Injeções de pupal e adultos para edição de genes RNAi e CRISPR em Nasonia vitripennis
Summary
Aqui, descrevemos métodos para injeções pupais eficientes e adultas em Nasonia vitripennis como alternativas acessíveis à microinjeção de embriões, permitindo a análise funcional de genes de interesse usando RNA-silenciamento via interferência de RNA (RNAi) ou nocaute genético via edição de genoma CRISPR/Cas9.
Abstract
A vespa joia, Nasonia vitripennis,tornou-se um sistema modelo eficiente para estudar epigenética da determinação sexual haplo-diploide, biologia do cromossomo B, interações hospedeiras-simbiontes, especiação e síntese de veneno. Apesar da disponibilidade de várias ferramentas moleculares, incluindo CRISPR/Cas9, estudos genéticos funcionais ainda são limitados neste organismo. A maior limitação da aplicação da tecnologia CRISPR/Cas9 em N. vitripennis decorre dos desafios das microinjeções embrionárias. As injeções de embriões são particularmente difíceis neste organismo e, em geral, em muitas vespas parasitoides, devido ao pequeno tamanho de embrião e à exigência de uma pupa hospedeira para o desenvolvimento embrionário. Para enfrentar esses desafios, o parto complexo de ribonucleoproteína Cas9 em ovários femininos por injeção adulta, em vez de microinjeção embrionária, foi otimizado, resultando em edições germinas somáticas e herediáveis. Os procedimentos de injeção foram otimizados em pupas e vespas fêmeas usando controle remot (Transdução de ovário Mediado por Receptor de Carga) ou BAPC (Cápsulas de Peptídeos Anfífilos Ramificados). Esses métodos são mostrados como alternativas eficazes à injeção de embriões, permitindo mutações germinas específicas do local e hereiáveis.
Introduction
A edição de genes CRISPR/Cas9 é uma tecnologia poderosa para estudos genéticos funcionais, especialmente em muitos organismos modelo em ascensão, como a vespa-jóia, Nasonia vitripennis. A facilidade de criação e a disponibilidade de um genoma completo fazem da vespa joia um importante sistema experimental para elucidar os mecanismos moleculares de diferentes processos biológicos. Por exemplo, n. vitripennis tem sido recentemente usado para desvendar a base epigenética do sistema de determinação sexual haplodiploide1,2, a biologia dos cromossomos B3,4,5,6, e a base genética para a regulação circadiana e sazonal7,8. Algumas das características que tornam n. vitripennis favoráveis ao trabalho incluem tempo de geração curta (~2 semanas a 25 °C), altas taxas de reprodução, separação sexual fácil na fase pupal, e a capacidade de diapausa e armazenar cepas a 4 °C. O ciclo de vida começa com vespas fêmeas parasitando a pupa da mosca-do-sopro, Sarcófaga bullata. Através de seu ovipositor, as fêmeas colocam até 50 ovos no caso pupal da mosca-do-sopro. Os ovos se desenvolvem em larvas que se alimentam da pupa S. bullata, continuam a se desenvolver nos próximos dias, e depois filhotes, seguidos de eclosão adulta e surgimento do pupário hospedeiro9.
Ferramentas moleculares para a realização de estudos genéticos funcionais em N. vitripennis, como a interferência de RNA (RNAi)10 e CRISPR/Cas911,12, estão disponíveis, mas são limitadas, principalmente devido a dificuldades na realização de microinjeções embrionárias13. Como os ovos de vitripennis n. exigem um hospedeiro pupal para o desenvolvimento, a manipulação de ovos é muito desafiadora. Os embriões em estágio pré-blastoderm devem ser coletados do hospedeiro blowfly pupae, rapidamente microinjetados, e imediatamente transferidos de volta para o hospedeiro para o desenvolvimento13. Essas etapas requerem treinamento de precisão e especialização para evitar danificar os embriões microinjetados ou os hospedeiros pupal13. Além disso, os ovos são muito pequenos e frágeis, especialmente após microinjeções, com um citoplasma muito viscoso causando um entupimento contínuo da agulha injetora13. Essas características tornam as microinjeções embrionárias excepcionalmente desafiadoras, exigindo operadores altamente treinados e equipamentos especializados que estão ausentes na maioria dos laboratórios de N. vitripennis.
A otimização de métodos alternativos de injeção para a entrega de reagentes CRISPR contribuiria para a consolidação de N. vitripennis como organismo modelo. A manipulação de pupas e adultos é menos desafiadora do que manipular embriões e pode ser realizada com uma configuração básica de injeção. Aqui, dois protocolos são descritos para injeção de pupas e adultos: um envolvendo equipamentos especializados para injeções, e outro envolvendo o uso de um conjunto de tubos aspiradores equipados com uma agulha capilar de vidro. O uso de tubo aspirador é particularmente adequado para laboratórios que não têm acesso a equipamentos especializados para microinjeções de embriões. Injeções eficientes de diferentes estágios de desenvolvimento de N. vitripennis, incluindo pupas brancas ou pretas e vespas adultas, são demonstradas. Vespas na fase pupal branca são particularmente adequadas para experimentos de knockdown mediados pela RNAi. Embora o RNAi em Nasonia tenha sido descrito pela primeira vez por Lynch e Desplan em 200610,não há procedimento visual disponível para a forma como as injeções RNAi são realizadas. RNAi foi recentemente usado para descobrir o gene haploidizador do B-cromossomo PSR (Relação Sexual Paternal)3 e estudar o envolvimento do gene do relógio, período, em ritmos biológicos N. vitripennis 7.
Pupas pretas e vespas adultas podem ser usadas para induzir a edição de genes germânicos CRISPR/Cas9 usando protocolos de Controle de Ovário ReMOT (Transdução de Ovário Mediado por Receptor) e BAPC (Cápsulas de Peptídeos Anfífilos Ramificados). Estes dois métodos de entrega de ovários foram recentemente descritos como eficazes na Nasonia para a geração de mutações germinas no gene alvo, cinnabar7,12. Aqui, é fornecido um protocolo simplificado para injeções, incluindo um procedimento visual de uma metodologia passo a passo para injeções pupal e adultas que podem ser utilizadas para gerar estudos genéticos funcionais na Nasonia e provavelmente em outras vespas parasitoides, sem exigir equipamentos especializados e contornar microinjeções embrionárias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com o recente aumento do uso de nasonia vitripennis como organismo modelo para várias questões biológicas2,3,7,17, há a necessidade de desenvolver e otimizar métodos de injeção para permitir um protocolo simplificado e eficiente para a análise funcional dos genes N. vitripennis. Os métodos atuais envolvendo microinjeção embrionária de reagentes de edição de genes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte por fundos de startup da UCSD direcionados à O.S.A. e à bolsa NSF/BIO 1645331 à J.L.R.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
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