa, paridade, histórico de hipertensão e histórico de diabetes(Tabela 1).
Tabela 1: Estatísticas do paciente Clique aqui para baixar esta Tabela.
A riqueza e variedade de espécies bacterianas ovarianas em ambos os grupos
A presença de bactérias com a coloração imunohistoquímica foi mostrada na Figura 1. A diversidade alfa dos micróbios foi analisada como um método para detectar a riqueza e variedade de espécies bacterianas ovarianas. O número de espécies observadas nos tecidos do câncer de ovário foi menor do que o do grupo controle, sem diferença significativa. A riqueza (representada pelo índice Chao 1 e ACE) e a diversidade (representada pelo índice Shannon, Simpson e Evenness) das espécies bacterianas não foram significativamente diferentes entre o grupo de câncer e o grupo controle (Figura 2).
Figura 2: Sequenciamento genético rRNA de 16S apresenta diferenças entre o câncer e grupos de controle em riqueza e diversidade bacteriana. (A) Índice de espécies observadas (P = 0,06, teste de U mann-whitney); (B) Índice Chao 1(P = 0,06, teste U de Mann-Whitney); (C) Índice ACE (P = 0,06, teste Mann-Whitney U); (D) Índice de Shannon (P = 0,32, teste U de Mann-Whitney; E. Índice de evenness (P = 0,48, teste mann-whitney u); (F) Índice Simpson (P = 0,46, teste Mann-Whitney U). Obtivemos a permissão de reimpressão de editores anteriores. Este número foi modificado de Wang et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Descrição das bactérias ovarianas
O sequenciamento profundo da região genética V3-V4 16S rRNA foi realizado em todas as amostras para obter uma melhor compreensão das bactérias ovarianas. Os resultados mostraram que a Proteobacteria foi o filo mais abundante (67,10% no grupo controle e 67,20% no grupo do câncer), Firmicutes foi o segundo filo mais abundante (23,7 7% no grupo controle e 23,82% no grupo do câncer, e o terceiro filo mais abundante foi Bacteroidetes (3,26% no grupo controle e 3,41% no grupo do câncer). Ao analisar espécies do grupo controle, a composição principal foi composta por Halobacteroides halobios (14,53%), seguido por Gemmata obscuriglobus (11,07%) e Metiloprofundus sedimenti (10,69%). Para o grupo oncológico, Gemmata obscuriglobus foi a mais rica do cluster (13,89%), seguida por Halobacteroides halobius (11,99%) e Methyloprofundus sedimenti (11,12%)(Figura 3).
Figura 3: Abundância relativa de filos (> 1%) e das 12 principais espécies em amostras de ovário. (A) A abundância relativa do filo (> 1%) nos ovários dos pacientes do grupo controle. (B) A abundância relativa do filo (> 1%) nos ovários de pacientes com câncer de ovário. (C) As abundâncias relativas das 12 espécies bacterianas mais abundantes nos ovários dos pacientes de controle. (D) As abundâncias relativas das 12 espécies bacterianas mais abundantes nos ovários de pacientes com câncer de ovário. Obtivemos a permissão de reimpressão de editores anteriores. Este número foi modificado de Wang et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Diferentes composições de bactérias ovarianas entre os dois grupos
Uma comparação de diferentes comunidades bacterianas foi realizada pela PCoA utilizando PERMANOVA. Os resultados mostraram que as bactérias do grupo controle diferem das do grupo de câncer, P < 0,05 (Figura 4).
Figura 4: PCoA detecta aglomerados de comunidades e as abundâncias relativas de Anoxynatronum sibiricum e Methanosarcina vacuolata. (A) Comunidades foram agrupadas usando PCoA. PC1 e PC2 são plotados nos eixos x e y. O bloco vermelho indica uma amostra no grupo de câncer de ovário. O círculo azul indica uma amostra no grupo controle. As amostras do grupo de câncer de ovário foram separadas de outras amostras do grupo controle. (B) Comunidades agrupadas usando PCoA. PC1 e PC2 são plotados nos eixos x e y. O bloco vermelho indica uma amostra no grupo de câncer de ovário. O círculo sólido azul indica uma amostra de um paciente com mioma uterino, e o círculo oco azul é igual a uma amostra de um paciente com adenomyose uterina. (C) A abundância relativa de Anoxynatronum sibiricum (grupo controle: n = 10, grupo de câncer: n = 6, P = 0,034, teste de Mann-Whitney U). (D) A abundância relativa de Methanosarcina vacuolata (grupo controle: n = 10, grupo de câncer: n = 6, P = 0,001, teste de Mann-Whitney U). Obtivemos a permissão de reimpressão de editores anteriores. Este número foi modificado de Wang et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Composição bacteriana ovariana em grupos de câncer e controle de diferentes perspectivas
Uma análise da composição bacteriana ovariana foi realizada a partir de diferentes perspectivas para detectar ainda mais as diferenças nas bactérias ovarianas identificadas. Na Tabela 2, foram considerados os níveis de filo, classe, ordem, família, gênero e espécies, e as estatísticas estão previstas no gráfico. Em particular, houve associação entre a abundância relativa de Anoxynatronum sibiricum e o estágio do tumor, e a valsa de metanoossarcina foi um sinal específico ao diagnosticar o câncer de ovário(Tabela 2).
Conservação fenotípica de bactérias ovarianas nos dois grupos com base em funções previstas
No grupo do câncer, a expressão de genes relacionados a fenótipos potencialmente patogênicos e oxidativos tolerantes ao estresse foi aumentada em comparação com a do grupo controle (teste de grau assinado de Wilcoxon, P =0,02 e P =0,002). Não foi encontrada diferença significativa entre o câncer de ovário e os grupos de controle nos seguintes aspectos: os fenótipos de bactérias aeróbicas, anaeróbicas, facultativamente anaeróbicas, gram-positivas e gram-negativas; elementos móveis; e formação de biofilme das bactérias ovarianas(Figura 5). Foram determinadas 46 variantes de KEGG entre as bactérias em ovários nos grupos de câncer e controle. Os ovários do grupo de câncer apresentaram 26 caminhos aumentados. Entre eles, os caminhos mais relacionados foram os transportadores. Por outro lado, as bactérias no tecido do câncer de ovário mostraram 20 vias reduzidas. As funções mais relevantes foram as seguintes: sistema de secreção, funções desconhecidas e sistema de dois componentes. O resto das vias são mostradas na Figura 6.
Figura 1: Expressão imunohistoquímica LPS em ovários. (A) Grupo de controle (10 x). Barras de escala, grupo de controle de 200 μm. (B) (40 x). Barras de escala, 50 μm. (C) Grupo de câncer (10x). Barras de escala, 200 μm. (D) Grupo de câncer (40 x). Barras de escala, 50 μm. Setas apontam para manchas de LPS no tecido ovariano. Obtivemos a permissão de reimpressão de editores anteriores. Este número foi modificado de Wang et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Metagenomes previstos analisados pelo BugBase. A expressão de alguns genes no grupo do câncer foi aumentada em comparação com a do grupo controle. Esses genes estavam relacionados a fenótipos potencialmente patogênicos (teste de grau assinado por Wilcoxon, P = 0,02) e fenótipos oxidativos tolerantes ao estresse dos ovários. (Teste de classificação assinada de Wilcoxon, P = 0,002). Obtivemos a permissão de reimpressão de editores anteriores. Este número foi modificado de Wang et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise PICRUSt de diferentes caminhos KEGG entre os grupos de câncer e controle. Obtivemos a permissão de reimpressão de editores anteriores. Este número foi modificado de Wang et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 2: Riqueza (representada pelo índice Chao 1 e ACE) e a diversidade (representada pelo índice Shannon, Simpson e Evenness) das espécies bacterianas Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
O câncer de ovário tem uma influência notável na fertilidade das mulheres25. A maioria dos pacientes com câncer de ovário é diagnosticada em estágios tardios, e a taxa de sobrevivência de 5 anos é inferior a 30%18. Foi publicada a confirmação de bactérias nas vísceras sólidas abdominais, incluindo fígado, pâncreas e baço. A existência de bactérias no trato reprodutivo feminino superior ocorre porque o colo uterino não está fechado2,3,4,5. No entanto, se os ovários, que são vísceras sólidas abdominais, são estéreis ou não ainda não foram determinados. Além disso, se as bactérias nos ovários estão relacionadas ao câncer de ovário também é uma questão importante.
As diferenças significativas nas bactérias encontradas foram comparadas entre diferentes grupos. Todos os procedimentos mencionados acima foram estritamente livres de germes, incluindo instrumentos, reagentes, equipamentos e o funcionamento de todo o protocolo. Mais importante, utilizamos ovários de pacientes com doença uterina benigna como grupo controle para combater uma possível contaminação. No entanto, neste protocolo, a contaminação não pode ser evitada. Assim, uma vez que o grupo de câncer e o grupo controle foram analisados no mesmo ambiente experimental, apenas comparando as diferenças entre esses dois grupos, poderíamos obter evidências primárias sobre a origem microbiológica do câncer de ovário.
As descobertas de bactérias no tecido ovariano podem começar um novo campo investigando as bactérias que influenciam o câncer de ovário. Além disso, a presença e a composição únicas de bactérias em tecidos ovarianos cancerígenos podem direcionar a carcinogênese do câncer de ovário, e os alvos terapêuticos e prognósticos das bactérias. Entre as 46 vias KEGG, as funções relacionadas à biossíntese de antibióticos do grupo vancomicina chamaram atenção especial. Isso pode fornecer outras opções de tratamento para câncer de ovário.
No entanto, o protocolo tinha algumas limitações. Em primeiro lugar, as amostras não puderam ser coletadas de pessoas saudáveis por razões éticas. O grupo controle foi ovários de pacientes com doença uterina benigna (incluindo mioma uterino e adenomyose). Segundo, o número de amostras deve ser maior. O tamanho amostral limitado do estudo pode dificultar a precisão dos resultados. Em terceiro lugar, embora o grupo de câncer e o grupo controle estivessem sob as mesmas condições, não houve controles negativos ou positivos. Além disso, a contaminação não pôde ser evitada. Até o momento, o estudo das bactérias ovarianas em pacientes com câncer de ovário ainda está em estágio inicial. Um estudo em maior escala com mais amostras é necessário.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Pesquisa Clínica do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Xi'an Jiaotong, China (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), o Principal Projeto básico de Pesquisa de Ciência Natural do Departamento provincial de Ciência e Tecnologia de Shaanxi (2018JM7073, 2017ZDJC-11), o Projeto chave de Pesquisa e Desenvolvimento do Departamento de Ciência e Tecnologia Provincial de Shaanxi (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), o Projeto de Inovação tecnológica colaborativa da Província de Shaanxi (2 017XT-026, 2018XT-002) e o Projeto de Pesquisa Médica do Plano de Orientação para o Desenvolvimento Social xi'an (2017117SF/YX011-3). Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
Agradecemos aos colegas do Departamento de Ginecologia do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Xi'an Jiaotong por suas contribuições para a coleta de amostras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
References
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