Summary
כתמי אימונוהיסטוכימיה ורצף גן RNA ריבוזומלי 16S (גן 16S rRNA) בוצעו על מנת לגלות ולהבחין חיידקים ברקמות שחלות סרטניות ולא-ncancerous במקום. ההבדלים הקומפוזיציה והתפקודית של החיידקים היו צפויים באמצעות BugBase וחקירה פילוגנטית של קהילות על ידי שחזור של מדינות ללא הפרעה (PICRUSt).
Abstract
התיאוריה של מערכת הרבייה העליונה הנשית "סטרילית" נתקלת בהתנגדות גוברת עקב התקדמות בזיהוי חיידקים. עם זאת, אם השחלות מכילות חיידקים עדיין לא אושרה. כאן, ניסוי לזיהוי חיידקים ברקמות השחלות הוצג. בחרנו חולי סרטן השחלות בקבוצת הסרטן וחולים לא זרים בקבוצת הביקורת. ריצוף גנים rRNA 16S שימש כדי להבדיל חיידקים ברקמות השחלות מן הסרטן וקבוצות בקרה. יתר על כן, חזינו את ההרכב התפקודי של החיידקים שזוהו באמצעות BugBase ו- PICRUSt. שיטה זו יכולה לשמש גם קרביים אחרים ורקמות מאז איברים רבים הוכחו מחסה חיידקים בשנים האחרונות. נוכחות של חיידקים קרביים ורקמות עשויה לסייע למדענים להעריך רקמות סרטניות ונורמליות ועשויה לסייע בטיפול בסרטן.
Introduction
לאחרונה, מספר גדל והולך של מאמרים פורסמו המוכיחים את קיומם של חיידקים קרביים מוצקים בבטן, כגון הכליה, הטחול, הכבד והשחלה1,2. גלר ואח ' מצאו חיידקים בגידולים בלבלב, וחיידקים אלה היו עמידים בפני gemcitabine, תרופה כימותרפית2. ס. מנפרדו ויירה ואח ' הגיע למסקנה כי Enterococcus gallinarum היה נייד לבלוטות הלימפה, הכבד והטחול, וזה יכול לנהוג אוטואימוניות3.
מאז צוואר הרחם משחק תפקיד כמגן, חיידקים במערכת הרבייה הנשית העליונה, המכיל את הרחם, החצוצרות והשחלות, נחקרו באופן מינימלי. עם זאת, כמה תיאוריות חדשות הוקמו בשנים האחרונות. חיידקים עשויים להיות גישה לחלל הרחם במהלך המחזור החודשי עקב שינויים mucins4,5. בנוסף, Zervomanolakis ואח 'אישר כי הרחם, יחד עם החצוצרות, היא משאבה peristaltic הנשלטת על ידי המערכת האנדוקרינית של השחלות, וסידור זה מאפשר לחיידקים להיכנס רירית הרחם, החצוצרות, והשחלות6.
מערכת הרבייה העליונה כבר אינה תעלומה הודות להתפתחות שיטות לזיהוי חיידקים. Verstraelen ואח ' השתמש בשיטת רצף מזווג ברקוד כדי לגלות חיידקי הרחם על ידי מיקוד באזור V1-2 hypervariable של 16S RNA גן7. פאנג ואח ' מועסק רצף ברקוד בחולים עם פוליפים רירית הרחם וחשף את נוכחותם של חיידקים תוך רחמיים מגוונים8. בנוסף, באמצעות גן RNA 16S, מיילס ואח 'וחן ואח ' מצאו חיידקים במערכת איברי המין של נשים שעברו salpingo-oophorectomy וכריתת רחם, בהתאמה5,9.
חיידקים ברקמות הגידול זכו לתשומת לב גוברת בשנים האחרונות. בנרג'י ואח ' גילו כי חתימת המיקרוביום שונה בין חולי סרטן השחלות ושליטה10. סיביריקום noxynatronum היה קשור לשלב הגידול, ו Vacuolata מתנוזרצ'ינה עשוי לשמש לאבחון סרטן השחלות11. בנוסף לסרטן השחלות, סוגי סרטן אחרים, כגון קיבה, ריאות, ערמונית, שד, צוואר הרחם ואנדומטריום, הוכחו כקשורים לחיידקים12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. הציע סוג חדש של אבחון אונקולוגי מבוסס מיקרוביאלי, צופה הקרנת סרטן בשלב מוקדם19. בפרוטוקול זה, חקרנו את ההבדלים בין רקמות שחלות סרטניות ונורמליות על ידי השוואת הרכב ותפקוד החיידקים בשתי הרקמות האלה.
כתמי אימונוהיסטוכימיה ורצף גנים rRNA 16S בוצעו כדי לאשר את נוכחותם של חיידקים בשחלות. ההבדלים והתפקודים החזויים של חיידקי השחלות ברקמות השחלות הסרטניות והנוכריות נחקרו. התוצאות הראו את קיומם של חיידקים ברקמות השחלות. Anoxynatronum סיביריקום ומתנוזרצ'ינה vacuolata היו קשורים לשלב ולאבחון של סרטן השחלות, בהתאמה. ארבעים ושישה מסלולי KEGG שונים באופן משמעותי שהיו נוכחים בשתי הקבוצות הושוו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית הרפואית של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג (לא. XJTUIAF2018LSK-139). הסכמה מדעת התקבלה מכל המטופלים הרשומים.
1. קריטריונים לכניסה לקבוצת הסרטן וקבוצת הביקורת
- עבור קבוצת הסרטן, להירשם חולים המאובחנים בעיקר עם סרטן השחלות, ולאחר לפרוסטומיה, הם הוכחו שיש סרטן השחלות serous על ידי ממצאים פתולוגיים.
- עבור קבוצת הביקורת, להירשם חולים המאובחנים בעיקר עם מיומה הרחם או אדנומיוזיס הרחם, מבלי להציג כל מצב השחלות, אשר עברו כריתת רחם ו salpingo-oophorectomy.
הערה: תקן זה אינו מוגדר. חולים עם מחלות שאינן משפיעות על השחלות העוברות כריתת רחם וניתן להירשם גם לחולים עם מחלות שאינן משפיעות על השחלות העוברות כריתת רחם ו- salpingo-oophorectomy. - אל תכלול מטופלים עם אחד או יותר מהקריטריונים הבאים:
נשים הרות או מניקות.
נטילת אנטיביוטיקה חודשיים לפני הניתוח.
לאחר חום או סמנים דלקתיים גבוהים.
יש דלקת מכל סוג שהוא.
לאחר שעבר כימותרפיה neoadjuvant.
2. לאסוף דגימות
- במהלך הניתוח, מניחים את השחלות שנכרתו לתוך צינור סטרילי ומניחים את הצינור בחנקן נוזלי להובלה. הימנעו מלגעת בשום דבר אחר לאורך כל ההליך.
- הפרד את השחלות לתוך כ 1 ס"מ דגימות רקמה עבה עם זוג פינצטה סטרילית חדשה תחת ארון זרימה למינאר. לאחר ההפרדה, לשמר דגימות ב -80 °C (80 °F).
הערה: כל ההליכים לאיסוף דגימות הם א-פטיים, כולל הפרדת השחלות.
3. רצף הגן 16S rRNA
- לחלץ DNA.
- הוסף 1.2 מ"ל של חיץ EX מעכב לתוך צינור צנטריפוגה 2 מ"ל. לאחר מכן, להוסיף 180-220 מ ג של דגימות לתוך הצינור. תן לדגימה לערבב באופן מלא (70 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך 5 דקות ולאחר מכן מערבולת עבור 15 s).
- צנטריפוגה הצינור במשך 1 דקות ב 600 x g.
- מניחים 550 μL של supernatant לתוך צינור חדש 1.5 מ"ל, וצנטריפוגה במשך 1 דקות ב 600 x g.
- העבר 400 μL של supernatant עם 30 μL של proteinase K לתוך צינור 1.5 מ"ל אחר.
- הוסף 400 μL של חוצץ AL ולהשתמש מערבל מערבולת עבור 15 s.
- דגירה ב 70 °C (70 °F) במשך 10 דקות.
- הוסף 400 μL של 96-100% אלכוהול. השתמש מערבל מערבולת עבור 15 s.
- מעבירים 600 μL של תערובת לתוך עמוד ספיגה וצנטריפוגה במשך 1 דקות ב 13700 גרם. תחליף את הצינור התחתון. חזור על שלב זה 11 פעמים.
- הוסף 500 μL של חוצץ AW1, צנטריפוגה במשך 1 דקות ב 13,700 x g, ולשנות את הצינור התחתון.
- הוסף 500 μL של חוצץ AW2, צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 13,700 x g, ולשנות את הצינור התחתון.
- צנטריפוגה למשך 3 דקות ב-13,700 x גרם.
- מעבירים את התערובת לצינור חדש של 1.5 מ"ל, מוסיפים 200 μL של חוצץ ATE, מדגירים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות וצנטריפוגה במשך דקה אחת ב 13,700 x גרם.
- בדיקות איכות. השתמש 1% אלקטרופורזה ג'ל ספרוז כדי לבדוק את האיכות. הוסף 400 ננוגרם של מדגם, 120 V, 30 דקות. תוצאה אידיאלית: ריכוז DNA: ≥ 10 ננוגרם / μL, טוהר DNA: A260 / A280 = 1.8-2.0, DNA ברוטו: ≥ 300 ננוגרם.
- הכן את הספריות באמצעות ערכת רצף מטגנומית של 16S בהתאם לפרוטוקול היצרן.
- בצע פי.סי.אר. בקצרה, כל תגובה PCR 25 μL מכיל 12.5 ננוגרם של DNA מדגם כמו קלט, 12.5 μL של 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix ו 5 μL של כל פריימר ב 1 מיקרומטר.
- בצע PCR באמצעות הפרוטוקול הבא: שלב denaturation ראשוני המבוצע ב 95 °C במשך 3 דקות ואחריו 25 מחזורים של denaturation (95°C, 30 s), חישול (55°C, 30 s) והרחבה (72°C, 30 s), והארכה סופית של 5 דקות ב 72°C.
- נקה את מוצר ה- PCR מתערובת התגובה עם חרוזים מגנטיים באמצעות הוראות היצרן.
- חזור על שלבים 3.3.1 ו- 3.3.2.
- בדיקות איכות. אנא עיינו בשלב 3.2.
- חזור על שלב 3.3.3.
- בדיקות איכות. השתמש 1% אלקטרופורזה ג'ל Sepharose כדי לבדוק טומאה, ספקטרופוטומטר כדי לבדוק טוהר, פלואורומטר כדי לבדוק את הריכוז, וערכת בדיקת RNA לבדיקת שלמות. פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן. לנרמל ולאגד את הספריות; לאחר מכן רצף (2 x 300 bp הגדרת קריאה מזוגית) באמצעות 600 מחזור V3 תאי זרימה סטנדרטיים, המייצרים כ- 100,000 קריאות בסיס בסוף משויך 2 x 300.
הערה: רצפי פריימר באורך מלא: 16S תגובת שרשרת פולימראז אמפליסון (PCR) פריימר קדמי: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTTTATATAAGA GACAG-[CCTACGGGGGGGCWGCAG] ו 16S אמפלייקון PCR פריימר הפוך: 5' GTCTCGTGGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATTAATCC].
4. ניתוח נתוני ריצוף גנים rRNA של 16S
- סנן את הקריאות הגולמיות של כל מדגם בהתבסס על איכות הרצף עם חבילת התוכנה QIIME 2-20180220.
- העתק שלושה קבצים לספריה: sequences_01
קובץ אחד קדימה.fastq.gz המכיל את הרצף קדימה קורא,
קובץ אחד הפוך.fastq.gz המכיל את הרצף ההפוך קורא,
קובץ ברקודים.fastq.gz אחד המכיל את קריאות הברקוד המשויכות - לבצע
qiime tools import \
--type EMPPairedEndSequences \
--נתיב קלט-emp-שיוך-קצה-sequences_01 \--נתיב פלט-נתיב emp-שיוך-קצה-sequences_02.qza
- העתק שלושה קבצים לספריה: sequences_01
- הסר את רצפי הפריימר והמתאם.
qiime cutadapt לקצץ-מזווג \
--i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
--p-front-f GCTACGGGGGG \
--p-front-r GCTACGGGGGG \
--p-error-rate 0 \
--איכות-ניתוק 25 \
--o-קצוצים-קצוצים גזוז-seqs_03.qza \
--מילולי - קצר קריאות רצף שבהן שתי התכונות הקצה המשויך נמוכות מ- 25. ראה לעיל -איכות-ניתוק 25
- נתח את נתוני הרצף.
- אסוף רצפים כדי ליצור יחידות טקסונומיות תפעוליות (OTUs) עם קיצוץ דמיון ב -97%.
qiime vsearch dereplicate-sequences \
--i-רצפים חתוכים-seqs_03.qza \
--o-dereplicated-טבלה table_04.qza \
--o-dereplicated-רצפים נציג seqs_04.qza
qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
--i-table table_04.qza \
--i-רצפים נציג seqs_04.qza \
--i-reference-רצפים 97_otus.qza \
--p-perc-זהות 0.97 \
--o-clustered-טבלה-cr-97.qza \
--o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
--o-ללא תחרות-רצפים ללא תחרות-cr-97.qza - עבור OTUs, לחשב את השפע היחסי בכל מדגם. מידע אודות שפע נמצא בטבלה-cr-97.qza
- אסוף רצפים כדי ליצור יחידות טקסונומיות תפעוליות (OTUs) עם קיצוץ דמיון ב -97%.
- השתמש מסווג בייסאי מקומי, אשר מכוון ערכת האימונים RDP (גרסה 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), כדי למיין את כל הרצפים. מידע טקסון ממופה נמצא בטבלה-cr-97.qza
- בתוך OTU נתון, להקצות סיווג המשקף את העקביות העיקרית של הרצפים ל- OTUs. לאחר מכן, יישר את ה- OTUs. ראה טבלה-cr-97.qza ונציג-seqs-cr-97.qza
- בהתבסס על המידע הקבוצתי לדוגמה, בצעו את מגוון האלפא (כולל מדדי צ'או 1, ACE, שאנון, סימפסון ואוונס) וניתוח הקואורדינטות הראשיות המבוססות על UniFrac (PCoA).
qiime tools export \
--טבלת נתיבי קלט-cr-97.qza \
--טבלת תכונות מיוצאות של נתיב פלט
טבלת תכונות מיוצאות
qiime diversity alpha \
--שולחן-i-טבלה-cr-97.qza \
--p-metric observed_otus \
--o-אלפא-גיוון observed_otus_vector.qza
גירסת ביתא של qiime diversity \
--שולחן-i-טבלה-cr-97.qza \
--p-metric braycurtis \
--o-מרחק-מטריקס unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. לחזות את תפקוד החיידקים
- כדי לחזות את הייצוג הקשור של המאפיינים של החיידקים, להשתמש BugBase21. טבלת OTU של הקלט עבור BugBase מוכנה באמצעות הפקודות הבאות.
ביום להמיר -i otu_table.biom -o otu_table.txt -- to-tsv
biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom -- סוג טבלה="טבלת OTU" --to-json
הערה: התחזית מבוססת על שש קטגוריות פנוטיפ (וורד ואח 'שלא פורסמו) (https://bugbase.cs.umn.edu/): כתמי גרם, עמידות לחמצן, יכולת ליצור ביופילמים, תוכן אלמנט נייד, פתוגניות, וסבילות מתח חמצוני. - לחזות את ההרכב הפונקציונלי של metagenome על ידי PICRUSt עם השימוש של נתוני גן סמן מסד נתונים המכיל גנומיםייחוס 22.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f-i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1-o metagenome_predictions. אל-1.txt - נתח את ההבדלים בפונקציות בין כל קבוצה בעזרת STAMP23,24. נא עיין בציטוטים להפעלת התוכנה.
6. נתונים
- השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לחשב את משמעות הממצאים. יש להגדיר את האינדיקציה למשמעות סטטיסטית כ- P < 0.05.
- להעריך את ההבדלים בגיל ובשווה לפי מבחן ה-t של התלמיד. להעריך הבדלים במצב גיל המעבר, היסטוריה של יתר לחץ דם וסוכרת על ידי מבחן chi-square. להעריך את ההבדלים במספר טקסה חיידקי השחלות על ידי מבחן מאן-ויטני U.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חולים
בסך הכל נכללו במחקר 16 חולים מוסמכים. קבוצת הביקורת כללה 10 נשים עם אבחנה של גידול שפיר ברחם (ביניהן, 3 חולים אובחנו עם מיומה ברחם, ו -7 חולים אובחנו עם אדנומיוזיס הרחם). בינתיים, קבוצת הסרטן הכילה 6 נשים עם אבחנה של סרטן השחלות serous (ביניהם, 2 חולים אובחנו עם שלב II, ו 2 מהם אובחנו עם שלב III). המאפיינים הבאים לא הראו הבדלים בין חולים בקבוצת הביקורת לבין קבוצת הסרטן: גיל, מצב גיל המעבר, זוגיות, היסטוריה של יתר לחץ דם, והיסטוריה של סוכרת (טבלה 1).
טבלה 1: סטטיסטיקת מטופלים אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
העושר והמגוון של מיני חיידקי השחלות בשתי הקבוצות
נוכחותם של חיידקים המשתמשים בהכתמת אימונוהיסטוכימיה הוצגה באיור 1. מגוון האלפא של החיידקים נותח כשיטה לזיהוי העושר והמגוון של מיני חיידקי השחלות. מספר המינים שנצפו ברקמות סרטן השחלות היה קטן מזה של קבוצת הביקורת, ללא הבדל משמעותי. העושר (המיוצג על ידי מדד צ'או 1 ו- ACE) והמגוון (המיוצג על ידי מדד שאנון, סימפסון ואוונס) של מיני החיידקים לא היו שונים באופן משמעותי בין קבוצת הסרטן לקבוצת הביקורת (איור 2).
איור 2: ריצוף גנים rRNA 16S מראה הבדלים בין הסרטן לבין קבוצות בקרה בעושר חיידקי ובמגוון. (A) מדד מינים נצפו (P = 0.06, מאן-ויטני U בדיקה); (B) מדד צ'או 1 (P = 0.06, מבחן מאן-ויטני U); (ג) מדד ACE (P = 0.06, מבחן מאן-ויטני U); (ד) מדד שאנון (P = 0.32, מבחן מאן-ויטני U; ה. מדד שוויון (P = 0.48, מבחן מאן-ויטני U); (ו) מדד סימפסון (P = 0.46, מבחן מאן-ויטני U). קיבלנו הרשאת הדפסה מחדש ממוציאים לאור קודמים. נתון זה שונה מוונג ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
תיאור של חיידקי השחלות
רצף עמוק של אזור הגן V3-V4 16S rRNA בוצע על כל הדגימות כדי לקבל הבנה טובה יותר של חיידקי השחלות. התוצאות הראו כי פרוטאובקטריה הייתה הפילום הנפוץ ביותר (67.10% בקבוצת הביקורת ו-67.20% בקבוצת הסרטן), Firmicutes היה הפילום השני בשכיתובו (23.77% בקבוצת הביקורת ו-23.82% בקבוצת הסרטן), והפילום השלישי הנפוץ ביותר היה Bacteroidetes (3.26% בקבוצת הביקורת ו-3.41% בקבוצת הסרטן). בעת ניתוח מינים של קבוצת הביקורת, ההרכב העיקרי היה מורכב halobios Halobacteroides (14.53%), ואחריו ג'ממטה obscuriglobus (11.07%) ו Methyloprofundus sedimenti (10.69%). עבור קבוצת הסרטן, ג'מה אובסקוריגלובוס הייתה העשירה ביותר באשכול (13.89%), ואחריה הילובקטריואידים הלוביוס (11.99%) ומטילופרופונדוס משקעים (11.12%)(איור 3).
איור 3: שפע יחסי של פילה (> 1%) ומתוכם 12 המינים המובילים בדגימות השחלות. (א) השפע היחסי של פילה (> 1%) בשחלות של המטופלים בקבוצת הביקורת. (ב) השפע היחסי של פילה (> 1%) בשחלות של חולים עם סרטן השחלות. (ג) השפע היחסי של 12 מיני החיידקים הנפוצים ביותר בשחלות של חולי הבקרה. (ד) השפע היחסי של 12 מיני החיידקים הנפוצים ביותר בשחלות של חולי סרטן השחלות. קיבלנו הרשאת הדפסה מחדש ממוציאים לאור קודמים. נתון זה שונה מוונג ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
קומפוזיציות שונות של חיידקי השחלות בין שתי הקבוצות
השוואה של קהילות חיידקים שונות בוצעה על ידי PCoA באמצעות PERMANOVA. התוצאות הראו שהחיידקים בקבוצת הביקורת היו שונים מאלה בקבוצת הסרטן, P < 0.05 (איור 4).
איור 4: PCoA מזהה אשכולות של קהילות ואת השפע היחסי של Anoxynatronum סיביריקום ומתנוזרצ'ינה vacuolata. (A) קהילות היו מקובצים באמצעות PCoA. PC1 ו- PC2 מותווים בצירי x ו- y. הבלוק האדום מצביע על דגימה בקבוצת סרטן השחלות. העיגול הכחול מציין דוגמה בקבוצת הביקורת. הדגימות מקבוצת סרטן השחלות הופרדו מדגימות אחרות בקבוצת הביקורת. (ב) קהילות מקובצות באמצעות PCoA. PC1 ו- PC2 מותווים בצירי x ו- y. הבלוק האדום מצביע על דגימה בקבוצת סרטן השחלות. העיגול הכחול המוצק מציין דגימה מחולה עם מיומה ברחם, והעיגול החלול הכחול שווה לדגימה של מטופל עם אדנומיוזיס ברחם. (C) השפע היחסי של Anoxynatronum sibiricum (קבוצת ביקורת: n = 10, קבוצת סרטן: n = 6, P = 0.034, מבחן מאן-ויטני U). (ד) השפע היחסי של מתנוזרצ'ינה וקולטה (קבוצת ביקורת: n = 10, קבוצת סרטן: n = 6, P = 0.001, מבחן מאן-ויטני U). קיבלנו הרשאת הדפסה מחדש ממוציאים לאור קודמים. נתון זה שונה מוונג ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הרכב חיידקי השחלות בסרטן וקבוצות בקרה מנקודות מבט שונות
ניתוח הרכב החיידק השחלות בוצע מנקודות מבט שונות כדי לזהות עוד יותר את ההבדלים בחיידק השחלות שזוהו. בטבלה 2, פילום, מעמד, סדר, משפחה, סוג ורמות מינים נחשבו, וסטטיסטיקות מסופקות בתרשים. בפרט, היה קשר בין השפע היחסי של Anoxynatronum סיביריקום לבין שלב הגידול, ו Vacuolata מתנוזרצ'ינה היה סימן ספציפי בעת אבחון סרטן השחלות (טבלה 2).
שימור פנוטיפי של חיידקי השחלות בשתי הקבוצות בהתבסס על פונקציות חזויות
בקבוצת הסרטן, הביטוי של גנים הקשורים פנוטיפים פוטנציאליים פתוגניים חמצוני חמצוני עמיד בפני מתח הוגדל בהשוואה לזה של קבוצת הביקורת (וילקוסון חתום דרגה בדיקה, P = 0.02 ו P = 0.002). לא נמצא הבדל משמעותי בין סרטן השחלות לבין קבוצות הביקורת בהיבטים הבאים: הפנוטיפים של חיידקים אירוביים, אנאירוביים, אנאירוביים בפקולטה, גרם חיובי וחיידקים גרם שליליים; אלמנטים ניידים; ויצירת ביופילם של חיידקי השחלות(איור 5). ארבעים ושישה מסלולי KEGG וריאנט בין החיידקים בשחלות בסרטן וקבוצות בקרה נקבעו. השחלות בקבוצת הסרטן הראו 26 מסלולים מוגברים. ביניהם, המסלולים הקשורים ביותר היו מובילים. מצד שני, החיידקים ברקמת סרטן השחלות הראו 20 מסלולים מופחתים. הפונקציות הרלוונטיות ביותר היו כדלקמן: מערכת הפרשה, פונקציות לא ידועות ומערכת של שני רכיבים. שאר השבילים מוצגים באיור 6.
איור 1: ביטוי אימונוהיסטוכימי LPS בשחלות. (A) קבוצת ביקורת (10 x). סרגלי קנה מידה, 200 מיקרומטר. (B) קבוצת בקרה (40 x). מוטות קנה מידה, 50 מיקרומטר. (C) קבוצת סרטן (10x). מוטות קנה מידה, 200 מיקרומטר. (D) קבוצת סרטן (40 x). מוטות קנה מידה, 50 מיקרומטר. החצים מצביעים על כתמי LPS ברקמת השחלות. קיבלנו הרשאת הדפסה מחדש ממוציאים לאור קודמים. נתון זה שונה מוונג ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מטגנומים צפויים שנותחו על ידי BugBase. הביטוי של כמה גנים בקבוצת הסרטן גדל בהשוואה לזה בקבוצת הביקורת. גנים אלה היו קשורים פוטנציאל פתוגניים (וילקוסון חתום דרגה מבחן, P = 0.02) ופנוטיפים עמידים ללחץ חמצוני של השחלות. (מבחן הדירוג החתום של וילקוסון, P = 0.002). קיבלנו הרשאת הדפסה מחדש ממוציאים לאור קודמים. נתון זה שונה מוונג ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ניתוח PICRUSt של מסלולי KEGG שונים בין סרטן לקבוצות בקרה. קיבלנו הרשאת הדפסה מחדש ממוציאים לאור קודמים. נתון זה שונה מוונג ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 2: עושר (המיוצג על ידי מדד צ'או 1 ו- ACE) והמגוון (המיוצג על ידי מדד שאנון, סימפסון ואיאנסנס) של מיני החיידקים אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לסרטן השחלות יש השפעה ניכרת על פוריות האישה25. רוב חולי סרטן השחלות מאובחנים בשלבים מאוחרים, ושיעור ההישרדות של 5 שנים הוא פחות מ -30%18. אישור של חיידקים הקרביים מוצק הבטן, כולל הכבד, הלבלב והטחול, פורסם. קיומם של חיידקים במערכת הרבייה הנשית העליונה מתרחשת מכיוון צוואר הרחם אינו סגור2,3,4,5. עם זאת, אם השחלות, שהן קרביים מוצקים בבטן, הן סטריליות או לא עדיין לא נקבע. בנוסף, אם חיידקים בשחלות קשורים לסרטן השחלות היא גם שאלה חשובה.
ההבדלים המשמעותיים בחיידקים שמצאנו הושוו בין קבוצות שונות. כל ההליכים שהוזכרו לעיל היו נטולי חיידקים בלבד, כולל מכשירים, ריאגנטים, ציוד, ותפעול הפרוטוקול כולו. חשוב מכך, השתמשנו שחלות מחולים עם מחלת הרחם שפירה כקבוצת הביקורת כדי לנטרל זיהום אפשרי. עם זאת, בפרוטוקול זה, לא ניתן להימנע מזיהום. לכן, מאז קבוצת הסרטן וקבוצת הביקורת נותחו באותה סביבה ניסיונית, רק על ידי השוואת ההבדלים בין שתי קבוצות אלה, אנו יכולים להשיג ראיות ראשוניות על המקור המיקרוביולוגי של סרטן השחלות.
ממצאי חיידקים ברקמת השחלות עשויים להתחיל שדה חדש החוקר את החיידקים המשפיעים על סרטן השחלות. בנוסף, הנוכחות וההרכב הייחודיים של חיידקים ברקמות השחלות הסרטניות עשויים לכוון את החומר המסרטן של סרטן השחלות, ואת המטרות הטיפוליות והאוגנוסטיות של החיידקים. בין 46 מסלולי KEGG, פונקציות הקשורות לביוסינתזה של אנטיביוטיקה קבוצת vancomycin משכו תשומת לב מיוחדת. זה עשוי לספק אפשרויות טיפול נוספות לסרטן השחלות.
עם זאת, לפרוטוקול היו כמה מגבלות. ראשית, לא ניתן היה לאסוף את הדגימות מאנשים בריאים מסיבות אתיות. קבוצת הביקורת הייתה שחלות של חולים עם מחלת הרחם שפירה (כולל מיומה ברחם ואדנומיוזיס). שנית, מספר הדגימות צריך להיות גדול יותר. גודל המדגם המוגבל של המחקר עלול לפגוע בדיוק התוצאות. שלישית, למרות שקבוצת הסרטן וקבוצת הביקורת היו באותם תנאים, לא היו בקרות שליליות או חיוביות. בנוסף, לא ניתן היה למנוע זיהום. עד כה, המחקר של חיידקי השחלות בחולים עם סרטן השחלות הוא עדיין בשלב מוקדם. דרוש מחקר בקנה מידה גדול יותר עם דגימות נוספות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרס המחקר הקליני של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג, סין (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), פרויקט המחקר הבסיסי העיקרי של מדעי הטבע של מחלקת המדע והטכנולוגיה המחוזית שאאנשי (2018JM7073, 2017ZDJC-11), פרויקט המחקר והפיתוח המרכזי של מחלקת המדע והטכנולוגיה המחוזית שאאנשי (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), פרויקט החדשנות הטכנולוגית השיתופית הפרובינציאלית שאאנשי (2 017XT-026, 2018XT-002), ופרויקט המחקר הרפואי של תוכנית ההנחיה לפיתוח חברתי שיאן (2017117SF/YX011-3). למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
אנו מודים לעמיתים במחלקה לגינקולוגיה של בית החולים המסונף הראשון של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג על תרומתם לאיסוף דגימות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
References
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al.
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
