Summary
Иммуногистохимическое окрашивание и секвенирование гена рибосомальной РНК 16S (ген 16S рРНК) были выполнены с целью обнаружения и различения бактерий в раковых и нераковых тканях яичников in situ. Композиционные и функциональные различия бактерий были предсказаны с помощью BugBase и филогенетического исследования сообществ путем реконструкции ненаблюдаемых состояний (PICRUSt).
Abstract
Теория «стерильного» женского верхнего репродуктивного тракта сталкивается с растущей оппозицией из-за достижений в обнаружении бактерий. Однако, содержат ли яичники бактерии, пока не подтверждено. Здесь был проведен эксперимент по обнаружению бактерий в тканях яичников. Мы выбрали пациентов с раком яичников в группе рака и нераковых пациентов в контрольной группе. Секвенирование гена 16S рРНК использовалось для дифференциации бактерий в тканях яичников от онкологической и контрольной групп. Кроме того, мы предсказали функциональный состав идентифицированных бактерий с помощью BugBase и PICRUSt. Этот метод также может быть использован в других внутренних органах и тканях, поскольку в последние годы было доказано, что многие органы содержат бактерии. Присутствие бактерий во внутренних путях и тканях может помочь ученым оценить раковые и нормальные ткани и может помочь в лечении рака.
Introduction
В последнее время публикуется все большее количество статей, доказывающих существование бактерий в брюшных твердых внутренних путях, таких как почки, селезенка, печень,яичник 1,2. Geller et al. обнаружили бактерии в опухолях поджелудочной железы, и эти бактерии были устойчивы к гемцитабину, химиотерапевтическому препарату2. S. Manfredo Vieira et al. пришли к выводу, что Enterococcus gallinarum переносится в лимфатические узлы, печень и селезенку, и он может управлять аутоиммунитетом3.
Поскольку шейка матки играет роль защитника, бактерии в верхнем женском репродуктивном тракте, который содержит матку, фаллопиевы трубы и яичники, были минимально исследованы. Тем не менее, в последние годы были созданы некоторые новые теории. Бактерии могут иметь доступ к полости матки во время менструального цикла из-за изменений в муцинах4,5. Кроме того, Zervomanolakis et al. подтвердили, что матка вместе с фаллопиевыми трубами представляет собой перистальтический насос, контролируемый эндокринной системой яичников, и это расположение позволяет бактериям проникать в эндометрий, фаллопиевы трубы и яичники6.
Верхний репродуктивный тракт больше не является загадкой благодаря развитию методов обнаружения бактерий. Verstraelen et al. использовали метод штрих-кодированного парного секвенирования для обнаружения матчных бактерий путем нацеливания на гипервариабельную область V1-2 гена 16S РНК7. Fang et al. использовали штрих-кодирование секвенирования у пациенток с полипами эндометрия и выявили наличие разнообразных внутриматочных бактерий8. Кроме того, используя ген РНК 16S, Miles et al. и Chen et al. обнаружили бактерии в половой системе женщин, перенесших сальпингоофорэктомию и гистерэктомию соответственно5,9.
Бактерии в опухолевых тканях получили все большее внимание в последние годы. Banerjee et al. обнаружили, что сигнатура микробиома различается между пациентами с раком яичников и контрольной10. Noxynatronum sibiricum был связан со стадией опухоли, а Methanosarcina vacuolata может быть использована для диагностики рака яичников11. В дополнение краку яичников, было доказано, что другие виды рака, такие как рак желудка, легких, предстательной железы, молочной железы, шейки матки и эндометрия, связаны с бактериями12,13,14, 15,16,17,18. Poore et al. предложили новый класс онкологической диагностики на основе микробов, предвидя скрининг рака на ранней стадии19. В этом протоколе мы исследовали различия между раковыми и нормальными тканями яичников, сравнивая состав и функцию бактерий в этих двух тканях.
Иммуногистохимическое окрашивание и секвенирование гена 16S рРНК были выполнены для подтверждения присутствия бактерий в яичниках. Изучены различия и прогнозируемые функции бактерий яичников в раковых и нераковых тканях яичников. Результаты показали существование бактерий в тканях яичников. Anoxynatronum sibiricum и Methanosarcina vacuolata были связаны со стадией и диагнозом рака яичников соответственно. Сравнивалось сорок шесть значительно отличавшихся путей KEGG, которые присутствовали в обеих группах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено Комитетом по медицинской институциональной этике Первой аффилированной больницы Сианьского университета Цзяотун (No. XJTUIAF2018LSK-139). Информированное согласие было получено от всех зарегистрированных пациентов.
1. Критерии вхождения в онкологические группы и контрольную группу
- В группу рака входят пациенты, у которых в первую очередь диагностирован рак яичников, а после лапаротомии доказано, что у них серозный рак яичников патологическими находками.
- Для контрольной группы впишите пациенток, у которых в первую очередь диагностирована миома матки или аденомиоз матки, без какого-либо состояния яичников, и которые перенесли гистерэктомию и сальпингоофорэктомию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий стандарт не является определенным. Также могут быть зачислены пациентки с заболеваниями, не затрагивающими яичники, которые подвергаются гистерэктомии и сальпингоофорэктомии. - Исключить пациентов с одним или несколькими из следующих критериев:
Беременные или кормящей грудью женщины.
Прием антибиотиков за 2 месяца до операции.
Наличие лихорадки или повышенных воспалительных маркеров.
Наличие воспаления любого рода.
Пройдя неоадъювантную химиотерапию.
2. Соберите образцы
- Во время операции поместите резецированные яичники в стерильную трубку и поместите трубку в жидкий азот для транспортировки. Избегайте прикосновений к чему-либо еще на протяжении всей процедуры.
- Разделите яичники на образцы тканей толщиной около 1 см с помощью пары новых стерильных пинцетов под ламинарной проточной тумбами. После разделения сохраняют образцы при -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры сбора образцов являются асептическими, включая отделение яичников.
3. Секвенирует ген 16S рРНК
- Экстракт ДНК.
- Добавьте 1,2 мл ингибированного EX-буфера в 2 мл центрифужную трубку. Затем добавьте в пробирку 180-220 мг образцов. Дайте образцу полностью перемешаться (водяная баня 70 °C в течение 5 мин, а затем вихрь в течение 15 с).
- Центрифугировать трубку в течение 1 мин при 600 х г.
- Поместите 550 мкл супернатанта в новую трубку 1,5 мл и центрифугу на 1 мин при 600 х г.
- Перенесите 400 мкл супернатанта с 30 мкл протеиназы К в другую пробирку с 1,5 мл.
- Добавьте 400 мкл буферного AL и используйте вихревой смеситель в течение 15 с.
- Инкубировать при 70 °C в течение 10 мин.
- Добавьте 400 мкл 96-100% спирта. Используйте вихревой смеситель в течение 15 с.
- Переложить 600 мкл смеси в абсорбционную колонну и центрифугу в течение 1 мин при 13700 г. Поменять нижнюю трубку. Повторите этот шаг 11 раз.
- Добавьте 500 мкл буфера AW1, центрифугу в течение 1 мин при 13 700 х г и замените нижнюю трубку.
- Добавьте 500 мкл буфера AW2, центрифугу в течение 3 мин при 13 700 х г и замените нижнюю трубку.
- Центрифуга в течение 3 мин при 13 700 х г.
- Переложить смесь в новую пробирку 1,5 мл, добавить 200 мкл буферной АТЕ, инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин и центрифугу в течение 1 мин при 13 700 х г.
- Тестирование качества. Используйте 1% электрофорез сефарозного геля для проверки качества. Добавьте 400 нг образца, 120 В, 30 мин. Идеальный результат: концентрация ДНК: ≥ 10 нг/мкл, чистота ДНК: A260/A280 = 1,8-2,0, валовая ДНК: ≥ 300 нг.
- Подготовьте библиотеки с помощью комплекта метагеномного секвенирования 16S в соответствии с протоколом производителя.
- Выполните ПЦР. Вкратце, каждая 25-мкл ПЦР-реакция содержит 12,5 нг образца ДНК в качестве входного сигнала, 12,5 мкл 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix и 5 мкл каждого праймера при 1 мкМ.
- Проводят ПЦР по следующему протоколу: начальная ступень денатурации, выполняемая при 95°С в течение 3 мин, за которой следуют 25 циклов денатурации (95°С, 30 с), отжиг (55°С, 30 с) и удлинение (72°С, 30 с), и окончательное удлинение 5 мин при 72°С.
- Очистите продукт ПЦР от реакционной смеси с магнитными шариками, следуя инструкциям производителя.
- Повторите шаги 3.3.1 и 3.3.2.
- Тестирование качества. Пожалуйста, обратитесь к шагу 3.2.
- Повторите шаг 3.3.3.
- Тестирование качества. Используйте 1% электрофорез сефарозного геля для проверки примесей, спектрофотометр для проверки чистоты, флуорометр для проверки концентрации и набор для анализа РНК для проверки целостности. Следуйте протоколу производителя. Нормализовать и объединить библиотеки; затем последовательность (2 x 300 bp парная настройка чтения) с использованием стандартных проточных ячеек V3 с циклом 600 циклов, производя приблизительно 100 000 парных 2 x 300 базовых считывания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полноразмерные последовательности праймеров: 16S Amplicon полимеразная цепная реакция (PCR) Форвардный праймер: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] и 16S Amplicon PCR Обратный праймер: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].
4. Анализ данных секвенирования генов 16S рРНК
- Фильтрация необработанных считывания каждого образца на основе качества последовательности с помощью программного пакета QIIME 2-20180220.
- Скопируйте в каталог три файла: emp-paired-end-sequences_01
один файл forward.fastq.gz, содержащий последовательность пересылки,
один файл reverse.fastq.gz, содержащий обратную последовательность, считывает,
Один файл barcodes.fastq.gz содержащий связанный штрихкод, считывает - Исполнять
Импорт инструментов qiime \
--type EMPPairedEndSequences \
--input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
- Скопируйте в каталог три файла: emp-paired-end-sequences_01
- Удалите последовательности праймера и адаптера.
qiime cutadapt трим-парный \
--i-демультиплексированные-последовательности демультиплексированные-seqs_02.qza \
--p-фронт-ф GCTACGGGGGG \
--p-фронт-р GCTACGGGGGG \
--p-частота ошибок 0 \
--качество-отсека 25\
--o-обрезанные-последовательности обрезанные-seqs_03.qza \
--многословный - Укороченная последовательность считывает, в которой оба парных качества ниже 25. См. выше --качество-отсечение 25
- Анализ данных виртуализации.
- Соберите последовательности для формирования операционных таксономических единиц (OTA) с отсечкой подобия на уровне 97%.
qiime vsearch dereplicate-sequences \
--i-последовательности обрезаны-seqs_03.qza \
--o-dereplicated-table table_04.qza \
--o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
--i-table table_04.qza \
--i-последовательности rep-seqs_04.qza \
--i-reference-последовательности 97_otus.qza \
--p-perc-идентификация 0,97 \
--o-clustered-table-cr-97.qza \
--o-кластеризованные последовательности rep-seqs-cr-97.qza \
--o-unmatched-sequences unmatched-cr-97.qza - Для ОТУ рассчитайте относительное изобилие в каждой выборке. Информация об изобилии приведена в таблице cr-97.qza
- Соберите последовательности для формирования операционных таксономических единиц (OTA) с отсечкой подобия на уровне 97%.
- Используйте родной байесовский классификатор, который предназначен для обучающего набора RDP (версия 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), чтобы отсортировать все последовательности. Информация о сопоставляемом таксоне приведена в таблице cr-97.qza
- В рамках данного OTU назначьте классификацию, которая отражает основную согласованность последовательностей с OTUs. Затем выровняйте ОТУ. См. таблицу-cr-97.qza и rep-seqs-cr-97.qza
- На основе информации о группе выборки выполните альфа-разнообразие (включая индексы Chao 1, ACE, Shannon, Simpson и Evenness) и анализ главных координат на основе UniFrac (PCoA).
Экспорт инструментов qiime \
--input-path table-cr-97.qza \
--output-path exported-feature-table
экспортированная таблица объектов
разнообразие цииме альфа \
--i-table-cr-97.qza \
--p-метрические observed_otus \
--o-альфа-разнообразие observed_otus_vector.qza
qiime разнообразие бета \
--i-table-cr-97.qza \
--p-метрический braycurtis \
--o-расстояние-матрица unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. Прогнозирование бактериальной функции
- Чтобы предсказать связанное представление характеристик бактерий, используйте BugBase21. Входная таблица OTU для BugBase подготавливается с помощью следующих команд.
biom перевести -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU table" --to-json
ПРИМЕЧАНИЕ: Прогноз основан на шести категориях фенотипов (Ward et al. unpublished) (https://bugbase.cs.umn.edu/): окрашивание по Граму, толерантность к кислороду, способность образовывать биопленки, содержание подвижных элементов, патогенность и устойчивость к окислительной стрессоустойчивости. - Прогнозирование функционального состава метагенома с помощью PICRUSt с использованием данных маркерных генов и базы данных, содержащей эталонные геномы22.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. Л1.txt - Проанализируйте различия в функциях между каждой группой с помощью STAMP23,24. Пожалуйста, обратитесь к ссылкам на работу с программным обеспечением.
6. Данные
- Используйте статистическое программное обеспечение для расчета значимости результатов. Показатель статистической значимости должен быть установлен как P < 0,05.
- Оцените различия в возрасте и паритете с помощью T-теста Студента. Оцените различия в климактерическом статусе, истории гипертонии и диабета с помощью теста хи-квадрат. Оцените различия в количестве бактериальных таксонов яичников с помощью теста Манна-Уитни U.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пациентов
В общей сложности в исследование было включено 16 квалифицированных пациентов. В контрольную группу вошли 10 женщин с диагнозом доброкачественная опухоль матки (среди них у 3 пациенток была диагностирована миома матки, а у 7 пациенток был диагностирован аденомиоз матки). Между тем, в онкологическую группу входили 6 женщин с диагнозом серозный рак яичников (среди них у 2 пациенток была диагностирована II стадия, а у 2 из них была диагностирована III стадия). Следующие характеристики не показали различий между пациентами в контрольной группе и группе рака: возраст, менопаузальный статус, паритет, история гипертонии и история диабета(таблица 1).
Таблица 1: Статистика пациентов Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Богатство и разнообразие видов бактерий яичников в обеих группах
Присутствие бактерий с помощью иммуногистохимического окрашивания было показано на рисунке 1. Альфа-разнообразие микробов было проанализировано как метод обнаружения богатства и разнообразия видов бактерий яичников. Количество видов, наблюдаемых в тканях рака яичников, было меньше, чем у контрольной группы, без существенной разницы. Богатство (представленное индексом Chao 1 и ACE) и разнообразие (представленное индексом Шеннона, Симпсона и Эвеннесса) видов бактерий существенно не отличались между группой рака и контрольной группой(рисунок 2).
Рисунок 2:Секвенирование гена 16S рРНК показывает различия между онкологической и контрольной группами в бактериальном богатстве и разнообразии. (A) Наблюдаемый видовой индекс(P = 0,06, тест Манна-Уитни U); B) индекс Чао 1(P = 0,06, тест Манна-Уитни U); (C) индекс ACE(P = 0,06, тест Манна-Уитни U); D) индекс Шеннона(P = 0,32, тест Манна-Уитни U; E. Индекс ровности(P = 0,48, тест Манна-Уитни U); (F) Индекс Симпсона(P = 0,46, тест Манна-Уитни U). Мы получили разрешение на перепечатку от предыдущих издателей. Эта цифра была изменена по сравнению с Wang et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Описание бактерий яичников
Глубокое секвенирование области гена 16S рРНК V3-V4 было выполнено на всех образцах для лучшего понимания бактерий яичников. Результаты показали, что протеобактерии были наиболее распространенным типом (67,10% в контрольной группе и 67,20% в группе рака), Firmicutes был вторым наиболее распространенным типом (23,77% в контрольной группе и 23,82% в группе рака), а третьим наиболее распространенным типом был Bacteroidetes (3,26% в контрольной группе и 3,41% в группе рака). При анализе видов контрольной группы основной состав составляли Halobacteroides halobios (14,53%), за которыми следовали Gemmata obscuriglobus (11,07%) и Methyloprofundus sedimenti (10,69%). Для группы рака Gemmata obscuriglobus была самой богатой в кластере (13,89%), за которой следовали Halobacteroides halobius (11,99%) и Methyloprofundus sedimenti (11,12%)(рисунок 3).
Рисунок 3:Относительное изобилие типа (> 1%) и 12 ведущих видов в образцах яичников. (А) Относительное обилие типа (> 1%) в яичниках пациенток контрольной группы. (B) Относительное обилие типа (> 1%) в яичниках пациенток с раком яичников. (C) Относительное изобилие 12 наиболее распространенных видов бактерий в яичниках контрольных пациентов. (D) Относительное изобилие 12 наиболее распространенных видов бактерий в яичниках пациентов с раком яичников. Мы получили разрешение на перепечатку от предыдущих издателей. Эта цифра была изменена по сравнению с Wang et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Различные составы бактерий яичников между двумя группами
Сравнение различных бактериальных сообществ проводилось PCoA с использованием PERMANOVA. Результаты показали, что бактерии в контрольной группе отличались от бактерий в группе рака, P < 0,05(рисунок 4).
Рисунок 4:PCoA обнаруживает кластеры сообществ и относительное изобилие Anoxynatronum sibiricum и Methanosarcina vacuolata. (A) Сообщества были сгруппированы с использованием PCoA. PC1 и PC2 нанесены на оси x и y. Красный блок указывает на образец в группе рака яичников. Синий кружок указывает на образец в контрольной группе. Образцы из группы рака яичников были отделены от других образцов в контрольной группе. (B) Сообщества, сгруппированные с использованием PCoA. PC1 и PC2 нанесены на оси x и y. Красный блок указывает на образец в группе рака яичников. Синий сплошной круг указывает на образец от пациентки с миомой матки, а синий полый круг равен образцу пациентки с аденомиозом матки. (C) Относительное содержание Anoxynatronum sibiricum (контрольная группа: n = 10, группа рака: n = 6, P = 0,034, тест Манна-Уитни U). (D) Относительное содержание Methanosarcina vacuolata (контрольная группа: n = 10, группа рака: n = 6, P = 0,001, тест Манна-Уитни U). Мы получили разрешение на перепечатку от предыдущих издателей. Эта цифра была изменена по сравнению с Wang et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Бактериальный состав яичников в онкологических и контрольных группах с разных точек зрения
Анализ бактериального состава яичников проводили с разных точек зрения для дальнейшего выявления различий в выявленных бактериях яичников. В таблице 2были рассмотрены уровни типа, класса, порядка, семейства, рода и вида, а также приведены статистические данные на диаграмме. В частности, наблюдалась связь между относительным обилием Anoxynatronum sibiricum и стадией опухоли, а Methanosarcina vacuolata была специфическим признаком при диагностике рака яичников(таблица 2).
Фенотипическое сохранение бактерий яичников в двух группах на основе предсказания функций
В группе рака экспрессия генов, связанных с потенциально патогенными и окислительными стрессоустойчивыми фенотипами, была повышена по сравнению с контрольной группой (тест знакового ранга Уилкоксона, P = 0,02 и P = 0,002). Не было обнаружено существенных различий между раком яичников и контрольной группой в следующих аспектах: фенотипы аэробных, анаэробных, факультативно анаэробных, грамположительных и грамотрицательных бактерий; мобильные элементы; и образование биопленки бактерий яичников(рисунок 5). Было определено сорок шесть вариантов путей KEGG между бактериями в яичниках в онкологической и контрольной группах. Яичники в группе рака показали 26 увеличенных путей. Среди них наиболее тесно связанными путями были транспортеры. С другой стороны, бактерии в ткани рака яичников показали 20 сниженных путей. Наиболее значимыми функциями были: система секреции, неизвестные функции и двухкомпонентная система. Остальные пути показаны на рисунке 6.
Рисунок 1:Иммуногистохимическая экспрессия ЛПС в яичниках. (А) Контрольная группа (10 х). Шкала стержней, 200 мкм. (B) Контрольная группа (40 x). Шкала стержней, 50 мкм. (C) Группа рака (10x). Шкала стержней, 200 мкм. (D) Группа рака (40 х). Шкала стержней, 50 мкм. Стрелки указывают на окрашивание ЛПС в ткани яичников. Мы получили разрешение на перепечатку от предыдущих издателей. Эта цифра была изменена по сравнению с Wang et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Прогнозируемые метагеномы, проанализированные BugBase. Экспрессия некоторых генов в группе рака была повышена по сравнению с таковой в контрольной группе. Эти гены были связаны с потенциально патогенными (тест подписного ранга Уилкоксона, P = 0,02) и окислительно-стрессоустойчивыми фенотипами яичников. (Тест на знаковый ранг Уилкоксона, P = 0,002). Мы получили разрешение на перепечатку от предыдущих издателей. Эта цифра была изменена по сравнению с Wang et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:PICRUSt анализ различных путей KEGG между раком и контрольной группами. Мы получили разрешение на перепечатку от предыдущих издателей. Эта цифра была изменена по сравнению с Wang et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 2: Богатство (представленное индексом Chao 1 и ACE) и разнообразие (представленное индексом Шеннона, Симпсона и Ровности) видов бактерий Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рак яичников оказывает заметное влияние на фертильность женщин25. Большинство пациенток с раком яичников диагностируются на поздних стадиях, а 5-летняя выживаемость составляет менее 30%18. Опубликовано подтверждение бактерий в брюшных твердых внутренностей, включая печень, поджелудочную железу и селезенку. Существование бактерий в верхних женских репродуктивных путях происходит потому, что шейка матки не заключенав 2,3,4,5. Однако стерильны ли яичники, которые являются брюшными твердыми внутренностей, или нет, пока не определено. Кроме того, вопрос о том, связаны ли бактерии в яичниках с раком яичников, также является важным вопросом.
Значительные различия в бактериях, которые мы обнаружили, сравнивались между различными группами. Все процедуры, упомянутые выше, были строго без микробов, включая инструменты, реагенты, оборудование и работу всего протокола. Что еще более важно, мы использовали яичники пациенток с доброкачественными заболеваниями матки в качестве контрольной группы для противодействия возможному загрязнению. Однако в этом протоколе загрязнения не избежать. Таким образом, поскольку группа рака и контрольная группа были проанализированы в одной и той же экспериментальной среде, просто сравнивая различия между этими двумя группами, мы могли получить первичные доказательства о микробиологическом происхождении рака яичников.
Обнаружение бактерий в ткани яичников может начать новую область, исследующую бактерии, влияющие на рак яичников. Кроме того, уникальное присутствие и состав бактерий в раковых тканях яичников может направлять канцерогенез рака яичников, а также терапевтические и прогностические мишени бактерий. Среди 46 путей KEGG особое внимание привлекли функции, связанные с биосинтезом антибиотиков ванкомициновой группы. Это может обеспечить дальнейшие варианты лечения рака яичников.
Однако протокол имел некоторые ограничения. Во-первых, образцы не могли быть собраны у здоровых людей по этическим соображениям. В контрольную группу входелили яичники пациенток с доброкачественными заболеваниями матки (включая миому матки и аденомиоз). Во-вторых, количество образцов должно быть больше. Ограниченный размер выборки исследования может препятствовать точности результатов. В-третьих, хотя группа рака и контрольная группа находились в одинаковых условиях, не было никакого отрицательного или положительного контроля. Кроме того, не удалось избежать загрязнения. На сегодняшний день изучение бактерий яичников у пациенток с раком яичников все еще находится на ранней стадии. Необходимо более масштабное исследование с большим количеством образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана премией за клинические исследования Первой аффилированной больницы Сианьского университета Цзяотун, Китай (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), Крупным проектом фундаментальных исследований естественных наук Департамента науки и техники провинции Шэньси (2018JM7073, 2017ZDJC-11), Ключевым проектом исследований и разработок Департамента науки и техники провинции Шэньси (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), Проектом совместных технологических инноваций провинции Шэньси (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), Проектом совместных технологических инноваций провинции Шэньси (2 017XT-026, 2018XT-002) и Проект медицинских исследований Плана руководства по социальному развитию Сианя (2017117SF/YX011-3). Спонсоры не имели никакого значения в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Мы благодарим коллег из отделения гинекологии Первой аффилированной больницы Сианьского университета Цзяотун за их вклад в сбор образцов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
References
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al.
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
