Summary
면역조직화학 염색 및 16S 리보소말 RNA 유전자(16S rRNA 유전자) 시퀀싱은 시투에서 암 및 비암 난소 조직에서 박테리아를 발견하고 구별하기 위해 수행되었다. 박테리아의 구성 및 기능적 차이는 관찰되지 않은 국가의 재건에 의해 지역 사회의 BugBase 및 Phylogenetic 조사를 사용하여 예측되었다 (PICRUSt).
Abstract
"멸균"여성 상부 생식 기관의 이론은 세균 검출의 발전으로 인해 증가 반대가 발생하고있다. 그러나 난소에 박테리아가 포함되어 있는지 여부는 아직 확인되지 않았습니다. 본명, 난소 조직에서 박테리아를 검출하는 실험이 도입되었다. 우리는 대조군에 있는 암 단에 있는 난소암 환자 및 비암 환자를 선택했습니다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석은 암 및 대조군으로부터 난소 조직에서 박테리아를 분화시키는 데 사용되었다. 또한, 우리는 BugBase및 PICRUSt를 사용하여 확인된 박테리아의 기능적 조성을 예측했습니다. 이 방법은 또한 많은 장기가 최근 몇 년 동안 박테리아를 항구 입증되었기 때문에 다른 내장 및 조직에서 사용될 수 있습니다. 내장과 조직에 박테리아의 존재는 과학자가 암과 일반적인 조직을 평가하는 것을 도울 수 있고 암의 처리에 있는 원조일 지도 모릅니다.
Introduction
최근에는 신장, 비장, 간 및 난소1,2와같은 복부 고체 내장에서 박테리아의 존재를 증명하는 기사가 증가하고 있습니다. 겔러 외. 췌장 종양에서 박테리아를 발견 하 고, 이러한 박테리아는 gemcitabine에 저항 했다, 화학 요법 약물2. S. 만프레도 비에이라 외. 엔테로 코커스 갈리나룸은 림프절, 간 및 비장에 이식하고, 자가 면역3을구동 할 수 있다는 결론을 내렸다.
자궁 경부는 수비수역할을하기 때문에 자궁, 나팔관 및 난소를 포함하는 상부 여성 생식 기관의 박테리아는 최소한으로 연구되었습니다. 그러나 최근 몇 년 동안 몇 가지 새로운 이론이 확립되었습니다. 박테리아는 mucins4,5의변화로 인해 생리 주기 동안 자궁 구멍에 접근할 수 있다. 또한, Zervomanolakis 외. 자궁, 나팔관과 함께, 난소의 내분비 시스템에 의해 제어 되는 연동 성 펌프, 이러한 배열은 박테리아가 내분비, 나팔관 및 난소6에들어갈 수 있도록.
상부 생식관은 더 이상 세균 검출 방법의 발달 덕분에 더 이상 신비가 아닙니다. Verstraelen 외는 16S RNA 유전자7의V1-2 하이퍼변수 영역을 대상으로 하 여 자궁 박테리아를 발견하기 위해 바코드 페어링-엔드 시퀀싱 방법을 사용했다. 팡 등은 자궁내막 폴립 환자에서 바코드 시퀀싱을 사용하였으며 다양한 자궁 내 세균8의존재를 밝혔다. 또한, 16S RNA 유전자를 이용하여, 마일즈 외 및 첸 외. 살핀고-oophorectomy 및 자군 절제술을 겪은 여성의 생식기 시스템에서 박테리아를 각각5,9.
종양 조직에 있는 박테리아는 최근 몇 년 동안에 있는 증가 관심을 얻고 있습니다. Banerjee 외. 미생물군유전체 시그니처가 난소암 환자와대조군 10사이에서 다르다는 것을 발견했다. noxynatronum sibiricum 종양 단계와 연관 되었다, 그리고 메타노 사르키나 vacuolata 난소암 진단 하는 데 사용할 수 있습니다11. 난소암 이외에, 위암, 폐, 전립선, 유방, 자궁경부 및 자궁내막과 같은 다른 암은 박테리아12,13,14,15,16,17,18과연관되는 것으로 입증되었다. Poore 외. 초기 단계 암 검진을 예견하는 미생물 기지를 둔 종양학 진단의 새로운 클래스를제안했습니다 19. 이 프로토콜에서, 우리는 이 두 조직에 있는 박테리아의 조성 그리고 기능을 비교해서 암과 일반적인 난소 조직 사이 다름을 조사했습니다.
면역히스토화학 염색 및 16S rRNA 유전자 염기서열분석은 난소에서 박테리아의 존재를 확인하기 위해 수행되었다. 암과 비암 난소 조직에서 난소 박테리아의 차이와 예측 된 기능을 연구하였다. 결과는 난소 조직에 있는 박테리아의 존재를 보여주었습니다. 안옥시나트로눔시비리쿰과 메타노사르시나 바쿠올라타는 각각 난소암의 단계와 진단과 관련이 있었다. 두 그룹에서 존재했던 46개의 상당히 다른 KEGG 통로를 비교했습니다.
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Protocol
이 연구는 시안자오퉁 대학 제1부속병원의 의료기관윤리위원회에 의해 승인되었다(No. XJTUIAF2018LSK-139). 모든 등록 된 환자로부터 통보 된 동의를 얻었습니다.
1. 암 그룹 및 대조군 진입 기준
- 암 단을 위해, 주로 난소암으로 진단되는 환자를 등록하고, 복강경 후에, 그(것)들은 병리학적인 사실 인정에 의하여 장뇌 난소암이 있다는 것을 증명됩니다.
- 대조군의 경우, 난소 질환을 제시하지 않고 자궁 근종 또는 자궁 아데노미증으로 주로 진단되고 자군 절제술과 살핀고-oophorectomy를 겪은 환자를 등록하십시오.
참고: 이 표준은 명확하지 않습니다. 자군 절제술과 살핀고-난소 절제술을 겪는 난소에 영향을 미치지 않는 질병 환자도 등록할 수 있습니다. - 다음 기준 중 하나 이상을 가진 환자를 제외합니다.
임신 또는 모유 수유 여성.
항생제를 복용 2 수술 전에 개월.
발열 또는 높은 염증 성 마커를 갖는.
어떤 종류의 염증이 있습니다.
신애자주반트 화학요법을 받은 후.
2. 샘플 수집
- 수술 중, 절제된 난소를 멸균 관에 넣고 튜브를 액체 질소에 넣고 운반합니다. 전체 절차 전반에 걸쳐 다른 것을 만지지 마십시오.
- 난소를 약 1cm 두께의 조직 샘플로 분리하여 라미나르 플로우 캐비닛 아래에 새로운 멸균 핀셋을 넣습니다. 분리 후 -80°C에서 샘플을 보존하십시오.
참고: 샘플을 수집하는 모든 절차는 난소를 분리하는 것을 포함하여 무균입니다.
3. 16S rRNA 유전자 서열
- DNA를 추출합니다.
- 2mL 원심분리기 튜브에 EX 버퍼를 억제하는 1.2mL를 추가합니다. 그런 다음 180-220 mg의 샘플을 튜브에 추가합니다. 샘플을 완전히 섞어 보자 (70 °C 수조 5 분 동안 다음 15 s에 대한 소용돌이).
- 600 x g에서 1 분 동안 튜브원심분리합니다.
- 상피물의 550 μL을 새로운 1.5mL 튜브에 넣고 원심분리기를 600 x g에서 1분 동안 배치합니다.
- 30 μL의 단백질Ae K로 상체의 400 μL을 다른 1.5 mL 튜브로 옮킨다.
- 버퍼 AL 400 μL을 추가하고 15s에 대한 소용돌이 믹서를 사용합니다.
- 70°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 96-100% 알코올의 400 μL을 추가합니다. 15s에 대한 소용돌이 믹서를 사용합니다.
- 혼합물 600 μL을 흡수 열과 원심분리기로 1분 동안 13700g으로 옮긴다. 하부 튜브를 교환합니다. 이 단계를 11번 반복합니다.
- 완충 AW1 500 μL, 원심분리기 는 13,700 x g에서 1분 동안 추가하고 하부 튜브를 변경합니다.
- 완충 AW2 500 μL, 원심분리기는 13,700 x g로 3분 간 추가하고 하부 튜브를 변경합니다.
- 원심 분리기는 13,700 x g에서 3 분 동안.
- 혼합물을 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고, 완충 ATE 200 μL을 추가하고, 실온에서 5분 동안 배양하고 원심분리기는 13,700 x g에서 1분 동안 배양합니다.
- 품질 테스트. 1% 세파로즈 젤 전기전도를 사용하여 품질을 테스트하십시오. 샘플 400 ng, 120 V, 30분 추가 이상적인 결과: DNA 농도: ≥ 10 ng/μL, DNA 순도: A260/A280 = 1.8-2.0, 총 DNA: ≥ 300 ng.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 16S 메타게노믹 시퀀싱 키트를 사용하여 라이브러리를 준비합니다.
- PCR을 수행합니다. 간단히 말해서, 각 25 μL PCR 반응은 입력으로 샘플 DNA의 12.5 ng, 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix의 12.5 μL 및 1 μM에서 각 프라이머의 5 μL을 포함합니다.
- 다음 프로토콜을 사용하여 PCR을 수행: 3 분 동안 95 °C에서 수행 된 초기 내성 단계는 25 주기의 데포화 (95 ° C, 30 s), 어닐링 (55 ° C, 30 s) 및 확장 (72 ° C, 30 s), 72 ° C에서 5 분의 최종 신장이 뒤따릅니다.
- 제조업체의 지침을 사용하여 자기 구슬과 반응 믹스에서 PCR 제품을 정리합니다.
- 3.3.1 및 3.3.2 단계를 반복합니다.
- 품질 테스트. 3.2단계를 참조하십시오.
- 3.3.3을 반복합니다.
- 품질 테스트. 불순물을 테스트하기 위해 1% Sepharose 젤 전기포고증, 순도를 테스트하는 분광광계, 농도를 테스트하는 불소계, RNA 분석 키트를 사용하여 무결성을 테스트합니다. 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 라이브러리를 정규화하고 풀로 고정합니다. 그런 다음 600 사이클 V3 표준 유량 셀을 사용하여 서열(2 x 300 bp 페어링 엔드 읽기 설정)을 사용하여 약 100,000 쌍끝 2 x 300 베이스 읽기를 생성합니다.
참고: 전체 길이 프라이머 시퀀스: 16S 앰플리턴 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 포워드 프라이머: 5' TCGTCGGCAGCCAGGTGGTGGTGGTGG-[CCTACGGGG GNGGCWGCAG] 및 16S 앰플리턴 PCR 역 프라이머: 5' GTCTCGTGGGCTCGGGAGATGTG타타아가카카-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].
4. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 데이터 분석
- 소프트웨어 패키지 QIIME 2-201802 20으로 시퀀싱 품질을 기반으로 모든샘플의 원시 판독을 필터링합니다.
- 세 개의 파일을 디렉토리에 복사합니다: 엠프 페어링 엔드 엔드-sequences_01
앞으로 시퀀스가 포함된 하나의 forward.fastq.gz 파일은
역시퀀스가 포함된 한 가지 역.fastq.gz 파일은
연결된 바코드가 포함된 하나의 바코드.fastq.gz 파일 - 수행하다
키임 도구 가져오기 \
--유형 EMP짝끝시퀀스 \
--입력 경로 emp-페어링 엔드-sequences_01 \--출력 경로 emp-쌍 끝-sequences_02.qza
- 세 개의 파일을 디렉토리에 복사합니다: 엠프 페어링 엔드 엔드-sequences_01
- 프라이머와 어댑터 시퀀스를 제거합니다.
키이메 컷어댑트 트림 페어링 \
--i-de멀티플렉션 시퀀스 디멀티플록스-seqs_02.qza \
--p-프론트-f GCTACGGGGGG \
--p-프론트 R GCTACGGGGGG \
--p-오류 율 0 \
--품질 컷오프 25 \
--o-트리밍 시퀀스 트리밍-seqs_03.qza \
--자세한 내용 - 단축 시퀀스는 두 쌍 끝 특성이 25보다 낮은 읽기입니다. 위의 참조 --품질 컷오프 25
- 시퀀싱 데이터를 분석합니다.
- 시퀀스를 수집하여 97%의 유사성 차단을 통해 운영 분류 장치(OtUs)를 형성합니다.
키이메 vsearch 복제 해제 시퀀스 \
--i-sequences 트리밍-seqs_03.qza \
--o-제거 테이블 table_04.qza \
--o-복제 시퀀스 rep-seqs_04.qza
키이메 vsearch 클러스터 기능 닫기 참조 \
--i-테이블 table_04.qza \
--i-sequences rep-seqs_04.qza \
--i-참조 시퀀스 97_otus.qza \
--p-퍼크 아이덴티티 0.97 \
--o 클러스터테이블 테이블-cr-97.qza \
--o-클러스터 된 시퀀스 rep-seqs-cr-97.qza \
--타의 추종을 불허하는 시퀀스-cr-97.qza - OtUs의 경우 각 샘플에서 상대적 풍부를 계산합니다. 풍부한 정보는 테이블 cr-97.qza에 있습니다.
- 시퀀스를 수집하여 97%의 유사성 차단을 통해 운영 분류 장치(OtUs)를 형성합니다.
- RDP 교육 세트(버전 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)를 목표로 하는 네이티브 베이지안 분류기를 사용하여 모든 시퀀스를 정렬합니다. 매핑된 분류 정보는 표-cr-97.qza에 있습니다.
- 지정된 OTU 내에서, OtUs에 시퀀스의 주요 일관성을 반영하는 분류를 할당합니다. 그런 다음 OtUs를 정렬합니다. 테이블 cr-97.qza 및 담당자-seqs-cr-97.qza 보기
- 샘플 그룹 정보를 기반으로 알파 다이버시티(차오 1, ACE, 섀넌, 심슨 및 Evenness 인덱스 포함)와 UniFrac 기반 주좌 분석(PCoA)을 수행합니다.
키임 도구 내보내기 \
--입력 경로 테이블-cr-97.qza \
--출력 경로 내보내기 피처 테이블
내보낸 피처 테이블
키임 다이버시티 알파 \
--i 테이블-cr-97.qza \
--p-미터량 observed_otus \
--o-알파 다이버시티 observed_otus_vector.qza
키임 다이버시티 베타 \
--i 테이블-cr-97.qza \
--p-미터 브레이커티스 \
--o-거리 매트릭스 unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. 세균 기능 예측
- 박테리아의 특성의 관련 표현을 예측하려면 BugBase21을사용하십시오. BugBase용 입력 OTU 테이블은 다음 명령을 사용하여 준비됩니다.
바이오엠 변환 -i otu_table.biom -o otu_table.txt -to-tsv
바이오M 변환 -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --테이블 형 ="OTU 테이블"--to-json
참고: 예측은 6가지 표현형 범주(워드 외. 미게시) (https://bugbase.cs.umn.edu/): 그램 염색, 산소 내성, 생물막을 형성하는 능력, 모바일 요소 함량, 병원성 및 산화 스트레스 허용 오차를 기반으로 합니다. - PICRUSt에 의한 메타게놈의 기능적 조성물을 마커 유전자 데이터와 기준게놈(22)을포함하는 데이터베이스의 사용과 함께 예측한다.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t/mnt/nas_bioinfo/심판/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
normalize_by_copy_number.py-i otu_table.biom-o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py-i normalized_otus.biom-o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py-i metagenome_predictions.biom-c "KEGG_Pathways"-l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f-i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt - STAMP23,24의도움으로 각 그룹 간의 기능 차이를 분석합니다. 소프트웨어를 작동하려면 인용을 참조하십시오.
6. 데이터
- 통계 소프트웨어를 사용하여 결과의 중요성을 계산합니다. 통계적 유의의 표시는 P < 0.05로 설정되어야 합니다.
- 학생의 t-테스트에 의해 나이와 패리티의 차이를 평가합니다. 치 스퀘어 테스트에 의해 갱년기 상태, 고혈압과 당뇨병의 역사에 차이를 평가합니다. Mann-Whitney U 시험에 의한 난소 세균성 택시 수의 차이를 평가합니다.
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Representative Results
환자
총 16명의 자격을 갖춘 환자가 연구 결과에 포함되었습니다. 대조군은 양성 자궁 종양진단을 받은 여성 10명이 포함되었다(그 중 3명의 환자는 자궁 근종으로 진단되었고, 7명의 환자는 자궁 아데노마이증으로 진단되었다). 한편, 암 그룹은 장뇌 난소암 진단을 받은 6명의 여성을 포함시켰다(그 중 2명의 환자는 단계 II로 진단되었고, 그 중 2명은 단계 III로 진단되었다). 다음 특성은 대조군과 암군에서 환자 들 사이에 차이가 없음을 보였다: 나이, 갱년기 상태, 패리티, 고혈압의 역사, 당뇨병의 역사(표 1).
표 1: 환자 통계는 여기를 클릭하여 이 표를 다운로드하십시오.
두 그룹에서 난소 세균 종의 풍부함과 다양성
면역히스토케토화학 염색을 이용한 박테리아의 존재는 도 1에나타났다. 미생물의 알파 다양성은 난소 세균종의 풍부함과 다양성을 검출하는 방법으로 분석되었다. 난소암 조직에서 관찰되는 종의 수는 대조군의 수보다 작으며, 큰 차이는 없었다. 세균종의 풍요로움(차오 1과 ACE 지수로 표현)과 다양성(섀넌, 심슨, 그리고 균등도 지수로 표현)은 암그룹과 대조군(도2)과크게 다르지 않았다.
도 2: 16S rRNA 유전자 염기서열분석은 세균성 풍부함과 다양성에서 암과 대조군 간의 차이를 나타낸다. (A) 관찰된 종 지수(P = 0.06, Mann-Whitney U test); (B) 차오 1 지수(P = 0.06, Mann-Whitney U 테스트); (C) ACE 인덱스(P = 0.06, Mann-Whitney U 테스트); (D) 섀넌 인덱스(P = 0.32, Mann-Whitney U 테스트; E. 균일성 지수(P = 0.48, Mann-Whitney U 테스트); (F) 심슨 지수(P = 0.46, Mann-Whitney U 테스트). 이전 게시자로부터 재인쇄 허가를 받았습니다. 이 그림은 왕 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
난소 박테리아에 대한 설명
V3-V4 16S rRNA 유전자 영역의 깊은 시퀀싱은 난소 박테리아의 더 나은 이해를 얻기 위해 모든 샘플에서 수행되었다. 그 결과 프로테오박테리아가 가장 풍부한 필럼(대조군 67.10%, 암군 67.20%)이 가장 풍부한 필럼(대조군 23.77%, 암군 23.82%)으로 나타났으며, 3번째로 풍부한 필럼은 박스터이테스(3.26%)로 나타났다. 대조군의 종을 분석할 때, 주요 조성물은 할로박테로이드 할로바이오스(14.53%)로 구성되었고, 젬마타 옵스큐리글로버스(11.07%)와 메틸로프로펀투스 퇴적물(10.69%)이 그 뒤를 이었다. 암군의 경우 젬마타 옵스큐리글로버스가 클러스터(13.89%)에서 가장 많았고, 할로박테로이드 할로비우스(11.99%)와 메틸로프로펀더스 퇴적물(11.12%)이그 뒤를 이었다.
그림 3: 필라 (> 1 %)와 난소 샘플에서 상위 12 종의 상대적 풍부. (A) 대조군 환자의 난소에서 필라(> 1%)의 상대적 풍부함. (B) 난소암 환자의 난소에서 필라(> 1%)의 상대적 풍부함. (C) 대조군 환자의 난소에서 가장 풍부한 12 종의 상대적 풍부. (D) 난소암 환자의 난소에서 가장 풍부한 12종의 상대적 풍부. 이전 게시자로부터 재인쇄 허가를 받았습니다. 이 그림은 왕 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
두 그룹 사이의 난소 박테리아의 다른 조성
다른 세균 성 지역 사회의 비교는 PERMANOVA를 사용하여 PCoA에 의해 수행되었다. 결과는 대조군에 있는 박테리아가 암 단에 있는 것과 다르다는 것을 보여주었습니다, P < 0.05(도 4).
그림 4: PCoA는 지역 사회의 클러스터와 안옥시나트로넘 시비리쿰과 메타노사르키나 바쿠올라타의 상대적 풍요로움을 검출하였다. PC1 및 PC2는 x 및 y 축에 플롯됩니다. 적색 블록은 난소암 그룹의 샘플을 나타낸다. 파란색 원은 대조군의 샘플을 나타냅니다. 난소암 군으로부터의 샘플은 대조군에 있는 다른 샘플로부터 분리되었다. (B) PCoA를 사용하여 클러스터된 커뮤니티. PC1 및 PC2는 x 및 y 축에 플롯됩니다. 적색 블록은 난소암 그룹의 샘플을 나타낸다. 파란색 고체 원은 자궁 근종을 가진 환자로부터의 샘플을 나타내며, 파란색 중공 원은 자궁 아데노미증을 가진 환자의 샘플과 같습니다. (C) 안옥시나트로눔 시비리쿰의 상대적 풍부성(대조군: n = 10, 암군: n= 6, P = 0.034, Mann-Whitney U test). (D) 메타노사르시나 바쿠올라타(대조군: n = 10, 암군: n= 6, P = 0.001, Mann-Whitney U 테스트)의 상대적 풍부함). 이전 게시자로부터 재인쇄 허가를 받았습니다. 이 그림은 왕 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
암과 대조군의 난소 세균 조성물은 다른 관점에서
난소 세균 조성물의 분석은 확인된 난소 박테리아의 차이를 더 검출하기 위해 상이한 관점에서 수행되었다. 표 2에서는,필럼, 계급, 질서, 가족, 속 및 종 수준을 고려하였고, 통계는 차트에 제공된다. 특히, 안옥시나트로눔시비리쿰과 종양의 단계 사이의 상대적 풍부도가 있었고, 메탄노사아르키나 바쿠올라타는 난소암 진단시 특이적인 징후였다(표2).
예측된 기능에 근거를 둔 두 단에 있는 난소 박테리아의 현상 보존
암 그룹에서, 잠재적으로 병원성 및 산화 스트레스 내성 표현형과 관련된 유전자의 발현이 대조군의 발현이 증가하였다(Wilcoxon 서명랭크 테스트, P=0.02 및 P=0.002). 다음과 같은 양상에서 난소암과 대조군 사이에는 큰 차이가 발견되지 않았다: 호기성의 표현형, 혐기성, 학부적으로 혐기성, 그람 양성, 그리고 그람 음성 박테리아; 모바일 요소; 난소균의 생물막형성(도 5). 암과 대조군의 난소에 있는 박테리아 사이 46개의 변이체 KEGG 통로가 결정되었다. 암 그룹에 있는 난소는 26 증가한 통로를 보여주었습니다. 그 중에서도 가장 밀접한 관련이 있는 통로는 수송자였습니다. 한편, 난소암 조직의 박테리아는 20개의 감소된 통로를 보였다. 가장 관련성이 있는 기능은 분비 시스템, 알 수 없는 기능 및 2구성 요소 시스템입니다. 나머지 경로는 도 6에표시됩니다.
도 1: 난소에서 LPS 면역히스토케적 발현. (A) 대조군(10 x). 스케일 바, 200 μm. (B) 제어 군(40 x). 스케일 바, 50 μm. (C) 암 그룹(10x). 스케일 바, 200 μm. (D) 암 그룹 (40 x). 스케일 바, 50 μm. 화살은 난소 조직에서 염색하는 LPS를 가리킵니다. 이전 게시자로부터 재인쇄 허가를 받았습니다. 이 그림은 왕 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: BugBase에 의해 분석된 예측 된 메타게놈. 암 그룹에 있는 몇몇 유전자의 발현은 대조군에서 그것에 비해 증가하였다. 이 유전자는 잠재적으로 병원성 (Wilcoxon 서명 된 순위 테스트, P = 0.02) 및 난소의 산화 스트레스 내성 표현형과 관련이 있었습니다. (윌콕슨 서명 순위 테스트, P = 0.002). 이전 게시자로부터 재인쇄 허가를 받았습니다. 이 그림은 왕 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 피크러스의 암및 대조군 사이의 상이한 KEGG 경로 분석. 이전 게시자로부터 재인쇄 허가를 받았습니다. 이 그림은 왕 외11에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 균종의 풍부함(차오 1과 ACE 지수로 표시) 및 박테리아 종의 다양성(섀넌, 심슨, 그리고 균일성 지수로 표현)이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
난소암은 여성의 불임25에주목할 만한 영향을 미칩니다. 대부분의 난소암 환자는 후기 단계에서 진단되고, 5년 생존율은 30%18미만입니다. 간, 췌장 및 비장을 포함한 복부 고체 내장에서 박테리아의 확인이 발표되었습니다. 상부 생식기관에서 박테리아의 존재는자궁경부가2,3,4,5로동봉되지 않기 때문에 발생한다. 그러나 복부 고체 내장인 난소가 멸균인지 여부는 아직 결정되지 않았습니다. 또한 난소의 박테리아가 난소암과 관련이 있는지 여부도 중요한 질문입니다.
우리가 발견 한 박테리아의 중요한 차이는 다른 그룹 사이에서 비교되었습니다. 위에서 언급 한 모든 절차는 기기, 시약, 장비 및 전체 프로토콜의 작동을 포함하여 엄격하게 세균이 없었습니다. 더 중요한 것은, 우리는 가능한 오염을 중화하기 위하여 대조군으로 양성 자궁 질병을 가진 환자에서 난소를 이용했습니다. 그러나 이 프로토콜에서는 오염을 피할 수 없습니다. 따라서, 암 그룹과 대조군은 동일한 실험 환경에서 분석되었기 때문에, 단지 이 두 그룹 간의 차이를 비교함으로써 난소암의 미생물 기원에 대한 1차 증거를 얻을 수 있었다.
난소 조직에 있는 박테리아의 사실 인정은 난소암에 영향을 미치는 박테리아를 조사하는 새로운 필드를 시작할 수 있습니다. 추가적으로, 암 난소 조직에 있는 박테리아의 유일한 존재 그리고 조성은 난소암의 발암생성및 박테리아의 치료 및 예후 표적을 지시할 수 있습니다. 46KEGG 경로 중, 반코미신 그룹 항생제의 생합성과 관련된 기능은 특히 관심을 끌었다. 이것은 난소암을 위한 추가 처리 선택권을 제공할 수 있습니다.
그러나 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 윤리적인 이유로 건강한 사람들로부터 샘플을 수집할 수 없었습니다. 대조군은 양성 자궁 질환(자궁 근종 및 아데노미증 포함)을 가진 환자의 난소였다. 둘째, 샘플 의 수는 더 커야한다. 연구의 제한된 샘플 크기는 결과의 정확성을 방해할 수 있습니다. 셋째, 암 그룹과 대조군이 동일한 조건하에 있었지만 부정적인 또는 양성 대조는 없었습니다. 또한 오염을 피할 수 없었습니다. 현재까지 난소암 환자의 난소 균에 대한 연구는 아직 초기 단계에 있습니다. 더 많은 샘플을 가진 대규모 연구가 필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 시안자오퉁대학교 제1부속병원 임상연구상(XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), 산시성 과학기술부 자연과학 의 주요 기초연구프로젝트(2018JM707, 2018JM707,7073)의 임상연구상을 수상했다. 2017ZDJC-11), 산시성 과학기술부(2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), 산시성 협력기술 혁신 프로젝트(2) 017XT-026, 2018XT-002) 및 시안 사회 개발 지도 계획 (2017117SF / YX011-3)의 의학 연구 프로젝트. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.
시안자오퉁대학교 제1부속병원의 산부인과 동료들에게 샘플 수집에 기여한 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
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