Summary
Total vaporization Solid Phase Microextraction (TV-SPME) förångar helt ett flytande prov medan analyter ssorberas på en SPME-fiber. Detta möjliggör avpartiering av analyten mellan endast lösningsmedletånga och SPME-fiberbeläggningen.
Abstract
Gaskromatografi – Masspektrometri (GC-MS) är en ofta använd teknik för analys av många analyter av kriminaltekniskt intresse, inklusive kontrollerade ämnen, antändbara vätskor och sprängämnen. GC-MS kan kopplas till SPME (Solid-Phase Microextraction), där en fiber med sorptiv beläggning placeras i huvudutrymmet ovanför ett prov eller nedsänks i ett flytande prov. Analyter sorberas på fibern som sedan placeras inuti det uppvärmda GC-inloppet för desorption. Total vaporization Solid-Phase Microextraction (TV-SPME) använder samma teknik som nedsänkning SPME men fördjupar fibern i ett helt förångat provextrakt. Denna fullständiga förångning resulterar i en skiljevägg mellan endast ångfasen och SPME-fibern utan störningar från en vätskefas eller några olösliga material. Beroende på kokpunkten för det lösningsmedel som används möjliggör TV-SPME stora provvolymer (t.ex. upp till hundratals mikroliter). Derivatisering på fiber kan också utföras med TV-SPME. TV-SPME har använts för att analysera droger och deras metaboliter i hår, urin och saliv. Denna enkla teknik har också tillämpats på gatudroger, lipider, bränsleprover, explosiva rester efter sprängning och föroreningar i vatten. Detta dokument belyser användningen av TV-SPME för att identifiera olagliga äktenskapsbrytare i mycket små prover (mikrolitermängder) av alkoholhaltiga drycker. Både gamma-hydroxybutyrate (GHB) och gamma-butyrolactone (GBL) identifierades på nivåer som skulle hittas i spikade drycker. Derivatisering av ett trimetylsilylmedel som är tillåtet för omvandling av vattenmatrisen och GHB till deras TMS-derivat. Sammantaget är TV-SPME snabbt, enkelt och kräver inget provberedning förutom att placera provet i en huvudutrymmesflaska.
Introduction
Solid-Phase Microextraction (SPME) är en provtagningsteknik där ett flytande eller fast prov placeras i en huvudutrymmesflaska och en SPME-fiber, belagd med ett polymermaterial, sedan förs in i provhuvudutrymmet (eller nedsänks i ett flytande prov). Analyten sorberas på fibern och sedan placeras fibern inuti GC-inloppet för desorption1,2. Total vaporization Solid-Phase Microextraction (TV-SPME) är en liknande teknik som nedsänkning SPME men förångar helt ett flytande prov innan analyter adsorberas på fibern. Detta gör det möjligt att dela upp analyten mellan endast lösningsmedelsångan och fiberbeläggningen, vilket gör det möjligt att adsorbera mer av analyten på fibern och resultera i god känslighet3. Det finns olika SPME-fibrer tillgängliga och fibern bör väljas baserat på analyten av intresse, lösningsmedel / matris och derivatiseringsmedel. Se tabell 1 för etablerade TV-SPME-analyter.
| prov | Analyte(er) | Rekommenderad SPME-fiber | Referenser |
| Människohår | Nikotin, cotinin | Polydimethylsiloxan/divinylbenzen (PDMS/DVB), polyakrylat (PA) | 3 |
| Rökfritt pulver | Nitroglycerin, diphenylamin | Polydimeetylsiloxan (PDMS), polyetylenglykol (PEG) | 7, 8 |
| Racing bränsle | Metanol, nitrometan | tapp | 9 |
| Vatten | Polycykliska aromatiska kolväten | PDMS (PDMS) | 10 |
| Drycker | ɣ-Hydroxybutyric syra, ɣ-butyrolactone | PDMS (PDMS) | Detta arbete |
| Fast pulver | Metamfetamin, amfetamin | PDMS/DVB | opublicerad |
Tabell 1. Rekommenderade SPME-fibrer med etablerade TV-SPME-analyter.
För att utföra TV-SPME löses analyter i ett lösningsmedel och en alikvot av denna blandning placeras i en huvudutrymmesflaska. Prover behöver inte filtreras eftersom endast lösningsmedlet och flyktiga analyter kommer att förångas. Särskilda volymer flytande prover skall användas för att säkerställa en total förångning av provet. Dessa volymer bestäms med hjälp av den ideala gaslagen för att beräkna antalet mol av ett lösningsmedel multiplicerat med vätskan mola volym (ekvation 1).
Ekvation 1
Där Vo är provet (ml), P är lösningsmedlets ångtryck (bar), Vv är volymen av injektionsflaskan (L), R är den idealiska gaskonstanten (0,083145 
), M är lösningsmedlets molmassa (g/mol), T är temperatur (K) och 
är lösningsmedlets densitet (g/ml). 3 (på alla)
För att använda rätt ångtryck används Antoine-ekvationen (ekvation 2) för att ta hänsyn till temperaturpåverkan:4
Ekvation 2
där T är temperatur och A, B och C är Antoine konstanterna för lösningsmedlet. Ekvation 2 kan ersättas med ekvation 1, vilket ger:
Ekvation 3
Ekvation 3 ger volymen av provet (Vo) som kan förångas helt som en funktion av den temperatur och lösningsmedel som används.
För att utföra derivatisering med TV-SPME utsätts SPME-fibern först för en flaska som innehåller derivatiseringsmedlet under en förutbestämd tid beroende på analyten. SPME-fibern utsätts sedan för en ny flaska som innehåller den analyt av intresse. Denna injektionsflaska värms upp inuti en uppvärmd omrörare. Analyten adsorberas sedan på fibern med derivatiseringsmedlet. Derivatizationen av analyten och/eller matrisen äger rum på fibern, innan den sätts in i GC-inloppet för desorption. Figur 1 visar en skildring av TV-SPME-processen med derivatisering.
Bild 1: Skildring av TV-SPME-processen med derivatisering. SPME-fibern kommer först in i derivatiseringsflaskan där derivatiseringsmedlet (gula cirklar) ssorberar på fibern. Fibern introduceras sedan till provet (blå cirklar) och värms upp. Bildandet av derivatet (gröna cirklar) sker på fibern under extraktionstiden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
TV-SPME är fördelaktigt eftersom det gör det möjligt att derivatisera analyten under extraktionsprocessen vilket minskar analystiden. Andra metoder, såsom vätskeinjektion, kräver att analyten reagerar med det derivatiserande medlet i lösningen innan det injiceras i GC. TV-SPME kräver också lite eller ingen provberedning. En matris som innehåller en analyt kan placeras direkt i huvudutrymmets injektionsflaska och analyseras. Många föreningar av intresse är kompatibla med TV-SPME. Föreningar måste vara lösliga i ett lösningsmedel och tillräckligt flyktiga för att möjliggöra förångning. Dessutom måste föreningar vara termiskt stabila för att analyseras av GC-MS. TV-SPME har använts för att analysera droger och läkemedelsmetaboliter, racingbränslen, polycykliska aromatiska kolväten och explosiva material3,5,6,7,8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Allmän beredning av TV-SPME-prov och analys av GC-MS
OBS: Om provet redan är upplöst i en matris går du vidare till steg 1.2.
- Extrahera eller lös upp det fasta provet i tillräckligt med lösningsmedel (vatten, metanol, aceton etc.) för att uppnå önskad koncentration. Flytande prover kan användas "i dess form".
OBS: Mängden fast prov som används beror på den önskade koncentrationen av provet. Koncentrationer under 1 ppm (w/v) rekommenderas för att undvika överbelastning av GC-kolumnen. Analyt ska vara löslig i valt organiskt lösningsmedel.- Se till att provet är helt upplöst.
- Beräkna den volym som behövs för att helt förånga provet med hjälp av ekvation 3 vid vald temperatur. Om försöket till exempel ska utföras vid 60 °C, beräkna den volym som behövs för att helt förånga lösningsmedlet vid 60 °C.
- Överför provvolymen till en huvudutrymmesflaska och säkra locket. Godtagbara metoder för överföring av vätskeprover på mikroliterskalan inkluderar manuellt via glasspruta, en elektronisk glasspruta eller en autosamplerrobot som kan överföras för provberedning.
- Om du härleder provet bereder du rätt derivatiseringsmedel genom att placera ~1 ml av medlet i en huvudutrymmesflaska.
- Välj derivatiseringsmedlet baserat på vilken typ av derivatisering som behövs: alkylering, aylering eller silyering. I detta fall är det rekommenderade derivatiseringsmedlet för karboxylsyra och alkoholfunktionella grupper som finns på GHB O-bis (trimetylsilsilyl) trifluoracetamid (BSTFA). Derivatiseringsmedlet kan användas "i samma sätt" och kräver ingen utspädning. En ml derivatiseringsmedel är tillräckligt för att säkerställa fullständig mättnad av SPME-fibern.
VARNING: Derivatiseringsmedel är giftiga och bör hanteras i en rökhuv.
- Välj derivatiseringsmedlet baserat på vilken typ av derivatisering som behövs: alkylering, aylering eller silyering. I detta fall är det rekommenderade derivatiseringsmedlet för karboxylsyra och alkoholfunktionella grupper som finns på GHB O-bis (trimetylsilsilyl) trifluoracetamid (BSTFA). Derivatiseringsmedlet kan användas "i samma sätt" och kräver ingen utspädning. En ml derivatiseringsmedel är tillräckligt för att säkerställa fullständig mättnad av SPME-fibern.
- Ställ in rätt inkubations-/utsugningstemperatur baserat på beräkningen i steg 1.2. Denna temperatur säkerställer total förångning, tillräcklig provextraktion och fullständig derivatisering (om det behövs).
- Välj GC-MS-parametrar (ugnstemperaturprogram, flödeshastighet, inloppstemperatur etc.) baserat på klassen av den eller de föreningar som är av intresse. Se steg 3 för en exempelparameteruppsättning.
- Se till att rätt inloppsledning (t.ex. 2 mm innerdiameter eller mindre) finns i GC-inloppet.
- Se till att SPME-fibern är korrekt konditionerad och är i gott skick innan analysen påbörjas.
- Variera konditioneringsparametrarna baserat på vilken typ av SPME-fiber som används. Se SPME fiberinstruktioner för korrekt konditioneringstemperatur och tid. I allmänhet är det tillräckligt att analysera flera SPME-fiberämnen tills de är reproducerbara för att karakterisera en SPME-fiber som helt konditionerad.
2. Gammahydroxibutyrat (GHB) och Gammabutyrolactone (GBL) provberedning
- Förbered ett prov av GHB och/eller GBL i vatten med en koncentration på mindre än 1 ppm.
- Överför 1 μL av detta prov till en 20 ml huvudutrymmesflaska med någon av de metoder som beskrivs i 1.2.1.
- Observera att analysen av vattenhaltiga prover kräver de lägsta provvolymerna. Till exempel kommer en μL vatten helt att förångas till en 20 ml huvudutrymmesflaska vid 60 °C.
- Locket injektionsflaskan omedelbart.
- Placera ~1 ml BSTFA + 1% trimetylklorosilan (TMCS) i en separat 20 ml huvudutrymmesflaska och lock.
GBL derivaterar inte. Ett derivatiseringssteg krävs dock fortfarande för att säkerställa att vattenlösningsmedlet derivatiseras och inte stör provet.
VARNING: BSTFA är giftigt och bör hanteras i en rökhuv.
3. GC-MS parametrar och inställning för GHB och GBL i vatten
- Skapa en metod med följande GC-MS-parametrar:
Initial ugnstemperatur: 60 °C hålls i 1 minut.
Ugnsprogram: 15 °C/minut.
Slutlig ugnstemperatur: 280 °C, hålls i 1 minut.
Flödeshastighet: 2,5 ml/minut (hastighetsoptimerat flöde för en 0,25 mm d. kolonn).
Inloppstemperatur: 250 °C.
Överföringsledningstemperatur: 280 °C. - Se till att ett smalt (2 mm d.d. eller mindre) SPME-inloppsliner har placerats inuti GC-inloppet.
- Se till att PDMS/DVB SPME-fibern är korrekt konditionerad och är i gott skick före analys.
OBS: PDMS/DVB SPME-fibrer ska konditioneras i GC-inloppet vid 250 °C i 30 minuter. PDMS / DVB SPME-fibrer ska vara en off-white färg. - Kör GC-MS på exemplet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En GBL volymstudie utfördes för att visa känsligheten hos TV-SPME jämfört med headspace och nedsänkning SPME. Ett 100ppmv prov av GBL i vatten förbereddes och placerades i 20 mL huvudutrymme injektionsflaska med volymer av 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000 och 10,000 μL. Fasförhållandet mellan de prover som är tillåtna för TV-SPME (1-3 μL), Headspace SPME (10 – 3 000 μL) och Immersion SPME (10 000 μL). Alla prover analyserades i tre exemplar och den genomsnittliga topparealen ritades mot provvolymen. Totalt sett visade provvolymer som möjlige TV-SPME mer känslighet än spme för huvudutrymme eller nedsänkning för GBL i vatten enligt figur 2. En jämförelse av kromatogrammen för varje metod visas i figur 3.
Figur 2: Diagram över genomsnittlig toppareal jämfört med provvolymen för GBL i vatten. En GBL-volymstudie utfördes för att visa effekten av TV-SPME jämfört med headspace och nedsänkning SPME. Ett 100ppmv prov av GBL i vatten förbereddes och placerades i 20 mL huvudutrymmesflaska med volymer på 1, 3, 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, & 10000 μL. Alla prover analyserades i tre exemplar och felstaplar motsvarar standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Totalt jonkromatogram för GBL i vatten. (100 ppm) för 3 μL (blå), 300 μL (röd) och 10 000 μL (grön). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Realistiska prover av vin spetsat med en effektiv dos GHB och GBL visas i figur 4 respektive figur 5. Dessa prover visar också sammankopplingen av GBL och GHB. När TV-SPME utförs korrekt kommer en skarp, riklig topp att resultera som visas i figur 6. TV-SPME har god känslighet och därför bör lämpliga koncentrationer användas för att inte överbelasta kolonnen. När det finns höga koncentrationer kommer toppasymmetri att resultera som visas i figur 5 och figur 7. I dessa fall kan utspädning av provet eller användning av en delad injektion förbättra toppformen.
Figur 4: Realistiskt prov av GHB i vin med en koncentration på 8 mg/ml. Toppar: 1) GBL, 2) hexanosyra-TMS, 3) GHB-TMS2, 4) bensoesyra-TMS, 5) oktanosyra-TMS, 6) glycerol-TMS3, * betecknar en cyklisk siloxan (fiber / kolonnblödning). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Realistiskt prov av GBL i vin med en koncentration på 10 mg/ml. Toppar: 1) GBL, 2) hexanosyra-TMS, 3) Siloxan, 4) trimetyl (2-fenylethoxy) silan, 5) GHB-TMS2. TIC visar GBL konvertera till GHB. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Totalt jonkromatogram för GBL i vatten med en koncentration på 0,1 ppm. Resultat enligt TV-SPME-metoden som tidigare beskrivits för GBL i vatten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Totalt jonkromatogram för GBL i vatten med en koncentration på 10 ppm. Resultat enligt TV-SPME-metoden som tidigare beskrivits för GBL i vatten. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Vid derivatisering bör analytikern se till att metoden gör det möjligt att de analyt(erna) är helt derivaterade innan de desorberas in i GC. Partiell derivatization kan resultera i en topp som representerar den derivatized analyte och en topp som representerar den underivatized analyte. Partiell derivatisering kommer också att resultera i en lägre känslighet för analyten eftersom mindre av det kan adsorbera på fibern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TV-SPME har vissa fördelar jämfört med vätskeinsprutningsgc genom att stora provstorlekar (t.ex. 100 μL) kan användas utan instrumentändringar. TV-SPME har också några av samma fördelar som headspace SPME. Headspace SPME kräver ingen extraktion eller filtrering eftersom eventuella icke-volatila föreningar kommer att finnas kvar i huvudutrymmets injektionsflaska och inte kommer att adsorberas på fibern, vilket ger ett rent prov. Denna metod hjälper också till att eliminera matriseffekter på grund av att detta är ett tvåfassystem (huvudutrymme och fiber) i motsats till ett trefassystem (prov, huvudutrymme och fiber) som standard huvudutrymme SPME. TV-SPME är som nedsänkning SPME i att nedsänkning SPME också är ett tvåfassystem. Med nedsänkning SPME är en fiber nedsänkt i ett flytande (vanligtvis vattenhaltigt) prov som innehåller analyten i stället för att extrahera analyten från sin ånga. TV-SPME skiljer sig från nedsänkning SPME eftersom nedsänkning SPME kräver en polär/ vattenhaltig matris för att generera tillräcklig drivkraft för analyter att lämna lösningsfasen och sorbera till fiberbeläggningen. Dessutom kräver nedsänknings-SPME mycket större provvolymer (t.ex. mL).
Många lösningsmedel kan användas med TV-SPME inklusive metanol, aceton, vatten och acetonitril. SPME-fibrer bör inte utsättas för eller nedsänkas i kloroform eftersom dessa lösningsmedel kan skada fiberbeläggningen. Tjugo ml skruvlock glas huvudutrymme injektionsflaskor har visat sig ha den bästa prestandan med TV-SPME metoder. Vi rekommenderar att du använder en autosampler med TV-SPME. Även om många parametrar i TV-SPME-metoden kan justeras efter önskemål, måste rätt volym och extraktionstemperatur användas för varje lösningsmedel. Provvolymen och extraktionstemperaturen är proportionella mot varandra och måste justeras i enlighet med detta. Till exempel kan extraktionstemperaturen för en metod minskas, men provvolymen måste också minskas. Den här volymen kan hittas genom att justera ekvation 3.
Ändringar av derivatiseringsförfarandet får göras. Derivatization kan utföras före eller efter extraktion, vid rumstemperatur eller upphettas i omröraren, genom att utsätta fibern för derivatiseringsmedlets ånga eller genom direkt nedsänkning av fibern i derivatiseringsmedlet.
Det finns begränsningar för TV-SPME-metoden, inklusive behovet av att föreningar är lösliga, termiskt stabila och flyktiga. TV-SPME kräver dyra SPME-fibrer som kan få sin beläggning avskalad eller trasig under analysen. Dessa begränsningar uppvägs av fördelar som stora provvolymer i förhållande till typiska GC injektionsvolymer, hög känslighet och inget behov av filtrering. TV-SPME föredras framför headspace SPME eftersom mer av provet extraheras på fiber- och matriseffekterna reduceras. TV-SPME föredras också framför nedsänkning SPME eftersom nedsänkning SPME förbrukar mycket mer prov än TV-SPME. TV-SPME möjliggör derivatisering under extraktionsprocessen vilket minskar analystiden jämfört med metoder som vätskeinjektion som kräver att analyten derivateras före injektionen. TV-SPME kräver också lite eller ingen provberedning. TV-SPME är enkelt, effektivt och känsligt för analys av en mängd olika prover, inklusive droger, explosiva material och racingbränslen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Institute of Justice (Award No. 2015-DN-BX-K058 & 2018-75-CX-0035). De åsikter, resultat och slutsatser som uttrycks här är författarens och återspeglar inte nödvändigtvis finansieringsorganisationernas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL Syringe | Gerstel | 100111-014-00 | |
| BSTFA + 1% TMCS (10 x 1 GM) | Regis Technologies Inc. | 50442882 | |
| eVol XR Sample Dispensing System Kit | ThermoFisher Scientific | 66002-024 | |
 -Butyrolactone (GBL) |
Sigma-Aldrich | B103608-26G | |
| -Hydroxy Butyric Acid (GHB) |
Cayman Chemicals | 9002506 | |
| Headspace Screw-Thread Vials, 18 mm | Restek | 23083 | |
| Magnetic Screw-Thread Caps, 18 mm | Restek | 23091 | |
| Optima water for HPLC | Fisher Chemical | W71 | |
| SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane (PDMS) | Supelco | 57341-U | |
| SPME Fiber Assembly Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene (PDMS/DVB) | Supelco | 57293-U | |
| Topaz 2.0 mm ID Straight Inlet Liner | Restek | 23313 |
References
- Pawliszyn, J. B. Method and Device for Solid Phase Microextraction and Desorption. United States patent. , (2005).
- Pawliszyn, J. Solid phase microextraction: theory and practice. , John Wiley & Sons. (1997).
- Rainey, C. L., Bors, D. E., Goodpaster, J. V. Design and optimization of a total vaporization technique coupled to solid-phase microextraction. Analytical Chemistry. 86 (22), 11319-11325 (2014).
- Sinnott, R. Chemical Engineering Design: Chemical Engineering. 6, Elsevier. (2005).
- Davis, K. Detection of Illicit Drugs in Various Matrices Via Total Vaporization Solid-Phase Microextraction (TV-SPME). , Indiana University - Purdue University Indianapolis. Master of Science thesis (2019).
- Ash, J., Hickey, L., Goodpaster, J. Formation and identification of novel derivatives of primary amine and zwitterionic drugs. Forensic Chemistry. 10, 37-47 (2018).
- Sauzier, G., Bors, D., Ash, J., Goodpaster, J. V., Lewis, S. W. Optimisation of recovery protocols for double-base smokeless powder residues analysed by total vaporisation (TV) SPME/GC-MS. Talanta. 158, 368-374 (2016).
- Bors, D., Goodpaster, J. Mapping smokeless powder residue on PVC pipe bomb fragments using total vaporization solid phase microextraction. Forensic science international. 276, 71-76 (2017).
- Bors, D., Goodpaster, J. Chemical analysis of racing fuels using total vaporization and gas chromatography mass spectrometry (GC/MS). Analytical Methods. 8 (19), 3899-3902 (2016).
- Beiranvand, M., Ghiasvand, A. Design and optimization of the VA-TV-SPME method for ultrasensitive determination of the PAHs in polluted water. Talanta. 212, 120809 (2020).
