Summary
Immunohistokemi färgning och 16S ribosomal RNA gen (16S rRNA gen) sekvensering utfördes för att upptäcka och skilja bakterier i cancer och icke cancerösa äggstocksvävnader på plats. De kompositionella och funktionella skillnaderna mellan bakterierna förutsågs genom att använda BugBase och Phylogenetic Investigation of Communities genom Rekonstruktion av ouppmärksammade stater (PICRUSt).
Abstract
Teorin om en "steril" kvinnliga övre reproduktiva område har stött på ökande motstånd på grund av framsteg i bakteriell upptäckt. Huruvida äggstockar innehåller bakterier har dock ännu inte bekräftats. Häri infördes ett experiment för att upptäcka bakterier i äggstocksvävnader. Vi valde äggstockscancerpatienter i cancergruppen och icke cancerpatienter i kontrollgruppen. 16S rRNA gensekvensering användes för att skilja bakterier i äggstocksvävnader från cancer- och kontrollgrupperna. Dessutom förutspådde vi den funktionella sammansättningen av de identifierade bakterierna med hjälp av BugBase och PICRUSt. Denna metod kan också användas i andra inälvor och vävnader eftersom många organ har visat sig hysa bakterier under de senaste åren. Förekomsten av bakterier i inälvor och vävnader kan hjälpa forskare att utvärdera cancer och normala vävnader och kan vara till hjälp vid behandling av cancer.
Introduction
Nyligen har ett ökande antal artiklar publicerats som bevisar förekomsten av bakterier i buken fast inälvor, såsom njure, mjälte, lever ochäggstock 1,2. Geller et al. hittade bakterier i bukspottskörteltumörer, och dessa bakterier var resistenta mot gemcitabin, ett kemoterapeutiskt läkemedel2. S. Manfredo Vieira m.fl. drog slutsatsen att Enterococcus gallinarum var bärbart för lymfkörtlarna, levern och mjälten, och det kunde driva autoimmunitet3.
Eftersom livmoderhalsen spelar en roll som försvarare har bakterier i det övre kvinnliga reproduktionssystemet, som innehåller livmodern, äggledarna och äggstockarna, undersökts minimalt. Några nya teorier har dock etablerats under de senaste åren. Bakterier kan ha tillgång till livmoderhålan under menstruationscykeln på grund av förändringar i muciner4,5. Dessutom bekräftade Zervomanolakis et al. att livmodern, tillsammans med äggledarna, är en peristaltisk pump som styrs av äggstockens endokrina system, och detta arrangemang gör det möjligt för bakterier att komma in i endometrium, äggledare ochäggstockar 6.
Det övre reproduktionskanalen är inte längre ett mysterium längre tack vare utvecklingen av bakteriella detektionsmetoder. Verstraelen et al. använde en streckkodad parad sekvenseringsmetod för att upptäcka livmoderbakterier genom att rikta in sig på V1-2 hypervariabel region i 16S RNA-genen7. Fang et al. använde streckkodad sekvensering hos patienter med endometriepolyper och visade förekomsten av olika intrauterin bakterier8. Dessutom, genom att använda 16S RNA genen, Miles et al. och Chen et al. hittade bakterier i könsorganen hos kvinnor som hade genomgått salpingo-ovariotomi och hysterektomi,respektive 5,9.
Bakterier i tumörvävnader har fått allt större uppmärksamhet de senaste åren. Banerjee et al. upptäckte att mikrobiom signaturen skilde sig mellan äggstockscancer patienter och kontroller10. Ennoxynatronum sibiricum var associerad med tumör stadium, och Methanosarcina vacuolata kan användas för att diagnostisera äggstockscancer11. Förutom äggstockscancer har andra cancerformer, såsom mage, lunga, prostata, bröst, livmoderhals och endometrium, visat sig vara associerade med bakterier12,13,14,15,16,17,18. föreslog en ny klass av mikrobiellbaserad onkologidiagnostik, med förutser tidig cancerscreening19. I detta protokoll undersökte vi skillnaderna mellan cancerframkallande och normala äggstocksvävnader genom att jämföra sammansättningen och funktionen av bakterier i dessa två vävnader.
Immunohistokemi färgning och 16S rRNA gen sekvensering utfördes för att bekräfta förekomsten av bakterier i äggstockarna. Skillnaderna och de förväntade funktionerna hos äggstocksbakterierna i cancer och icke-cancerösa äggstocksvävnader studerades. Resultaten visade förekomsten av bakterier i äggstocksvävnader. Anoxynatronum sibiricum och Methanosarcina vacuolata var relaterade till scenen och diagnos av äggstockscancer, respektive. Fyrtiosex betydligt olika KEGG-vägar som fanns i båda grupperna jämfördes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av Medical Institutional Ethics Committee vid det första anslutna sjukhuset i Xi'an Jiaotong University (Nr. XJTUIAF2018LSK-139). Informerat samtycke erhölls från alla inskrivna patienter.
1. Kriterier för att komma in i cancergruppen och kontrollgruppen
- För cancergruppen, registrera patienter som främst diagnostiseras med äggstockscancer, och efter laparotomy, de har visat sig ha serös äggstockscancer genom patologiska resultat.
- För kontrollgruppen, registrera patienter som främst diagnostiseras med livmodermyom eller livmoderns adenomyosis, utan att presentera några äggstockscancer villkor och som har genomgått hysterektomi och salpingo-ovariotomi.
OBS: Denna standard är inte bestämd. Patienter med sjukdomar som inte påverkar äggstockarna som genomgår hysterektomi och salpingo-ovariotomi kan också skrivas in. - Exkludera patienter med ett eller flera av följande kriterier:
Gravida eller ammande kvinnor.
Tar antibiotika 2 månader före operationen.
Har feber eller förhöjda inflammatoriska markörer.
Att ha inflammation av något slag.
Har genomgått neoadjuvant kemoterapi.
2. Samla in prover
- Under operationen, placera de resected äggstockarna i ett sterilt rör och placera röret i flytande kväve för transport. Undvik att röra något annat under hela proceduren.
- Dela äggstockarna i cirka 1 cm tjocka vävnadsprover med ett par nya sterila pincett under ett laminärt flödesskåp. Efter separationen, bevara proverna vid -80 °C.
OBS: Alla procedurer för provtagning är aseptiska, inklusive att separera äggstockarna.
3. Sekvensera 16S rRNA-genen
- Extrahera DNA.
- Tillsätt 1,2 ml hämnings-EX-buffert i ett 2 ml centrifugeringsrör. Tillsätt sedan 180-220 mg prover i röret. Låt provet blandas helt (70 °C vattenbad i 5 min och virvel i 15 s).
- Centrifugera röret i 1 min vid 600 x g.
- Placera 550 μL av supernatanten i ett nytt 1,5 ml-rör och centrifug i 1 min vid 600 x g.
- Överför 400 μL av supernatanten med 30 μL proteinas K till ett annat 1,5 ml-rör.
- Tillsätt 400 μL buffert AL och använd en virvelblandare i 15 s.
- Inkubera vid 70 °C i 10 min.
- Tillsätt 400 μL 96-100% alkohol. Använd en virvelblandare i 15 s.
- Överför 600 μL blandning till en absorptionskolonn och centrifugera i 1 min vid 13700 g. Byt ut det nedre röret. Upprepa det här steget 11 gånger.
- Tillsätt 500 μL buffert AW1, centrifugera i 1 min vid 13 700 x g och byt det nedre röret.
- Tillsätt 500 μL buffert AW2, centrifugera i 3 min vid 13 700 x g och byt det nedre röret.
- Centrifugera i 3 min vid 13 700 x g.
- Överför blandningen till ett nytt 1,5 ml-rör, tillsätt 200 μL buffert ATE, inkubera vid rumstemperatur i 5 min och centrifugera i 1 min vid 13 700 x g.
- Kvalitetstestning. Använd 1% sepharose gel elektrofores för att testa kvaliteten. Tillsätt 400 ng prov, 120 V, 30 minuter. Idealiskt resultat: DNA-koncentration: ≥ 10 ng/μL, DNA-renhet: A260/A280 = 1,8-2,0, grovt DNA: ≥ 300 ng.
- Förbered biblioteken med hjälp av ett 16S metagenomiskt sekvenseringskit enligt tillverkarens protokoll.
- Utför PCR. Kortfattat innehåller varje 25 μL PCR-reaktion 12,5 ng prov-DNA som ingång, 12,5 μL 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix och 5 μL av varje primer vid 1 μM.
- Utför PCR med hjälp av följande protokoll: ett initialt denatureringssteg som utförs vid 95 °C i 3 minuter följt av 25 denatureringscykler (95°C, 30 s), glödgning (55°C, 30 s) och förlängning (72°C, 30 s) och en slutlig förlängning på 5 min vid 72°C.
- Rengör PCR-produkten från reaktionsblandningen med magnetiska pärlor med hjälp av tillverkarens instruktioner.
- Upprepa steg 3.3.1 och 3.3.2.
- Kvalitetstestning. Se steg 3.2.
- Upprepa steg 3.3.3.
- Kvalitetstestning. Använd 1% sepharosgelelektrofores för att testa orenhet, en spektrofotometer för att testa renhet, en fluorometer för att testa koncentrationen och ett RNA-analyskit för att testa integriteten. Följ tillverkarens protokoll. Normalisera och slå samman biblioteken. sedan sekvens (2 x 300 bp parkopplade slutläsningsinställning) med 600 cykel V3 standardflödesceller, vilket ger cirka 100 000 parkparerade 2 x 300 basläsningar.
OBS: Primersekvenserna i full längd: 16S Amplicon polymeraskedjereaktion (PCR) Framåtprimer: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] och 16S Amplicon PCR Reverse primer: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].
4. Analysera 16S rRNA-gensekvenseringsdata
- Filtrera de råa läsningarna av varje prov baserat på sekvenseringskvalitet med programvarupaketet QIIME 2-20180220.
- Kopiera tre filer till katalogen: emp-paired-end-sequences_01
en forward.fastq.gz fil som innehåller den främre sekvensen läser,
en reverse.fastq.gz fil som innehåller den omvända sekvensen läser,
en streckkod.fastq.gz fil som innehåller tillhörande streckkod läser - Utföra
qiime-verktyg importera \
--type EMPPairedEndSequences \
--input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
- Kopiera tre filer till katalogen: emp-paired-end-sequences_01
- Ta bort primer- och adaptersekvenserna.
qiime cutadapt trim-parat \
--i-demultiplexed-sekvenser demultiplexed-seqs_02.qza \
--p-front-f GCTACGGGGGGGG \
--p-front-r GCTACGGGGGGGG \
--p-felfrekvens 0 \
--kvalitetsavskärning 25 \
--o-trimmade sekvenser trimmade-seqs_03.qza \
--utförligt - Förkorta sekvensläsningar där båda parade ändkvaliteterna är lägre än 25. Se ovan --quality-cutoff 25
- Analysera sekvenseringsdata.
- Samla sekvenser för att bilda operativa taxonomiska enheter (OTUs) med en likhetsavskärning på 97%.
qiime vsearch dereplicate-sekvenser \
--i-sekvenser trimmade-seqs_03.qza \
--o-dereplicerade-table table_04.qza \
--o-dereplicerade-sekvenser rep-seqs_04.qza
qiime vsearch kluster-funktioner-stängd referens \
--i-table table_04.qza \
--i-sekvenser rep-seqs_04.qza \
--i-reference-sekvenser 97_otus.qza \
--p-perc-identitet 0,97 \
--o-grupperad tabell-cr-97.qza \
--o-klustrade sekvenser rep-seqs-cr-97.qza \
--o-unmatched-sekvenser oöverträffad-cr-97.qza - För OTUs beräknar du det relativa förekomsterna i varje prov. Information om överflöd finns i tabell-cr-97.qza
- Samla sekvenser för att bilda operativa taxonomiska enheter (OTUs) med en likhetsavskärning på 97%.
- Använd en inbyggd bayesisk klassificerare, som syftar till RDP-träningsuppsättningen (version 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), för att sortera alla sekvenser. Kartlagd taxoninformation finns i tabell-cr-97.qza
- Inom den angivna OTU tilldelar du en klassificering som återspeglar den stora samstämmigheten i sekvenserna till OTUs. Justera sedan OTUs. Se tabell-cr-97.qza och rep-seqs-cr-97.qza
- Baserat på exempelgruppsinformationen, utför alfamångfald (inklusive Indexen Chao 1, ACE, Shannon, Simpson och Evenness) och den UniFrac-baserade huvudkoordinateanalysen (PCoA).
qiime-verktyg exportera \
--input-path tabell-cr-97.qza \
--output-path exporterad-funktion-tabell
exporterad funktionstabell
qiime mångfald alfa \
--i-table bord-cr-97.qza \
--p-metrisk observed_otus \
--o-alfa-mångfald observed_otus_vector.qza
qiime mångfald beta \
--i-table bord-cr-97.qza \
--p-metrisk braycurtis \
--o-avstånd-matris unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. Förutsäg bakteriell funktion
- För att förutsäga den relaterade representationen av bakteriernas egenskaper, använd BugBase21. OTU-tabellen för Indata för BugBase förbereds med följande kommandon.
biom konvertera -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU table" --to-json
OBS: Förutsägelsen är baserad på sex fenotypkategorier (Ward et al. opublicerade) (https://bugbase.cs.umn.edu/): Gramfärgning, syretolerans, förmåga att bilda biofilmer, mobilt elementinnehåll, patogenicitet och oxidativ stresstolerans. - Förutsäg den funktionella sammansättningen av ett metagenom av PICRUSt med användning av markörgendata och en databas som innehåller referensgenom22.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt - Analysera skillnaderna i funktioner mellan varje grupp med hjälp av STAMP23,24. Se motiveringarna för att använda programvaran.
6. Uppgifter
- Använd statistisk programvara för att beräkna betydelsen av resultaten. Uppgift om statistisk signifikans bör fastställas till P < 0,05.
- Bedöm skillnader i ålder och paritet genom studentens t-test. Utvärdera skillnader i klimakteriestatus, historia av högt blodtryck och diabetes genom chi-square testet. Bedöm skillnader i antalet äggstocksbakteriella taxa genom Mann-Whitney U-testet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Patienter
Totalt ingick 16 kvalificerade patienter i studien. Kontrollgruppen inkluderade 10 kvinnor med en diagnos av godartade livmoderns tumör (bland dem diagnostiserades 3 patienter med livmoderns myom och 7 patienter diagnostiserades med livmoderns adenomyosis). Under tiden innehöll cancergruppen 6 kvinnor med en diagnos av serös äggstockscancer (bland dem diagnostiserades 2 patienter med steg II och 2 av dem diagnostiserades med steg III). Följande egenskaper visade inga skillnader mellan patienter i kontrollgruppen och cancergruppen: ålder, klimakteriestatus, paritet, hypertonihistoria och diabeteshistoria (tabell 1).
Tabell 1: Patientstatistik Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Rikedomen och variationen av äggstocksbakteriella arter i båda grupperna
Förekomsten av bakterier med immunohistokemi färgning visades i figur 1. Mikrobernas alfamångfald analyserades som en metod för att upptäcka rikedomen och variationen hos äggstocksbakteriella arter. Antalet arter som observerades i äggstockscancervävnaderna var mindre än kontrollgruppens, utan någon signifikant skillnad. Rikedomen (representerad av Chao 1- och ACE-indexet) och mångfalden (representerad av Shannon, Simpson och Evenness-indexet) hos bakteriearterna var båda inte signifikant olika mellan cancergruppen och kontrollgruppen (figur 2).
Figur 2: 16S rRNA-gensekvensering visar skillnader mellan cancer- och kontrollgrupperna i bakteriell rikedom och mångfald. (A) Observerat artindex (P = 0,06, Mann-Whitney U-test); B) Chao 1-index (P = 0,06, Mann-Whitney U-test). C) ACE-index (P = 0,06, Mann-Whitney U-test); D) Shannonindex (P = 0,32, Mann-Whitney U-test; E. Evenness index (P = 0,48, Mann-Whitney U-test); (F) Simpson index (P = 0,46, Mann-Whitney U test). Vi fick återtryckstillstånd från tidigare utgivare. Denna siffra har ändrats från Wang et al.11. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Beskrivning av äggstocksbakterier
Djup sekvensering av V3-V4 16S rRNA genregionen utfördes på alla prover för att få en bättre förståelse för äggstocksbakterierna. Resultaten visade att Proteobacteria var den vanligaste fylumen (67,10% i kontrollgruppen och 67,20% i cancergruppen), Firmicutes var den näst vanligaste fylumen (23,20% i cancergruppen), Firmicutes var den näst vanligaste fylumen (23,20%77% i kontrollgruppen och 23,82% i cancergruppen), och den tredje vanligaste fylumen var Bacteroidetes (3,26% i kontrollgruppen och 3,41% i cancergruppen). Vid analys av arter av kontrollgruppen bestod huvudsammansättningen av Halobacteroides halobios (14,53%), följt av Gemmata obscuriglobus (11,07%) och Methyloprofundus sedimenti (10,69%). För cancergruppen var Gemmata obscuriglobus den rikaste i klustret (13,89%), följt av Halobacteroides halobius (11,99%) och Methyloprofundus sedimenti (11,12%) (Figur 3).
Figur 3: Relativt överflöd av phyla (> 1%) och av de 12 bästa arterna i äggstocksprover. A) Det relativa överflöd av phyla (> 1%) i äggstockarna hos patienterna i kontrollgruppen. B) Det relativa överflöd av phyla (> 1%) i äggstockarna hos patienter med äggstockscancer. C) De 12 vanligaste bakteriearternas relativa överflöd i kontrollpatienternas äggstockar. D) De relativa överflödet av de 12 vanligaste bakteriearterna i äggstockarna hos äggstockar hos äggstockscancerpatienter. Vi fick återtryckstillstånd från tidigare utgivare. Denna siffra har ändrats från Wang et al.11. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Olika sammansättningar av äggstocksbakterier mellan de två grupperna
En jämförelse av olika bakteriesamhällen utfördes av PCoA med permanova. Resultaten visade att bakterierna i kontrollgruppen skilde sig från bakterierna i cancergruppen, P < 0,05 (figur 4).
Figur 4: PCoA upptäcker kluster av samhällen och de relativa överflöden av Anoxynatronum sibiricum och Methanosarcina vacuolata. (A) Samhällen grupperades med hjälp av PCoA. PC1 och PC2 ritas på x- och y-axlarna. Det röda blocket indikerar ett prov i äggstockscancergruppen. Den blå cirkeln anger ett prov i kontrollgruppen. Proverna från äggstockscancergruppen separerades från andra prover i kontrollgruppen. (B) Grupper som grupperats med PCoA. PC1 och PC2 ritas på x- och y-axlarna. Det röda blocket indikerar ett prov i äggstockscancergruppen. Den blå fasta cirkeln indikerar ett prov från en patient med livmoderns myom, och den blå ihåliga cirkeln är lika med ett prov av en patient med livmoderns adenomyosis. C) Anoxynatronum sibiricums relativa överflöd (kontrollgrupp: n = 10, cancergrupp: n = 6, P = 0, 034, Mann-Whitney U-test). D) Methanosarcina vacuolatas relativa överflöd (kontrollgrupp: n = 10, cancergrupp: n = 6, P = 0,001, Mann-Whitney U-test). Vi fick återtryckstillstånd från tidigare utgivare. Denna siffra har ändrats från Wang et al.11. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Äggstocksbakteriell sammansättning i cancer- och kontrollgrupper ur olika perspektiv
En analys av äggstocksbakteriella sammansättningen utfördes från olika perspektiv för att ytterligare upptäcka skillnaderna i de identifierade äggstocksbakterierna. I tabell 2övervägdes fylum-, klass-, ordnings-, familje-, släkt- och artnivåer och statistik finns i diagrammet. I synnerhet fanns det ett samband mellan det relativa överflöd av Anoxynatronum sibiricum och scenen för tumör, och Methanosarcina vacuolata var ett specifikt tecken vid diagnos av äggstockscancer ( Tabell2).
Fenotypiskt bevarande av äggstocksbakterier i de två grupperna baserat på förutsagda funktioner
I cancergruppen ökades uttrycket av gener relaterade till potentiellt patogena och oxidativa stresstoleranta fenotyper jämfört med kontrollgruppens (Wilcoxon signerat rankningstest, P =0, 02 och P =0, 002). Ingen signifikant skillnad hittades mellan äggstockscancer och kontrollgrupper i följande aspekter: fenotyper av aeroba, anaeroba, fakultativt anaeroba, grampositiva och gramnegativa bakterier; Mobila element. biofilmsbildning av äggstocksbakterierna (figur 5). Fyrtiosex variant kegg vägar mellan bakterierna i äggstockar i cancer och kontroll grupper fastställdes. Äggstockarna i cancergruppen visade 26 ökade vägar. Bland dem var de mest relaterade vägarna transportörer. Å andra sidan visade bakterierna i äggstockscancervävnad 20 reducerade vägar. De mest relevanta funktionerna var följande: utsöndringssystem, okända funktioner och tvåkomponentsystem. Resten av vägarna visas i figur 6.
Figur 1: LPS immunohistokemiska uttryck i äggstockar. (A) Kontrollgrupp (10 x). Skalstänger, 200 μm. (B) Kontrollgrupp (40 x). Skalstänger, 50 μm. (C) Cancergrupp (10x). Skalstänger, 200 μm. (D) Cancergrupp (40 x). Skalstänger, 50 μm. Pilar pekar på LPS-färgning i äggstocksvävnaden. Vi fick återtryckstillstånd från tidigare utgivare. Denna siffra har ändrats från Wang et al.11. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Förutsagda metagenom analyseras av BugBase. Uttrycket av vissa gener i cancergruppen ökade jämfört med det i kontrollgruppen. Dessa gener var relaterade till potentiellt patogena (Wilcoxon signerad-rank test, P = 0,02) och oxidativt stresstoleranta fenotyper av äggstockarna. (Wilcoxon signerat rankningstest, P = 0,002). Vi fick återtryckstillstånd från tidigare utgivare. Denna siffra har ändrats från Wang et al.11. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: PICRUSt-analys av olika KEGG-vägar mellan cancer- och kontrollgrupperna. Vi fick återtryckstillstånd från tidigare utgivare. Denna siffra har ändrats från Wang et al.11. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Tabell 2: Rikedom (representerad av Chao 1- och ACE-indexet) och mångfalden (representerad av Shannon, Simpson och Evenness-indexet) hos bakteriearten Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Äggstockscancer har en anmärkningsvärd inverkan på kvinnors fertilitet25. De flesta äggstockscancerpatienter diagnostiseras i sena skeden, och 5-årsöverlevnaden är mindre än 30%18. Bekräftelse av bakterier i buken fasta inälvor, inklusive lever, bukspottkörtel och mjälte, har publicerats. Förekomsten av bakterier i övre kvinnliga reproduktiva systemet uppstår eftersom livmoderhalsen inte är innesluten2,3,4,5. Huruvida äggstockar, som är buken fasta inälvor, är sterila eller inte har dock ännu inte fastställts. Dessutom är huruvida bakterier i äggstockarna är relaterade till äggstockscancer också en viktig fråga.
De signifikanta skillnaderna i bakterierna som vi hittade jämfördes mellan olika grupper. Alla förfaranden som nämns ovan var strikt bakteriefria, inklusive instrument, reagenser, utrustning och driften av hela protokollet. Ännu viktigare, vi använde äggstockar från patienter med godartad livmodersjukdom som kontrollgrupp för att motverka eventuell kontaminering. I detta protokoll kan dock kontaminering inte undvikas. Eftersom cancergruppen och kontrollgruppen analyserades i samma experimentella miljö, bara genom att jämföra skillnaderna mellan dessa två grupper, kunde vi således få primära bevis om äggstockscancerns mikrobiologiska ursprung.
Resultaten av bakterier i äggstocksvävnad kan starta ett nytt fält som undersöker bakterierna som påverkar äggstockscancer. Dessutom kan den unika närvaron och sammansättningen av bakterier i cancercancer äggstocksvävnader styra cancerframkallande ämnen av äggstockscancer och de terapeutiska och prognostiska målen för bakterier. Bland de 46 KEGG-vägarna väckte funktioner relaterade till biosyntesen av vankomycingruppens antibiotika särskild uppmärksamhet. Detta kan ge ytterligare behandlingsalternativ för äggstockscancer.
Protokollet hade dock vissa begränsningar. För det första kunde proverna inte samlas in från friska människor av etiska skäl. Kontrollgruppen var äggstockar av patienter med godartade livmoderns sjukdom (inklusive livmoderns myom och adenomyosis). För det andra bör antalet prover vara större. Studiens begränsade urvalsstorlek kan hämma resultatens noggrannhet. För det tredje fanns det inga negativa eller positiva kontroller, även om cancergruppen och kontrollgruppen var under samma förhållanden. Dessutom kunde kontaminering inte undvikas. Hittills är studien av äggstocksbakterierna hos patienter med äggstockscancer fortfarande i ett tidigt skede. En storskalig studie med fler prover behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Clinical Research Award av det första anslutna sjukhuset i Xi'an Jiaotong University, Kina (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), det stora grundläggande forskningsprojektet för naturvetenskap vid Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2018JM7073, 2017ZDJC-11), det viktigaste forsknings- och utvecklingsprojekt för Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), Shaanxi Provincial Collaborative Technology Innovation Project (2 017XT-026, 2018XT-002) och det medicinska forskningsprojektet för Xi'an Social Development Guidance Plan (2017117SF/YX011-3). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om publicering eller förberedelse av manuskriptet.
Vi tackar kollegorna vid institutionen för gynekologi vid xi'an jiaotonguniversitetets första anslutna sjukhus för deras bidrag till provtagningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
References
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al.
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
