Summary
Immunohistochemistry farvning og 16S ribosomale RNA gen (16S rRNA gen) sekventering blev udført for at opdage og skelne bakterier i kræft og ikkecancerous ovarievæv in situ. De kompositoriske og funktionelle forskelle i bakterierne blev forudsagt ved hjælp af BugBase og fylogenetisk undersøgelse af Fællesskaber ved genopbygning af ubemærket stater (PICRUSt).
Abstract
Teorien om en "steril" kvindelige øvre reproduktive tarmkanalen har mødt stigende modstand på grund af fremskridt i bakteriel påvisning. Men om æggestokkene indeholder bakterier er endnu ikke bekræftet. Heri blev der indført et eksperiment til påvisning af bakterier i ovarievæv. Vi valgte kræftpatienter i kræftgruppen og ikke-kræftpatienter i kontrolgruppen. 16S rRNA gen sekventering blev brugt til at skelne bakterier i æggestokkene væv fra kræft og kontrol grupper. Desuden forudsagde vi den funktionelle sammensætning af de identificerede bakterier ved hjælp af BugBase og PICRUSt. Denne metode kan også anvendes i andre indvolde og væv, da mange organer har vist sig at huse bakterier i de seneste år. Tilstedeværelsen af bakterier i indvolde og væv kan hjælpe forskere evaluere kræft og normale væv og kan være støtte i behandlingen af kræft.
Introduction
For nylig er et stigende antal artikler blevet offentliggjort, der beviser eksistensen af bakterier i abdominal fast indvolde, såsom nyre, milt, lever og æggestokken1,2. Geller et al. fundet bakterier i bugspytkirtel tumorer, og disse bakterier var resistente over for gemcitabin, en kemoterapeutisk stof2. S. Manfredo Vieira et al. konkluderede, at Enterococcus gallinarum var bærbar til lymfeknuder, lever og milt, og det kunne køre autoimmunitet3.
Da livmoderhalsen spiller en rolle som forsvarer, bakterier i den øvre kvindelige reproduktive tarmkanalen, som indeholder livmoderen, æggelederne, og æggestokkene, er blevet minimalt undersøgt. Der er dog blevet etableret nogle nye teorier i de senere år. Bakterier kan have adgang til livmoderhulen under menstruationscyklussen på grund af ændringer i muciner4,5. Derudover bekræftede Zervomanolakis et al. at livmoderen sammen med æggelederne er en peristaltisk pumpe kontrolleret af æggestokkenes endokrine system, og dette arrangement gør det muligt for bakterier at komme ind i endometrium, æggelederne og æggestokkene6.
Den øvre reproduktive tarmkanalen er ikke længere et mysterium længere takket være udviklingen af bakterielle detektionsmetoder. Verstraelen et al. brugte en stregkodet parret ende sekventering metode til at opdage livmoderbakterier ved at målrette på V1-2 hypervariable region af 16S RNAgenet 7. Fang et al. ansat stregkodet sekventering hos patienter med endometrie polypper og afslørede tilstedeværelsen af forskellige intrauterin bakterier8. Derudover, ved hjælp af 16S RNA genet, Miles et al. og Chen et al. fundet bakterier i kønsorganerne hos kvinder, der havde gennemgået salpingo-oophorectomy og hysterektomi, henholdsvis5,9.
Bakterier i tumorvæv har fået stigende opmærksomhed i de senere år. Banerjee et al. opdagede, at mikrobiom signatur afveg mellem kræft i æggestokkene patienter og kontrollerer10. Ennoxynatronum sibiricum var forbundet med tumor fase, og Methanosarcina vacuolata kan bruges til at diagnosticere kræft i æggestokkene11. Ud over kræft i æggestokkene, andre kræftformer, såsom mave, lunge, prostata, bryst, livmoderhalsen, og endometrium, har vist sig at være forbundet med bakterier12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. foreslog en ny klasse af mikrobiel-baseret onkologi diagnostik, forudser tidlig fase kræftscreening19. I denne protokol undersøgte vi forskellene mellem kræft og normalt ovarievæv ved at sammenligne sammensætningen og funktionen af bakterier i disse to væv.
Immunohistochemistry farvning og 16S rRNA gen sekventering blev udført for at bekræfte tilstedeværelsen af bakterier i æggestokkene. Forskellene og de forudsagte funktioner af æggestokkene bakterier i kræft og noncancerous ovarievæv blev undersøgt. Resultaterne viste eksistensen af bakterier i æggestokkene væv. Anoxynatronum sibiricum og Methanosarcina vacuolata var relateret til scenen og diagnosen af kræft i æggestokkene, henholdsvis. 46 signifikant forskellige KEGG-veje, der var til stede i begge grupper, blev sammenlignet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Medical Institutional Ethics Committee på det første tilknyttede hospital i Xi'an Jiaotong University (nr. XJTUIAF2018LSK-139). Der blev indhentet informeret samtykke fra alle tilmeldte patienter.
1. Kriterier for indtræden i kræftgruppen og kontrolgruppen
- For kræftgruppen, tilmelde patienter, der primært diagnosticeres med kræft i æggestokkene, og efter laparotomi, de har vist sig at have serøs kræft i æggestokkene ved patologiske fund.
- For kontrolgruppen, tilmelde patienter, der primært diagnosticeres med livmoder myom eller livmoder adenomyose, uden at præsentere nogen ovarie tilstand, og som har gennemgået hysterektomi og salpingo-oophorectomy.
BEMÆRK: Denne standard er ikke bestemt. Patienter med sygdomme, der ikke påvirker æggestokkene, der gennemgår hysterektomi og salpingo-oophorectomy kan også indskrives. - Ekskluder patienter med et eller flere af følgende kriterier:
Gravide eller ammende kvinder.
Tager antibiotika 2 måneder før operationen.
Har feber eller forhøjede inflammatoriske markører.
At have betændelse af enhver art.
Efter at have gennemgået neoadjuvant kemoterapi.
2. Saml prøver
- Under operationen skal du placere de resected æggestokke i et sterilt rør og placere røret i flydende nitrogen til transport. Undgå at røre ved noget andet under hele proceduren.
- Adskil æggestokkene i ca. 1 cm tykke vævsprøver med et par nye sterile pincet under et laminar flow kabinet. Efter adskillelsen opbevares prøverne ved -80 °C.
BEMÆRK: Alle procedurer for indsamling af prøver er aseptiske, herunder adskillelse af æggestokkene.
3. Sekvens 16S rRNA genet
- Udtræk DNA.
- Der tilsættes 1,2 mL hæmme EX-buffer i et 2 mL centrifugerør. Derefter tilsættes 180-220 mg prøver i røret. Lad prøven blandes helt (70 °C vandbad i 5 min og derefter hvirvle i 15 s).
- Centrifuge røret i 1 min ved 600 x g.
- 550 μL af supernatanten i et nyt 1,5 mL rør og centrifuge i 1 min ved 600 x g.
- 400 μL af supernatanten med 30 μL proteinase K overføres til et andet 1,5 mL rør.
- Tilsæt 400 μL buffer AL og brug en vortex mixer til 15 s.
- Inkuberes ved 70 °C i 10 min.
- Tilsættes 400 μL på 96-100% alkohol. Brug en vortex mixer til 15 s.
- Overfør 600 μL blanding til en absorptionskolonne og centrifuge i 1 min ved 13700 g. Ombyt det nederste rør. Gentag dette trin 11 gange.
- Der tilsættes 500 μL buffer AW1, centrifuge i 1 min ved 13.700 x g, og det nederste rør ændres.
- Der tilsættes 500 μL buffer AW2, centrifuge i 3 min ved 13.700 x g, og det nederste rør ændres.
- Centrifuge i 3 min ved 13.700 x g.
- Blandingen overføres til et nyt 1,5 mL rør, tilsæt 200 μL buffer ATE, inkuberes ved stuetemperatur i 5 min og centrifuge i 1 min ved 13.700 x g.
- Kvalitetstest. Brug 1% Sepharose gel elektroforese til at teste kvaliteten. Tilsæt 400 ng prøve, 120 V, 30 minutter. Ideelt resultat: DNA-koncentration: ≥ 10 ng/μL, DNA-renhed: A260/A280 = 1,8-2,0, brutto-DNA: ≥ 300 ng.
- Forbered bibliotekerne ved hjælp af et 16S metagenomic sekventering kit i henhold til producentens protokol.
- Udfør PCR. Kort fortalt indeholder hver 25 μL PCR-reaktion 12,5 ng prøve-DNA som input, 12,5 μL på 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix og 5 μL af hver primer ved 1 μM.
- Pcr udføres ved hjælp af følgende protokol: et indledende denatureringstrin udført ved 95 °C i 3 min efterfulgt af 25 cyklusser af denaturering (95 °C, 30 s), udglødning (55 °C, 30 s) og forlængelse (72 °C, 30 s) og en endelig forlængelse på 5 min ved 72 °C.
- Ryd op i PCR-produktet fra reaktionsblandingen med magnetiske perler ved hjælp af producentens anvisninger.
- 3.3.1 og 3.3.2.
- Kvalitetstest. Se trin 3.2.
- Gentag trin 3.3.3.
- Kvalitetstest. Brug 1% Sepharose gel elektroforese til at teste urenhed, et spektrofotometer til at teste renhed, et fluorometer til at teste koncentrationen, og en RNA assay kit til at teste integritet. Følg producentens protokol. Normaliser og spool bibliotekerne; derefter sekvens (2 x 300 bp paired-end læse indstilling) ved hjælp af 600 cyklus V3 standard flow celler, der producerer ca 100.000 parret-end 2 x 300 base læser.
BEMÆRK: Primersekvenserne i fuld længde: 16S Amplicon polymerase kædereaktion (PCR) Fremad primer: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGNGGCWGCAG] og 16S Amplicon PCR Reverse primer: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].
4. Analyser data om 16S rRNA-gensekvensering
- Filtrer de rå læser af hver prøve baseret på sekventering kvalitet med softwarepakken QIIME 2-20180220.
- Kopier tre filer til mappen: emp-paired-end-sequences_01
en forward.fastq.gz fil, der indeholder den fremadrettede sekvens læser,
en reverse.fastq.gz fil, der indeholder den omvendte sekvens læser,
én stregkoder.fastq.gz fil, der indeholder den tilknyttede stregkode, læser - Udføre
qiime værktøjer import \
--type EMPPairedEndSequences \
--input-sti emp-parret-end-sequences_01 \--output-sti emp-paired-end-sequences_02.qza
- Kopier tre filer til mappen: emp-paired-end-sequences_01
- Fjern primer- og adaptersekvenserne.
qiime cutadapt trim-parret \
--i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
--p-front-f GCTACGGGGGG \
--p-front-r GCTACGGGGGG \
--p-fejl-hastighed 0 \
--kvalitet-cutoff 25 \
--o-trimmet-sekvenser trimmet-seqs_03.qza \
--verbose - Forkort sekvensen læser, hvor begge parrede-end kvaliteter er lavere end 25. Se ovenfor --kvalitet-cutoff 25
- Analysere sekventeringsdataene.
- Saml sekvenser til at danne operationelle taksonomiske enheder (OTUs) med en lighed cutoff på 97%.
qiime vsearch dereplicate-sequences \
--i-sekvenser trimmet-seqs_03.qza \
--o-dereplicated-table table_04.qza \
--o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
--i-table table_04.qza \
--i-sekvenser rep-seqs_04.qza \
--i-reference-sekvenser 97_otus.qza \
--p-perc-identitet 0,97 \
--o-clustered-table table-cr-97.qza \
--o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
--o-uovertruffen-sekvenser uovertruffen-cr-97.qza - For otus skal du beregne den relative overflod i hver prøve. Overflod oplysninger er i table-cr-97.qza
- Saml sekvenser til at danne operationelle taksonomiske enheder (OTUs) med en lighed cutoff på 97%.
- Ansæt en indfødt bayesisk klassificering, som sigter mod RDP-træningssættet (version 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), til at sortere alle sekvenserne. Tilknyttede taxon-oplysninger findes i tabel-cr-97.qza
- Inden for den givne OTU skal du tildele en klassifikation, der afspejler den væsentligste sammenhæng i sekvenserne, til OTU'er. Juster derefter otau'erne. Se tabel-cr-97.qza og rep-seqs-cr-97.qza
- Baseret på stikprøvegruppens oplysninger udfører alfadiversitet (herunder Chao 1-, ACE-, Shannon-, Simpson- og Evenness-indekserne) og de UniFrac-baserede hovedkoordinateranalyse (PCoA).
qiime værktøjer eksport \
--input-path table-cr-97.qza \
--output-sti eksporteret-feature-table
eksporteret funktionstabel
qiime mangfoldighed alfa \
--i-table table-cr-97.qza \
--p-metriske observed_otus \
--o-alpha-mangfoldighed observed_otus_vector.qza
qiime mangfoldighed beta \
--i-table table-cr-97.qza \
--p-metriske braycurtis \
--o-distance-matrix unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. Forudsige bakteriefunktion
- For at forudsige den relaterede repræsentation af bakteriernes egenskaber skal du bruge BugBase21. Den indtastede OTU-tabel til BugBase er forberedt ved hjælp af følgende kommandoer.
biom konvertere -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU table" --to-json
BEMÆRK: Forudsigelsen er baseret på seks fænotype kategorier (Ward et al. ikke-offentliggjort) (https://bugbase.cs.umn.edu/): Gram farvning, ilt tolerance, evne til at danne biofilm, mobile element indhold, patogenitet, og oxidativ stress tolerance. - Forudsige den funktionelle sammensætning af et metagenom af PICRUSt med brug af markør gendata og en database, der indeholder referencegenomer22.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1-o metagenome_predictions. L1.txt - Analysere forskellene i funktioner mellem hver gruppe ved hjælp af STAMP23,24. Der henvises til citaterne for at betjene softwaren.
6. Data
- Brug statistisk software til at beregne betydningen af resultaterne. Angivelsen af statistisk signifikans bør fastsættes til P < 0,05.
- Vurder forskelle i alder og paritet efter Student's t-test. Vurder forskelle i menopausal status, historie hypertension og diabetes ved chi-square test. Vurder forskellene i antallet af ovariebakterielle taxa ved Mann-Whitney U-testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Patienter
I alt 16 kvalificerede patienter blev inkluderet i undersøgelsen. Kontrolgruppen omfattede 10 kvinder med en diagnose af godartet livmodertumor (blandt dem blev 3 patienter diagnosticeret med livmoder myom, og 7 patienter blev diagnosticeret med livmoder adenomyose). I mellemtiden indeholdt kræftgruppen 6 kvinder med en diagnose af serøs kræft i æggestokkene (blandt dem blev 2 patienter diagnosticeret med fase II, og 2 af dem blev diagnosticeret med fase III). Følgende egenskaber viste ingen forskelle mellem patienter i kontrolgruppen og kræftgruppen: alder, menopausal status, paritet, historie hypertension, og historie af diabetes (Tabel 1).
Tabel 1: Patientstatistik Klik her for at downloade denne tabel.
Den rigdom og variation af æggestokkene bakteriearter i begge grupper
Tilstedeværelsen af bakterier, der anvender immunohistochemistry farvning blev vist i figur 1. Mikrobernes alfadiversitet blev analyseret som en metode til at opdage rigdom og variation af ovariebakterielle arter. Antallet af arter observeret i æggestokkene kræft væv var mindre end i kontrolgruppen, uden nogen væsentlig forskel. Den rigdom (repræsenteret ved Chao 1 og ACE indeks) og mangfoldighed (repræsenteret ved Shannon, Simpson, og Evenness indeks) af bakterielle arter var begge ikke signifikant forskellige mellem kræftgruppen og kontrolgruppen (Figur 2).
Figur 2: 16S rRNA-gensekvensering viser forskelle mellem kræft- og kontrolgrupperne i bakterierighed og mangfoldighed. (A) Observeret artsindeks (P = 0,06, Mann-Whitney U-test); (B) Chao 1 indeks (P = 0,06, Mann-Whitney U test); (C) ACE-indeks (P = 0,06, Mann-Whitney U-test) (D) Shannon-indeks (P = 0,32, Mann-Whitney U-test E. Jævnhed indeks (P = 0,48, Mann-Whitney U test); (F) Simpson indeks (P = 0,46, Mann-Whitney U test). Vi har fået genoptryktilladelse fra tidligere udgivere. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Beskrivelse af ovariebakterier
Dyb sekventering af V3-V4 16S rRNA-genregionen blev udført på alle prøver for at opnå en bedre forståelse af æggestokkenes bakterier. Resultaterne viste, at Proteobacteria var den mest rigelige phylum (67,10% i kontrolgruppen og 67,20% i kræftgruppen), Firmicutes var den næstmest rigelige phylum (23,77% i kontrolgruppen og 23,82% i kræftgruppen), og den tredje mest rigelige phylum var Bacteroidetes (3,26% i kontrolgruppen og 3,41% i kræftgruppen). Ved analyse af arter af kontrolgruppen bestod hovedsammensætningen af Halobacteroides halobios (14,53%), efterfulgt af Gemmata obscuriglobus (11,07%) og Methyloprofundus sedimenti (10,69%). For kræftgruppen var Gemmata obscuriglobus den rigeste i klyngen (13,89 %), efterfulgt af Halobacteroides halobius (11,99 %) og Methyloprofundus sedimenti (11,12 %) (figur 3).
Figur 3: Relativ forekomst af phyla (> 1%) og af de 12 bedste arter i ovarieprøver. (A) Den relative forekomst af phyla (> 1%) i æggestokkene af patienterne i kontrolgruppen. (B) Den relative forekomst af phyla (> 1%) i æggestokkene af patienter med kræft i æggestokkene. (C) Den relative forekomst af de 12 mest rigelige bakteriearter i æggestokkene hos kontrolpatienterne. (D) Den relative forekomst af de 12 mest rigelige bakteriearter i æggestokkene af kræft i æggestokkene patienter. Vi har fået genoptryktilladelse fra tidligere udgivere. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Forskellige sammensætninger af ovariebakterier mellem de to grupper
En sammenligning af forskellige bakterielle samfund blev udført af PCoA ved hjælp af PERMANOVA. Resultaterne viste, at bakterierne i kontrolgruppen afveg fra dem i kræftgruppen, P < 0,05 (Figur 4).
Figur 4: PCoA registrerer klynger af samfund og den relative overflod af Anoxynatronum sibiricum og Methanosarcina vacuolata. (A) Fællesskaber blev grupperet ved hjælp af PCoA. PC1 og PC2 er afbildet på x og y akser. Rød blok angiver en stikprøve i kræftgruppen i æggestokkene. Den blå cirkel angiver et eksempel i kontrolelementgruppen. Prøverne fra kræft i æggestokkene gruppe blev adskilt fra andre prøver i kontrolgruppen. (B) Fællesskaber grupperet ved hjælp af PCoA. PC1 og PC2 er afbildet på x og y akser. Rød blok angiver en stikprøve i kræftgruppen i æggestokkene. Den blå faste cirkel angiver en prøve fra en patient med livmoder myom, og den blå hule cirkel er lig med en prøve af en patient med livmoder adenomyose. (C) Den relative forekomst af Anoxynatronum sibiricum (kontrolgruppe: n = 10, kræftgruppe: n = 6, P = 0,034, Mann-Whitney U-test). (D) Den relative forekomst af Methanosarcina vacuolata (kontrolgruppe: n = 10, kræftgruppe: n = 6, P = 0,001, Mann-Whitney U-test). Vi har fået genoptryktilladelse fra tidligere udgivere. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Ovariebakterisk sammensætning i kræft- og kontrolgrupper fra forskellige perspektiver
En analyse af æggestokkenes bakteriesammensætning blev udført fra forskellige perspektiver for yderligere at opdage forskellene i de identificerede ovariebakterier. I tabel 2blev phylum, klasse, orden, familie-, slægts- og artsniveauer taget i betragtning, og der findes statistik i diagrammet. Især var der en sammenhæng mellem den relative overflod af Anoxynatronum sibiricum og tumorstadiet, og Methanosarcina vacuolata var et specifikt tegn, når man diagnosticerede kræft i æggestokkene (Tabel 2).
Fænotypisk bevarelse af ovariebakterier i de to grupper baseret på forudsagte funktioner
I kræftgruppen blev ekspressionen af gener relateret til potentielt patogene og oxidative stresstolerante fænotyper øget sammenlignet med kontrolgruppens (Wilcoxon-test, P =0,02 og P =0,002). Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel mellem kræft i æggestokkene og kontrolgrupperne i følgende aspekter: fænotyperne af aerobe, anaerobe, fakultets anaerobe, grampositive og gram-negative bakterier; mobile elementer; og biofilm dannelse af æggestokkene bakterier (Figur 5). 46 variant KEGG veje mellem bakterierne i æggestokkene i kræft og kontrolgrupper blev bestemt. Æggestokkene i kræftgruppen viste 26 øgede veje. Blandt dem var de mest relaterede veje transportører. På den anden side viste bakterierne i kræft i æggestokkene 20 reducerede veje. De mest relevante funktioner var som følger: sekretionssystem, ukendte funktioner og tokomponentsystem. Resten af stierne er vist i figur 6.
Figur 1: LPS immunhistokemisk udtryk i æggestokke. (A) Kontrolgruppe (10 x). Skalastænger, 200 μm. (B) Kontrolgruppe (40 x). Skalabarer, 50 μm. (C) Kræftgruppe (10x). Skalabarer, 200 μm. (D) Kræftgruppe (40 x). Skalastænger, 50 μm. Pile peger på LPS farvning i æggestokkene væv. Vi har fået genoptryktilladelse fra tidligere udgivere. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Forudsagte metagenomer analyseret af BugBase. Udtrykket af nogle gener i kræftgruppen blev øget i forhold til i kontrolgruppen. Disse gener var relateret til potentielt patogene (Wilcoxon underskrevet-rank test, P = 0,02) og oxidative stress-tolerante fænotyper af æggestokkene. (Wilcoxon underskrevet-rang test, P = 0,002). Vi har fået genoptryktilladelse fra tidligere udgivere. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: PICRUSt analyse af forskellige KEGG-veje mellem kræft- og kontrolgrupperne. Vi har fået genoptryktilladelse fra tidligere udgivere. Dette tal er blevet ændret fra Wang et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 2: Rigdom (repræsenteret ved Chao 1 og ACE-indekset) og mangfoldigheden (repræsenteret ved Shannon, Simpson og Evenness-indekset) af bakteriearten Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kræft i æggestokkene har en bemærkelsesværdig indflydelse på kvinders fertilitet25. De fleste kræftpatienter i æggestokkene diagnosticeres i sene stadier, og den 5-årige overlevelsesrate er mindre end 30%18. Bekræftelse af bakterier i abdominal fast indvolde, herunder leveren, bugspytkirtlen og milten, er blevet offentliggjort. Eksistensen af bakterier i den øvre kvindelige reproduktive tarmkanalen opstår, fordi livmoderhalsen ikke er lukket2,3,4,5. Men om æggestokkene, som er abdominale faste indvolde, er sterile eller ej, er endnu ikke fastlagt. Derudover, om bakterier i æggestokkene er relateret til kræft i æggestokkene er også et vigtigt spørgsmål.
De betydelige forskelle i de bakterier, vi fandt, blev sammenlignet mellem forskellige grupper. Alle de procedurer, der er nævnt ovenfor, var strengt bakteriefri, herunder instrumenter, reagenser, udstyr og driften af hele protokollen. Endnu vigtigere, vi brugte æggestokke fra patienter med godartet livmodersygdom som kontrolgruppe for at modvirke mulig forurening. I denne protokol kan forurening dog ikke undgås. Da kræftgruppen og kontrolgruppen blev analyseret i det samme eksperimentelle miljø, blot ved at sammenligne forskellene mellem disse to grupper, kunne vi opnå primære beviser om den mikrobiologiske oprindelse af kræft i æggestokkene.
Resultaterne af bakterier i æggestokkene væv kan starte et nyt felt undersøge bakterier påvirker kræft i æggestokkene. Derudover kan den unikke tilstedeværelse og sammensætning af bakterier i kræft i æggestokkene væv direkte carcinogenese af kræft i æggestokkene, og de terapeutiske og prognostiske mål for bakterier. Blandt de 46 KEGG-veje tiltrak funktioner relateret til biosyntesen af vancomycingruppen antibiotika særlig opmærksomhed. Dette kan give yderligere behandlingsmuligheder for kræft i æggestokkene.
Protokollen havde dog nogle begrænsninger. For det første kunne prøverne ikke indsamles fra raske mennesker af etiske årsager. Kontrolgruppen var æggestokke af patienter med godartet livmodersygdom (herunder livmoder myom og adenomyose). For det andet skal antallet af prøver være større. Undersøgelsens begrænsede stikprøvestørrelse kan hæmme resultaternes nøjagtighed. For det tredje var der ingen negativ eller positiv kontrol, selv om kræftgruppen og kontrolgruppen var under de samme betingelser. Desuden kunne forurening ikke undgås. Til dato er studiet af æggestokkene bakterier hos patienter med kræft i æggestokkene stadig i et tidligt stadium. En større undersøgelse med flere prøver er nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Clinical Research Award fra det første tilknyttede hospital i Xi'an Jiaotong University, Kina (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), det store grundforskningsprojekt for naturvidenskab i Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2018JM7073, 2017ZDJC-11), det centrale forsknings- og udviklingsprojekt i Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), Shaanxi Provincial Collaborative Technology Innovation Project (2 017XT-026, 2018XT-002) og Det Medicinske Forskningsprojekt af Xi'an Social Development Guidance Plan (2017117SF/YX011-3). Finansieringskilderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og -analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberede manuskriptet.
Vi takker kollegerne i Gynækologisk Afdeling for Første tilknyttet Hospital i Xi'an Jiaotong University for deres bidrag til indsamling af prøver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
References
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al.
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
