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Cancer Research

ओवेरियन ऊतकों में बैक्टीरिया की लक्षण वर्णन और कार्यात्मक भविष्यवाणी

Published: October 23, 2021 doi: 10.3791/61878
Automatic Translation
*1, *2, *1, 1, 3, 4, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, 2School of Social Sciences, University of Manchester, 3Department of Pathology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, 4Omega Bioservices Inc
* These authors contributed equally

Summary

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेनिंग और 16S रिबोसोमल आरएनए जीन (16S आरएनए जीन) अनुक्रमण को सीटू में कैंसर और गैरकैंसरस ओवेरियन ऊतकों में बैक्टीरिया को खोजने और अलग करने के लिए किया गया था। अबुक्षक राज्यों (PICRUSt) के पुनर्निर्माण द्वारा समुदायों के बगबेस और फिलोजेनेटिक जांच का उपयोग करके बैक्टीरिया के रचनात्मक और कार्यात्मक मतभेदों की भविष्यवाणी की गई थी।

Abstract

एक "बाँझ" महिला ऊपरी प्रजनन पथ के सिद्धांत बैक्टीरियल का पता लगाने में प्रगति के कारण बढ़ते विरोध का सामना कर रहा है । हालांकि, अंडाशय में बैक्टीरिया होते हैं या नहीं, इसकी अभी तक पुष्टि नहीं हुई है । इसके बाद, अंडाशय के ऊतकों में बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए एक प्रयोग शुरू किया गया था । हमने कैंसर समूह में अंडाशय के कैंसर रोगियों और नियंत्रण समूह में गैर-कैंसर रोगियों को चुना। 16S rRNA जीन अनुक्रमण कैंसर और नियंत्रण समूहों से अंडाशय के ऊतकों में बैक्टीरिया अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इसके अलावा, हमने बगबेस और PICRUSt का उपयोग करके पहचाने गए बैक्टीरिया की कार्यात्मक संरचना की भविष्यवाणी की। इस विधि का उपयोग अन्य आंत और ऊतकों में भी किया जा सकता है क्योंकि हाल के वर्षों में कई अंग बैक्टीरिया को बंदरगाह के लिए साबित हुए हैं। आंत और ऊतकों में बैक्टीरिया की उपस्थिति वैज्ञानिकों कैंसर और सामान्य ऊतकों का मूल्यांकन करने में मदद कर सकती है और कैंसर के इलाज में सहायता हो सकती है।

Introduction

हाल ही में, लेखों की बढ़ती संख्या प्रकाशित की गई है जो पेट के ठोस विसरा में बैक्टीरिया के अस्तित्व को साबित करते हैं, जैसे गुर्दे, तिल्ली, यकृत और अंडाशय1,2। गेलर एट अल अग्नाशय के ट्यूमर में बैक्टीरिया पाया, और इन बैक्टीरिया gemcitabine, एक कीमोथैरेपी दवा2के लिए प्रतिरोधी थे । एस मनफ्रेडो विएरा एट अल ने निष्कर्ष निकाला कि एंटोकोकस गैलिनार लिम्फ नोड्स, लिवर और प्लीहा के लिए पोर्टेबल था, और यह ऑटोइंयुमुइमेंट3चला सकता है।

चूंकि गर्भाशय ग्रीवा एक रक्षक के रूप में एक भूमिका निभाता है, ऊपरी महिला प्रजनन पथ में बैक्टीरिया, जिसमें गर्भाशय, फैलोपियन ट्यूब और अंडाशय होते हैं, पर न्यूनतम शोध किया गया है। हालांकि, हाल के वर्षों में कुछ नए सिद्धांत स्थापित किए गए हैं । मसिन 4,5में परिवर्तन के कारण मासिक धर्म चक्र के दौरान बैक्टीरिया की पहुंचगर्भाशयगुहा तक हो सकती है . इसके अतिरिक्त, Zervomanolakis एट अल की पुष्टि की है कि गर्भाशय, फैलोपियन ट्यूबों के साथ, अंडाशय के अंतःस्रावी प्रणाली द्वारा नियंत्रित एक परिष्टिक पंप है, और यह व्यवस्था बैक्टीरिया को एंडोमेट्रियम, फैलोपियन ट्यूब और अंडाशय6में प्रवेश करने में सक्षम बनाती है।

ऊपरी प्रजनन पथ अब बैक्टीरिया का पता लगाने के तरीकों के विकास के लिए धन्यवाद एक रहस्य नहीं है। वर्स्ट्रालेन एट अल ने 16S आरएनए जीन7के V1-2 अतिवर्य क्षेत्र में लक्षित करके गर्भाशय बैक्टीरिया की खोज करने के लिए एक बारकोडेड पेयड-एंड अनुक्रमण विधि का उपयोग किया। फेंग एट अल एंडोमेट्रियल जंतु के साथ रोगियों में बारकोडेड अनुक्रमण कार्यरत है और विविध अंतर्गर्भाशयी बैक्टीरिया8की उपस्थिति का पता चला । इसके अतिरिक्त, 16S आरएनए जीन, मीलों एट अल और चेन एट अल का उपयोग करके महिलाओं के जननांग प्रणाली में बैक्टीरिया पाया गया, जो क्रमशः5,9, 9साल्पिंगो-ओफोरेक्टॉमी और हिस्टेरेक्टॉमी से गुजरा था ।

ट्यूमर ऊतकों में बैक्टीरिया हाल के वर्षों में बढ़ती ध्यान प्राप्त किया है । बनर्जी एट अल की खोज की है कि माइक्रोबायोम हस्ताक्षर अंडाशय के कैंसर के रोगियों के बीच मतभेद और10 को नियंत्रितकरता है । एकनोक्सीनेट्रोनम सिबिरिकम ट्यूमर चरण से जुड़ा हुआ था, और मेथानोसेसिना वैक्यूलटा का उपयोग ओवेरियन कैंसर11का निदान करने के लिए किया जा सकता है। ओवेरियन कैंसर के अलावा, पेट, फेफड़े, प्रोस्टेट, स्तन, गर्भाशय ग्रीवा औरएंडोमेट्रियम जैसे अन्य कैंसर, बैक्टीरिया12, 13, 14,15,16,17, 18से जुड़े साबितहुएहैं। पोर एट अल. माइक्रोबियल आधारित ऑन्कोलॉजी निदान के एक नए वर्ग का प्रस्ताव, प्रारंभिक चरण के कैंसर स्क्रीनिंग19की उंमीद । इस प्रोटोकॉल में, हमने इन दोनों ऊतकों में बैक्टीरिया की संरचना और कार्य की तुलना करके कैंसर और सामान्य अंडाशय ऊतकों के बीच मतभेदों की जांच की।

अंडाशय में बैक्टीरिया की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेनिंग और 16S आरएनए जीन अनुक्रमण किया गया था। कैंसर और गैर कैंसर अंडाशय ऊतकों में अंडाशय बैक्टीरिया के मतभेदों और भविष्यवाणी कार्यों का अध्ययन किया गया । परिणामों में अंडाशय के ऊतकों में बैक्टीरिया के अस्तित्व को दिखाया गया । एनोक्सीनाट्रोनम सिबिरिकम और मेथानोसआरसीिना वैक्यूलटा क्रमशः मंच और अंडाशय के कैंसर के निदान से संबंधित थे। ४६ काफी अलग KEGG रास्ते है कि दोनों समूहों में मौजूद थे तुलना की गई ।

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Protocol

इस अध्ययन को शीआन जियाओटोंग विश्वविद्यालय के पहले संबद्ध अस्पताल की मेडिकल इंस्टीट्यूशनल एथिक्स कमेटी (नहीं) ने मंजूरी दी थी । XJTUIAF2018LSK-139) । सभी नामांकित रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. कैंसर समूह और नियंत्रण समूह में प्रवेश करने के लिए मानदंड

  1. कैंसर समूह के लिए, उन रोगियों को नामांकित करें जिन्हें मुख्य रूप से अंडाशय के कैंसर का निदान किया जाता है, और लेप्रोटॉमी के बाद, वे रोग निष्कर्षों द्वारा सीरस ओवेरियन कैंसर साबित होते हैं।
  2. नियंत्रण समूह के लिए, उन रोगियों को नामांकित करें जिन्हें मुख्य रूप से किसी भी अंडाशय की स्थिति को पेश किए बिना गर्भाशय मायोमा या गर्भाशय एडेनोमायोसिस का निदान किया जाता है, और जो हिस्टेरेक्टॉमी और साल्पिनो-ओपोरेक्टॉमी से गुजरे हैं।
    नोट: यह मानक निश्चित नहीं है। हिस्टेरेक्टॉमी और साल्पिनो-ओफोरेक्टॉमी से गुजरने वाले अंडाशय को प्रभावित नहीं करने वाले रोगों के मरीजों को भी भर्ती किया जा सकता है।
  3. निम्नलिखित मानदंडों में से एक या अधिक वाले रोगियों को बाहर करें:
    गर्भवती या स्तनपान कराने वाली महिलाएं।
    सर्जरी से 2 महीने पहले एंटीबायोटिक्स लेना।
    बुखार या ऊंचा भड़काऊ मार्कर होना।
    किसी भी प्रकार की सूजन होना।
    नियोएडजुवेंट कीमोथेरेपी से गुजरने के बाद।

2. नमूने इकट्ठा

  1. सर्जरी के दौरान, पुनः प्राप्त अंडाशय को बाँझ ट्यूब में रखें और ट्यूब को परिवहन के लिए तरल नाइट्रोजन में रखें। पूरी प्रक्रिया के दौरान किसी और चीज को छूने से बचें।
  2. अंडाशय को लगभग 1-सेमी मोटे ऊतक नमूनों में एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट के तहत नए बाँझ चिमटी की एक जोड़ी के साथ अलग करें। अलग होने के बाद, -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को संरक्षित करें।
    नोट: नमूने एकत्र करने के लिए सभी प्रक्रियाएं असेप्टिक हैं, जिनमें अंडाशय को अलग करना शामिल है।

3. अनुक्रम 16S rRNA जीन

  1. डीएनए निकालें।
    1. 2 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में एक्स बफर को रोकते हुए 1.2 एमएल जोड़ें। फिर, ट्यूब में 180-220 मिलीग्राम नमूने जोड़ें। नमूना पूरी तरह से मिश्रण (5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान और फिर 15 एस के लिए भंवर) दें।
    2. 600 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए ट्यूब सेंट्रलाइज करें।
    3. एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में सुपरनैंट के 550 माइक्रोन रखें, और 600 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें।
    4. 30 माइक्रोनिट के साथ सुपरनेटेंट के 400 माइक्रोन को एक और 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. बफर अल के 400 माइक्रोन जोड़ें और 15 एस के लिए एक भंवर मिक्सर का उपयोग करें।
    6. 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    7. 96-100% अल्कोहल के 400 माइक्रोल जोड़ें। 15 एस के लिए भंवर मिक्सर का प्रयोग करें।
    8. मिश्रण के 600 माइक्रोल को अवशोषण कॉलम में स्थानांतरित करें और 13700 ग्राम पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें। निचली ट्यूब का आदान-प्रदान करें। इस स्टेप को 11 बार दोहराएं।
    9. बफर AW1 के 500 μL जोड़ें, 13,700 x g पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और निचले ट्यूब बदल जाते हैं।
    10. बफर AW2 के 500 μL जोड़ें, 13,700 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और निचले ट्यूब बदल जाते हैं।
    11. 13,700 x ग्राम पर 3 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
    12. मिश्रण को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, बफर एटीई के 200 माइक्रोन जोड़ें, 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट और 13,700 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  2. गुणवत्ता परीक्षण। गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए 1% सेफरोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करें। नमूना के 400 एनजी, 120 वी, 30 मिनट जोड़ें। आदर्श परिणाम: डीएनए एकाग्रता: ≥ 10 एनजी/μL, डीएनए शुद्धता: A260/A280 = 1.8-2.0, सकल डीएनए: ≥ ३०० एनजी ।
  3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 16S मेटाजेनोमिक अनुक्रमण किट का उपयोग करके पुस्तकालयों को तैयार करें।
    1. पीसीआर प्रदर्शन करें। संक्षेप में, प्रत्येक 25 माइक्रोन पीसीआर प्रतिक्रिया में इनपुट के रूप में 12.5 एनजी नमूना डीएनए, 2x KAPA HiFi HotStart रेडमिक्स के 12.5 माइक्रोन और 1 माइक्रोन पर प्रत्येक प्राइमर के 5 माइक्रोन होते हैं।
    2. निम्नलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके पीसीआर को पूरा करें: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर किया गया एक प्रारंभिक डेनैचेशन चरण 25 चक्रों (95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस), एनीलिंग (55 डिग्री सेल्सियस, 30 एस) और विस्तार (72 डिग्री सेल्सियस, 30 एस) और 72 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट का अंतिम विस्तार।
    3. निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर चुंबकीय मोतियों के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण से पीसीआर उत्पाद को साफ करें।
    4. चरण 3.3.1 और 3.3.2 दोहराएं।
    5. गुणवत्ता परीक्षण। कृपया चरण 3.2 का उल्लेख करें।
    6. दोहराएं चरण 3.3.3।
    7. गुणवत्ता परीक्षण। अशुद्धता का परीक्षण करने के लिए 1% सेफरोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करें, शुद्धता का परीक्षण करने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, एकाग्रता का परीक्षण करने के लिए एक फ्लोरोमीटर, और अखंडता का परीक्षण करने के लिए एक आरएनए परख किट। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें। पुस्तकालयों को सामान्य और पूल करें; फिर अनुक्रम (2 x 300 बीपी पेयड-एंड रीड सेटिंग) 600 चक्र वी 3 मानक प्रवाह कोशिकाओं का उपयोग करके, लगभग 100,000 युग्मित-अंत 2 x 300 आधार पढ़ता है।
      नोट: पूर्ण लंबाई प्राइमर दृश्यों: 16S एम्प्लिकॉन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) फॉरवर्ड प्राइमर: 5 ' टीसीजीटीसीजीजीजीसीजीसीजीटीएगागा GACAG-[CCTACGGGN जीजीसीडब्ल्यूजीसीएजी] और 16S एम्प्लिकॉन पीसीआर रिवर्स प्राइमर: 5 ' जीटीसीटीसीजीजीटीसीजीटीटीटीएगागाग-[GACTACHVGGGTATATAATCCCC] ।

4. 16S rRNA जीन अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण

  1. सॉफ्टवेयर पैकेज QIIME 2-201802 20 के साथ अनुक्रमण गुणवत्ताके आधार पर हर नमूने के कच्चे पढ़ता है फिल्टर ।
    1. निर्देशिका में तीन फ़ाइलों की प्रतिलिपि: emp-बनती अंत sequences_01
      एक आगे.fastq.gz फ़ाइल है कि आगे अनुक्रम पढ़ता है,
      एक रिवर्स.फास्टक्यू.gz फ़ाइल जिसमें रिवर्स अनुक्रम पढ़ता है,
      एक बारकोड.fastq.gz फ़ाइल जिसमें संबंधित बारकोड होता है, पढ़ता है
    2. अमल
      qiime उपकरण आयात \
      --प्रकार EMPPairedEndSequences \
      --इनपुट-पाथ एम्प-पेयर-एंड-sequences_01 \--आउटपुट-पाथ एम्प-पेयर-एंड-sequences_02.qza
  2. प्राइमर और एडाप्टर सीक्वेंस निकालें।
    qiime cutadapt ट्रिम-बनती \
    --i-demultiplexed-दृश्यों demultiplexed-seqs_02.qza \
    --पी-फ्रंट-एफ GCTACGGGGGG \
    --पी-फ्रंट-आर GCTACGGGGGG \
    --p-त्रुटि दर 0 \
    --क्वालिटी-कटऑफ 25 \
    --ओ-छंटनी-दृश्यों छंटनी की-seqs_03.qza \
    --वर्बोज
  3. छोटा अनुक्रम पढ़ता है जिसमें दोनों बनती अंत गुण 25 से कम हैं । ऊपर देखें--गुणवत्ता-कटऑफ 25
  4. अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण करें।
    1. 97% पर समानता कटऑफ के साथ परिचालन वर्गीकरण इकाइयों (OTUs) बनाने के लिए दृश्यों को इकट्ठा करें।
      qiime vsearch dereplicate-दृश्यों \
      --i-दृश्यों छंटनी की-seqs_03.qza \
      --ओ-डेरिप्लिकेटेड-टेबल table_04.qza \
      --ओ-डेरेप्लिकेटेड-सीक्वेंस rep-seqs_04.qza
      ​
      qiime vsearch क्लस्टर-फीचर्स-बंद-संदर्भ \
      --i-टेबल table_04.qza \
      --i-दृश्यों rep-seqs_04.qza \
      --i-संदर्भ-दृश्यों 97_otus.qza \
      --p-perc-पहचान 0.97 \
      --ओ-क्लस्टर-टेबल टेबल-सीआर-97.qza \
      --ओ-क्लस्टर-सीक्वेंस प्रतिनिधि-seqs-cr-97.qza \
      --ओ-बेजोड़-दृश्य बेजोड़-सीआर-97.qza
    2. OTUs के लिए, प्रत्येक नमूने में सापेक्ष बहुतायत की गणना करें। बहुतायत जानकारी तालिका में है-cr-97.qza
  5. सभी दृश्यों को सॉर्ट करने के लिए एक देशी बायेसियन क्लासिफायर को नियोजित करें, जिसका उद्देश्य आरडीपी प्रशिक्षण सेट (संस्करण 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/) करना है। मैप किए गए टैक्सन जानकारी तालिका-सीआर-97.qza में है
  6. दिए गए OTU के भीतर, एक वर्गीकरण आवंटित करें जो ओटीयू के दृश्यों के प्रमुख जुटना को दर्शाता है। इसके बाद ओटीयू को संरेखित करें। टेबल-सीआर-97.qza और प्रतिनिधि-seqs-cr-97.qza देखें
  7. नमूना समूह की जानकारी के आधार पर, अल्फा विविधता (चाओ 1, एसीई, शांनोन, सिम्पसन और समानता अनुक्रमित सहित) और यूनिफ्रैक-आधारित प्रमुख निर्देशांक विश्लेषण (पीसीओए) करें।
    qiime उपकरण निर्यात \
    --इनपुट-पाथ टेबल-सीआर-97.qza \
    --आउटपुट-पाथ एक्सपोर्ट-फीचर-टेबल
    निर्यात-सुविधा-तालिका

    qiime विविधता अल्फा \
    --i-table table-cr-97.qza \
    --पी-मीट्रिक observed_otus \
    --ओ-अल्फा-विविधता observed_otus_vector.qza

    qiime विविधता बीटा \
    --i-table table-cr-97.qza \
    --पी-मीट्रिक ब्रेकर्टिस \
    --ओ-डिस्टेंस-मैट्रिक्स unweighted_unifrac_distance_matrix.qza

5. बैक्टीरियल फ़ंक्शन की भविष्यवाणी करें

  1. बैक्टीरिया की विशेषताओं के संबंधित प्रतिनिधित्व की भविष्यवाणी करने के लिए, बगबेस21का उपयोग करें। बगबेस के लिए इनपुट ओटीयू टेबल निम्नलिखित आदेशों का उपयोग करके तैयार किया गया है।
    बायोम कन्वर्ट -i otu_table.बायोम -ओ otu_table.txt --to-tsv
    बायोम कन्वर्ट -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --टेबल-टाइप="OTU टेबल"--टू-जैसन
    नोट: भविष्यवाणी छह फेनोटाइप श्रेणियों (वार्ड एट अल अप्रकाशित) (https://bugbase.cs.umn.edu/) पर आधारित है: ग्राम धुंधला, ऑक्सीजन सहिष्णुता, बायोफिल्म बनाने की क्षमता, मोबाइल तत्व सामग्री, रोगजनकता, और ऑक्सीडेटिव तनाव सहिष्णुता।
  2. मार्कर जीन डेटा के उपयोग और संदर्भ जीनोम22युक्त डेटाबेस के साथ PICRUSt द्वारा एक मेटाजेनोम की कार्यात्मक संरचना की भविष्यवाणी करें ।
    make_otu_table.py-i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt-टी/mnt/nas_bioinfo/रेफरी/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt-o otu_table.biom और
    normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
    predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
    categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
    categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions। L1.txt
  3. 23,24स्टाम्प की मदद से प्रत्येक समूह के बीच कार्यों में अंतर का विश्लेषण करें । सॉफ्टवेयर संचालित करने के लिए प्रशस्ति पत्र का उल्लेख करें।

6. डेटा

  1. निष्कर्षों के महत्व की गणना करने के लिए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। सांख्यिकीय महत्व का संकेत पी < ०.०५ के रूप में स्थापित किया जाना चाहिए ।
  2. छात्र के टी-टेस्ट द्वारा उम्र और समानता में अंतर का आकलन करें । ची-स्क्वायर परीक्षण द्वारा रजोनिवृत्ति की स्थिति, उच्च रक्तचाप और मधुमेह के इतिहास में अंतर का आकलन करें। मान-व्हिटनी यू टेस्ट द्वारा ओवेरियन बैक्टीरियल टैक्सा की संख्या में अंतर का आकलन करें ।

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Representative Results

रोगियों
अध्ययन में कुल 16 योग्य मरीजों को शामिल किया गया था। नियंत्रण समूह सौम्य गर्भाशय ट्यूमर के निदान के साथ 10 महिलाओं को शामिल किया (उनमें से, 3 रोगियों गर्भाशय मायोमा के साथ का निदान किया गया, और 7 रोगियों गर्भाशय adenomyosis के साथ का निदान किया गया) । इस बीच, कैंसर समूह सीरस अंडाशय के कैंसर के निदान के साथ 6 महिलाओं निहित (उनमें से, 2 रोगियों को द्वितीय चरण के साथ का निदान किया गया, और उनमें से 2 चरण III के साथ का निदान किया गया) । निम्नलिखित विशेषताओं ने नियंत्रण समूह और कैंसर समूह के रोगियों के बीच कोई अंतर नहीं दिखाया: आयु, रजोनिवृत्ति की स्थिति, समानता, उच्च रक्तचाप का इतिहास, और मधुमेह का इतिहास(तालिका 1)।

तालिका 1: रोगी आंकड़े कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

दोनों समूहों में अंडाशय जीवाणु प्रजातियों की समृद्धि और विविधता
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेनिंग का उपयोग करने वाले बैक्टीरिया की उपस्थिति चित्र 1में दिखाई गई थी । रोगाणुओं की अल्फा विविधता को अंडाशय जीवाणु प्रजातियों की समृद्धि और विविधता का पता लगाने के लिए एक विधि के रूप में विश्लेषण किया गया था। अंडाशय के कैंसर ऊतकों में देखी गई प्रजातियों की संख्या नियंत्रण समूह की तुलना में छोटी थी, जिसमें कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। समृद्धि (चाओ 1 और ऐस सूचकांक द्वारा प्रतिनिधित्व) और विविधता (शांनोन, सिंपसन, और समानता सूचकांक द्वारा प्रतिनिधित्व) बैक्टीरिया प्रजातियों के दोनों कैंसर समूह और नियंत्रण समूह(चित्रा 2)के बीच काफी अलग नहीं थे ।

Figure 2
चित्रा 2:16S rRNA जीन अनुक्रमण बैक्टीरिया समृद्धि और विविधता में कैंसर और नियंत्रण समूहों के बीच मतभेदों को दर्शाता है । (ए) मनाया प्रजातियों सूचकांक(पी = ०.०६, मान-व्हिटनी यू परीक्षण); (ख) चाओ 1 सूचकांक(पी = 0.06, मान-व्हिटनी यू टेस्ट); (ग) ऐस इंडेक्स(पी = 006, मान-व्हिटनी यू टेस्ट); (घ) शैनन सूचकांक(पी = ०.३२, मान-व्हिटनी यू टेस्ट; ई. समानता सूचकांक(पी = 0.48, मान-व्हिटनी यू परीक्षण); (एफ) सिम्पसन इंडेक्स(पी = ०.४६, मान-व्हिटनी यू टेस्ट) । हमने पिछले प्रकाशकों से पुनर्मुद्रण की अनुमति प्राप्त की। इस आंकड़े को वांग एट अल11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अंडाशय बैक्टीरिया का विवरण
अंडाशय के बैक्टीरिया की बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए सभी नमूनों पर V3-V4 16S rRNA जीन क्षेत्र की गहरी अनुक्रमण किया गया था । परिणामों से पता चला है कि प्रोटेओबैक्टीरिया सबसे प्रचुर मात्रा में फिलम (नियंत्रण समूह में 67.10%और कैंसर समूह में 67.20%) था, फर्मीक्यूट्स दूसरा सबसे प्रचुर मात्रा में फिलम (23.7) था नियंत्रण समूह में 7% और कैंसर समूह में 23.82%), और तीसरा सबसे प्रचुर मात्रा में फाइटलम बैक्टीरियोइडेट (नियंत्रण समूह में 3.26%और कैंसर समूह में 3.41% था)। नियंत्रण समूह की प्रजातियों का विश्लेषण करते समय, मुख्य संरचना में हैलोबैक्टीरोइड्स हैलोबियोस (14.53%), इसके बाद जेम्माटा ऑस्क्यूब्लोग्लूबस (11.07%) और मेथिलोप्रोफंडस तलछटी (10.69%) शामिल थे। कैंसर समूह के लिए, जेम्माटा ऑब्लसग्लोबस क्लस्टर (13.89%) में सबसे अमीर था, इसके बाद हेलोबैक्टीरोइड्स हैलोबियस (11.99%) और मेथिलोप्रोफंडस तलछति (11.12%)(चित्रा 3)।

Figure 3
चित्रा 3:फायना (> 1%) की सापेक्ष बहुतायत और अंडाशय के नमूनों में शीर्ष 12 प्रजातियों में से। (क) नियंत्रण समूह में रोगियों के अंडाशय में फिला (> 1%) की सापेक्ष प्रचुरता । (ख) अंडाशय के कैंसर वाले रोगियों के अंडाशय में फिला (> 1%) की सापेक्ष प्रचुरता । (ग) नियंत्रण रोगियों के अंडाशय में 12 सबसे प्रचुर मात्रा में जीवाणु प्रजातियों की सापेक्ष बहुतायत । (घ) अंडाशय के कैंसर रोगियों के अंडाशय में 12 सबसे प्रचुर मात्रा में जीवाणु प्रजातियों की सापेक्ष बहुतायत । हमने पिछले प्रकाशकों से पुनर्मुद्रण की अनुमति प्राप्त की। इस आंकड़े को वांग एट अल11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

दोनों समूहों के बीच अंडाशय बैक्टीरिया की विभिन्न रचनाएं
पेरमानोवा का उपयोग करके पीसीओए द्वारा विभिन्न जीवाणु समुदायों की तुलना की गई थी। परिणामों से पता चला है कि नियंत्रण समूह में बैक्टीरिया कैंसर समूह, पी < ०.०५(चित्रा 4)में उन लोगों से मतभेद ।

Figure 4
चित्रा 4:पीसीओए समुदायों के समूहों और एनोक्सीनेट्रोनम सिबिरिकम और मेथानोसआरसीिना वैकुओल्टा के सापेक्ष बहुतायत का पता लगाता है। (ए) समुदायों को पीसीओए का उपयोग करके क्लस्टर किया गया था। PC1 और PC2 एक्स और वाई कुल्हाड़ियों पर साजिश रची जाती है। रेड ब्लॉक ओवेरियन कैंसर समूह में एक नमूना इंगित करता है। नीला चक्र नियंत्रण समूह में एक नमूना इंगित करता है। ओवेरियन कैंसर ग्रुप से लिए गए नमूनों को कंट्रोल ग्रुप में अन्य नमूनों से अलग कर दिया गया । (ख) पीसीओए का उपयोग करके संकुल समुदाय । PC1 और PC2 एक्स और वाई कुल्हाड़ियों पर साजिश रची जाती है। रेड ब्लॉक ओवेरियन कैंसर समूह में एक नमूना इंगित करता है। नीला ठोस चक्र गर्भाशय मायोमा वाले रोगी से एक नमूना इंगित करता है, और नीला खोखला चक्र गर्भाशय एडेनोमायोसिस वाले रोगी के नमूने के बराबर होता है। (ग) एनोक्सीनेट्रोनम सिबिरिकम (नियंत्रण समूह: एन = 10, कैंसर समूह: एन = 6, पी = 0.034, मान-व्हिटनी यू परीक्षण) की सापेक्ष बहुतायत। (घ) मेथानोसेसिना vacuolata के सापेक्ष बहुतायत (नियंत्रण समूह: एन = 10, कैंसर समूह: n = 6, पी = ०.००१, मान-व्हिटनी यू परीक्षण) । हमने पिछले प्रकाशकों से पुनर्मुद्रण की अनुमति प्राप्त की। इस आंकड़े को वांग एट अल11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

विभिन्न दृष्टिकोणों से कैंसर और नियंत्रण समूहों में ओवेरियन बैक्टीरियल संरचना
ओवेरियन बैक्टीरिया संरचना का विश्लेषण विभिन्न दृष्टिकोणों से किया गया था ताकि पहचाने गए अंडाशय बैक्टीरिया में अंतर का पता लगाया जा सके। तालिका 2में, फाइनल, वर्ग, आदेश, परिवार, जीनस और प्रजातियों के स्तर पर विचार किया गया था, और चार्ट में आंकड़े प्रदान किए गए हैं। विशेष रूप से, एनोक्सीनेट्रोनम सिबिरिकम की सापेक्ष बहुतायत और ट्यूमर के चरण के बीच एक संबंध था, और ओवेरियन कैंसर(टेबल 2)का निदान करते समय मेथानोसेसिना वैकुओल्टा एक विशिष्ट संकेत था।

भविष्यवाणी किए गए कार्यों के आधार पर दो समूहों में अंडाशय बैक्टीरिया का फेनोटाइपिक संरक्षण
कैंसर समूह में, नियंत्रण समूह (विलकॉक्सन साइन-रैंक टेस्ट, पी = 0.02 और पी = 0.002) की तुलना में संभावित रोगजनक और ऑक्सीडेटिव तनाव-सहिष्णु फेनोटाइप से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई थी। निम्नलिखित पहलुओं में ओवेरियन कैंसर और नियंत्रण समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया: एरोबिक, एनारोबिक, संकाय रूप से एनारोबिक, ग्राम-सकारात्मक और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के फेनोटाइप; मोबाइल तत्व; और ओवेरियन बैक्टीरिया(चित्रा 5)का बायोफिल्म गठन । कैंसर और नियंत्रण समूहों में अंडाशय में बैक्टीरिया के बीच ४६ संस्करण KEGG रास्ते निर्धारित किए गए थे । कैंसर ग्रुप में अंडाशय ने 26 बढ़े हुए रास्ते दिखाए । इनमें सबसे ज्यादा संबंधित रास्ते ट्रांसपोर्टर थे। दूसरी ओर, अंडाशय के कैंसर के ऊतकों में बैक्टीरिया ने 20 कम रास्ते दिखाए । सबसे प्रासंगिक कार्य इस प्रकार थे: स्राव प्रणाली, अज्ञात कार्य, और दो घटक प्रणाली। बाकी रास्ते चित्र 6में दिखाए गए हैं .

Figure 1
चित्रा 1:अंडाशय में एलपीएस इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अभिव्यक्ति। (ए) नियंत्रण समूह (10 x) । स्केल बार, 200 माइक्रोन( बी) नियंत्रण समूह (40 x)। स्केल बार, 50 माइक्रोन (सी) कैंसर समूह (10x)। स्केल बार, 200 माइक्रोन ( डी) कैंसर समूह (40 x)। स्केल बार, 50 माइक्रोन। तीर ओवेरियन ऊतक में धुंधला एलपीएस को इंगित करते हैं। हमने पिछले प्रकाशकों से पुनर्मुद्रण की अनुमति प्राप्त की। इस आंकड़े को वांग एट अल11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:बगबेस द्वारा विश्लेषण किए गए मेटाजीनोम्स की भविष्यवाणी की गई है। कैंसर समूह में कुछ जीन की अभिव्यक्ति नियंत्रण समूह में उस के साथ तुलना में वृद्धि हुई थी । ये जीन संभावित रोगजनक (विलकॉक्सन हस्ताक्षरित रैंक परीक्षण, पी = 0.02) और अंडाशय के ऑक्सीडेटिव तनाव-सहिष्णु फेनोटाइप से संबंधित थे। (विलकॉक्सन हस्ताक्षरित रैंक परीक्षण, पी = 0.002) । हमने पिछले प्रकाशकों से पुनर्मुद्रण की अनुमति प्राप्त की। इस आंकड़े को वांग एट अल11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:कैंसर और नियंत्रण समूहों के बीच विभिन्न KEGG रास्तों का PICRUSt विश्लेषण। हमने पिछले प्रकाशकों से पुनर्मुद्रण की अनुमति प्राप्त की। इस आंकड़े को वांग एट अल11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 2: समृद्धि (चाओ 1 और ऐस सूचकांक द्वारा प्रतिनिधित्व) और बैक्टीरियल प्रजातियों की विविधता (शांनोन, सिंपसन और समानता सूचकांक द्वारा प्रतिनिधित्व) कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ओवेरियन कैंसर का महिलाओं की प्रजनन क्षमता25पर उल्लेखनीय प्रभाव पड़ता है । अधिकांश अंडाशय के कैंसर के रोगियों को देर से चरणों में निदान किया जाता है, और 5 साल की जीवित रहने की दर 30%18से कम है। लिवर, अग्न्याशय और तिल्ली सहित पेट के ठोस विसरा में बैक्टीरिया की पुष्टि प्रकाशित की गई है । ऊपरी मादा प्रजनन पथ में बैक्टीरिया का अस्तित्व इसलिए होता है क्योंकि गर्भाशय ग्रीवा 2 ,3,4,5संलग्न नहीं है . हालांकि, क्या अंडाशय, जो पेट ठोस आंत हैं, बाँझ हैं या नहीं अभी तक निर्धारित नहीं किया गया है । इसके अतिरिक्त, क्या अंडाशय में बैक्टीरिया अंडाशय के कैंसर से संबंधित हैं, यह भी एक महत्वपूर्ण सवाल है।

बैक्टीरिया है कि हम पाया में महत्वपूर्ण मतभेद विभिन्न समूहों के बीच तुलना में थे। ऊपर उल्लिखित सभी प्रक्रियाएं कड़ाई से रोगाणु मुक्त थीं, जिनमें उपकरण, अभिकर्ण, उपकरण और पूरे प्रोटोकॉल का संचालन शामिल था। इससे भी महत्वपूर्ण बात, हम संभव संदूषण प्रतिक्रिया करने के लिए नियंत्रण समूह के रूप में सौम्य गर्भाशय रोग के साथ रोगियों से अंडाशय का इस्तेमाल किया । हालांकि, इस प्रोटोकॉल में संदूषण से बचा नहीं जा सकता । इस प्रकार, चूंकि कैंसर समूह और नियंत्रण समूह का विश्लेषण एक ही प्रयोगात्मक वातावरण में किया गया था, केवल इन दोनों समूहों के बीच मतभेदों की तुलना करके, हम अंडाशय के कैंसर के माइक्रोबायोलॉजिकल मूल के बारे में प्राथमिक सबूत प्राप्त कर सकते हैं ।

अंडाशय के ऊतकों में बैक्टीरिया के निष्कर्षों एक नया अंडाशय के कैंसर को प्रभावित बैक्टीरिया की जांच क्षेत्र शुरू हो सकता है । इसके अतिरिक्त, कैंसर अंडाशय के ऊतकों में बैक्टीरिया की अनूठी उपस्थिति और संरचना ओवेरियन कैंसर के कार्सिनोजेनेसिस और बैक्टीरिया के चिकित्सीय और शकुन लक्ष्यों को निर्देशित कर सकती है। 46 केजीजी रास्तों में, वैनकमाइसिन समूह एंटीबायोटिक दवाओं के बायोसिंथेसिस से संबंधित कार्यों ने विशेष ध्यान आकर्षित किया। यह अंडाशय के कैंसर के लिए आगे उपचार के विकल्प प्रदान कर सकता है।

हालांकि प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं थीं। पहले तो नैतिक कारणों से स्वस्थ लोगों से नमूने एकत्र नहीं किए जा सके। नियंत्रण समूह सौम्य गर्भाशय रोग (गर्भाशय मायोमा और एडेनोमासिस सहित) के रोगियों का अंडाशय था। दूसरा, नमूनों की संख्या बड़ी होनी चाहिए । अध्ययन के सीमित नमूना आकार परिणामों की सटीकता में बाधा हो सकती है । तीसरा, हालांकि कैंसर समूह और नियंत्रण समूह एक ही परिस्थितियों में थे, वहां कोई नकारात्मक या सकारात्मक नियंत्रण थे । इसके अलावा प्रदूषण से बचा नहीं जा सका। आज तक, अंडाशय के कैंसर के रोगियों में अंडाशय बैक्टीरिया का अध्ययन अभी भी प्रारंभिक चरण में है। अधिक नमूनों के साथ एक बड़े पैमाने पर अध्ययन की जरूरत है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को शीआन जियाओटोंग विश्वविद्यालय, चीन (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), शैनक्सी प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (2018JM7073, 2018JM7073, 2017ZDJC-11), शानक्सी प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग की प्रमुख अनुसंधान और विकास परियोजना (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), शानक्सी प्रांतीय सहयोगी प्रौद्योगिकी नवाचार परियोजना (2 017XT-026, 2018XT-002), और Xian सामाजिक विकास मार्गदर्शन योजना (2017117SF/YX011-3) की चिकित्सा अनुसंधान परियोजना । फंडर्स की अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने या पांडुलिपि तैयार करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी।

हम नमूने एकत्र करने में उनके योगदान के लिए Xian Jiaotong विश्वविद्यालय के पहले संबद्ध अस्पताल के स्त्री रोग विभाग में सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2200 TapeStation Software Agilgent
United States
AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories Illumina
Image-pro plus 7 Media Cybernetics
Leica ASP 300S Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
Leica EG 1150 Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
Leica RM2235 Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 Hycult Biotech
Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads Omega Biotek M1386-00
Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit Omega Biotek M4029-01
MiSeq Illumina SY-410-1003
Silva database Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University
the QuantiFluor dsDNA System Promega E2670
Trimmomatic Björn Usadel
ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit Zytomed Systems HRP008DAB-RB

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कैंसर अनुसंधान अंक 176 ओवेरियन कैंसर बैक्टीरिया 16S आरएनए जीन अनुक्रमण लिपोपोलिनासैचराइड केजीजी इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
ओवेरियन ऊतकों में बैक्टीरिया की लक्षण वर्णन और कार्यात्मक भविष्यवाणी
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