Summary
Aquí, se describen los métodos para las inyecciones pupales y adultos eficientes en Nasonia vitripennis como alternativas accesibles a la microinyección embrionaria, lo que permite el análisis funcional de los genes de interés utilizando ya sea arn-silenciamiento a través de la interferencia de ARN (RNAi) o knockout gen a través de CRISPR / Cas9 edición del genoma.
Abstract
La avispa joya, Nasonia vitripennis,se ha convertido en un sistema modelo eficiente para estudiar la epigenética de la determinación del sexo haplo-diploide, la biología del cromosoma B, las interacciones huésped-simbionte, la especiación y la síntesis de veneno. A pesar de la disponibilidad de varias herramientas moleculares, incluyendo CRISPR/Cas9, los estudios genéticos funcionales todavía son limitados en este organismo. La principal limitación de la aplicación de la tecnología CRISPR/Cas9 en N. vitripennis se deriva de los desafíos de las microinyecciones embrionarias. Las inyecciones de embriones son particularmente difíciles en este organismo y en general en muchas avispas parasitoides, debido al pequeño tamaño del embrión y el requisito de una pupa huésped para el desarrollo embrionario. Para abordar estos desafíos, se optimizó la entrega del complejo de ribonucleoproteína Cas9 en los ovarios femeninos por inyección adulta, en lugar de microinyección embrionaria, lo que resultó en ediciones de línea germinal somáticas y heredables. Los procedimientos de inyección se optimizaron en pupas y avispas hembras utilizando ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) o BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Estos métodos han demostrado ser alternativas eficaces a la inyección de embriones, lo que permite mutaciones de la línea germinal hereditarias y específicas del sitio.
Introduction
La edición de genes CRISPR/Cas9 es una poderosa tecnología para estudios genéticos funcionales, especialmente en muchos organismos modelo ascendentes como la avispa joya, Nasonia vitripennis. La facilidad de cría y la disponibilidad de un genoma completo hacen de la avispa joya un importante sistema experimental para dilucidar los mecanismos moleculares de diferentes procesos biológicos. Por ejemplo, N. vitripennis se ha utilizado recientemente para desentrañar la base epigenética del sistema de determinación de sexo haplodiploide1,2,la biología de los cromosomas B3,4,5,6,y la base genética para la regulación circadiana y estacional7,8. Algunas de las características que hacen que N. vitripennis sea susceptible de trabajar incluyen un corto tiempo de generación (~ 2 semanas a 25 ° C), altas tasas de reproducción, fácil separación sexual en la etapa pupal y la capacidad de diapausa y almacenar cepas a 4 ° C. El ciclo de vida comienza con las avispas hembras parasitando las pupas de la luciérnga, Sarcophaga bullata. A través de su ovipositor, las hembras ponen hasta 50 huevos en el caso pupal de la 8ra. Los huevos se convierten en larvas que se alimentan de la pupa de S. bullata, continúan desarrollándose durante los próximos días, y luego pupan, seguidos de eclosión adulta y la aparición del pupario huésped9.
Se dispone de herramientas moleculares para realizar estudios genéticos funcionales en N. vitripennis,tales como la interferencia de ARN (ARNi)10 y CRISPR/Cas911,12,pero son limitadas, principalmente debido a las dificultades en la realización de microinyecciones embrionarias13. Como los huevos de N. vitripennis requieren un huésped pupal para el desarrollo, la manipulación de huevos es muy difícil. Los embriones en etapa pre-blastodermo deben ser recolectados de las pupas de la luciérnga del huésped, microinyectados rápidamente y transferidos inmediatamente de vuelta al huésped para su desarrollo13. Estos pasos requieren precisión y entrenamiento especializado para evitar dañar los embriones microinyectados o los hospedadores pupales13. Además, los óvulos son muy pequeños y frágiles, especialmente después de microinyecciones, con un citoplasma muy viscoso que provoca una obstrucción continua de la aguja de inyección13. Estas características hacen que las microinyecciones embrionarias sean excepcionalmente desafiantes, requiriendo operadores altamente capacitados y equipos especializados que están ausentes en la mayoría de los laboratorios de N. vitripennis.
La optimización de métodos alternativos de inyección para la administración de reactivos CRISPR contribuiría a la consolidación de N. vitripennis como organismo modelo. La manipulación de pupas y adultos es menos difícil que la manipulación de embriones y se puede lograr con una configuración básica de inyección. Aquí, dos protocolos se describen para la inyección de pupas y adultos: uno que implica el equipo especializado para las inyecciones, y el otro que implica el uso de un conjunto del tubo del aspirador cabido con una aguja capilar de cristal. El uso de un tubo aspirador es particularmente adecuado para laboratorios que no tienen acceso a equipos especializados para microinyecciones de embriones. Se demuestran inyecciones eficientes de diferentes etapas de desarrollo de N. vitripennis,incluyendo pupas blancas o negras y avispas adultas. Las avispas en la etapa de pupa blanca son particularmente adecuadas para experimentos de derribo mediados por RNAi. Aunque RNAi en Nasonia fue descrito por primera vez por Lynch y Desplan en 200610, no hay ningún procedimiento visual disponible para cómo se realizan las inyecciones de RNAi. RNAi fue utilizado recientemente para descubrir el gen haploidizador del cromosoma B PSR (Paternal Sex Ratio)3 y para estudiar la implicación del gen reloj, período,en los ritmos biológicos de N. vitripennis 7.
Las pupas negras y las avispas adultas se pueden utilizar para inducir la edición de genes de línea germinal CRISPR/Cas9 utilizando los protocolos ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) y BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Estos dos métodos de administración de ovarios se han descrito recientemente como eficaces en Nasonia para generar mutaciones en la línea germinal en el gen diana, el cinabrio7,12. Aquí, se proporciona un protocolo simplificado para las inyecciones que incluye un procedimiento visual de una metodología paso a paso para inyecciones pupales y adultas que se pueden utilizar para generar estudios de genética funcional en Nasonia y probablemente en otras avispas parasitoides, sin requerir equipo especializado y evitando microinyecciones embrionarias.
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Protocol
1. Cría de Nasonia
- Configure ~ 20 hembras apareadas singularmente en pequeños tubos de ensayo de vidrio tapados con algodón.
NOTA: Para reducir el espacio de cría, los tubos de 10 x 85 cm, 4 mL son óptimos. Las hembras se distinguen fácilmente de los machos debido a las alas más grandes y la presencia del ovipositor (Figura 1A). Los protocolos detallados para la cría de N. vitripennis también se pueden encontrar en otrasliteraturas 13,14,15.- Agregue dos hospedadores de S. bullata por tubo y mantenga las avispas a 25 ± 1 ° C y 30% de humedad relativa, con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 durante 2-3 días.
NOTA: Las avispas se pueden mantener a menor temperatura o temperatura ambiente; sin embargo, el desarrollo se ralentizará.
- Agregue dos hospedadores de S. bullata por tubo y mantenga las avispas a 25 ± 1 ° C y 30% de humedad relativa, con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 durante 2-3 días.
- Después de 2-3 días, con la ayuda de un pincel de punta fina, retire suavemente las hembras para evitar la oviposición continua y la asincronía en el desarrollo de la descendencia.
NOTA: Las hembras eliminadas pueden ser opcionalmente re-alojadas o almacenadas a 5 °C durante un mes.- Mantener el huésped parasitado a 25 °C y 30% de humedad relativa, con un ciclo claro-oscuro de 12:12 durante 7 días si la etapa de inyección deseada requiere pupas blancas; durante 13 días si la etapa de desarrollo requerida es pupas negras; o 14 días para adultos jóvenes recién surgidos.
NOTA: Las pupas amarillas y negras también se pueden almacenar a 5 °C durante un hasta una semana. Un almacenamiento más largo aumentará la frecuencia de diapausa en larvas para la próxima generación, lo que dificultará la detección posterior a la inyección y el establecimiento de líneas mutantes. - Abra el pupario huésped con una aguja de disección para recuperar las pupas de N. vitripennis y los adultos en la etapa deseada (Figura 1A).
NOTA: Para inyecciones a una edad adulta particular o para recoger hembras vírgenes, se recomienda eliminar las pupas oscuras el día 13 del huésped, separadas por sexo, y recoger a los adultos después de la emergencia.
- Mantener el huésped parasitado a 25 °C y 30% de humedad relativa, con un ciclo claro-oscuro de 12:12 durante 7 días si la etapa de inyección deseada requiere pupas blancas; durante 13 días si la etapa de desarrollo requerida es pupas negras; o 14 días para adultos jóvenes recién surgidos.
2. Alineación de pupas blancas y negras
- Prepare un portaobjetos de vidrio aplicando una línea de pegamento escolar en el centro. Extender el pegamento con una aguja de disección para obtener una capa gruesa(Figura 1B),que se utilizará para alinear las pupas. Deje secar el pegamento durante ~ 2 minutos antes de transferir las pupas.
NOTA: No sobredry el pegamento, de lo contrario las pupas no se unirán correctamente a la diapositiva y se deslizarán durante las inyecciones. - Bajo un microscopio de disección, usando la aguja de disección, aplique pegamento en la parte posterior de la cabeza de la pupa.
- Coloque la pupa a la capa de pegamento en la diapositiva con su abdomen hacia arriba. Alinee 20-30 pupas una al lado de la otra en la diapositiva (Figura 1C).
NOTA: Evite tocar el abdomen con el pegamento y evite sumergir las pupas en el pegamento; de lo contrario, los adultos no podrán emerger. - Coloque el portaobjetos con las pupas en una placa de Petri para dejar que el pegamento se seque durante ~ 10 min. Antes de comenzar las inyecciones, pruebe la adherencia de las pupas al pegamento empujándolas suavemente con la aguja de disección. Si la mayoría de las pupas se aflojan, prepare una nueva diapositiva. Alternativamente, retire todas las pupas que estén sueltas, y proceda a inyectar las que estén correctamente unidas a la diapositiva.
3. Preparación de la aguja
- Cargue un tubo de vidrio capilar en un tirador de agujas y tire de las agujas siguiendo las instrucciones del fabricante.
NOTA: En esta demostración se utiliza un tirador de agujas de filamento de platino P-1000 y capilares de vidrio de silicato de aluminio. El manual de operación de este instrumento (ver Tabla de Materiales)explica cómo cargar correctamente los tubos de vidrio capilar y configurar programas en este instrumento. Utilice los siguientes parámetros (Calor: 536; Tirón: 80; Vel: 100; Retraso: 70)en capilares de vidrio de silicato de aluminio para inyectar pupas amarillas, pupas negras y adultos.
Además, se utilizó el tirador de agujas P-2000 para preparar agujas de cuarzo siguiendo los parámetros(Calor: 805; Tirón: 145; Vel: 50; Retraso: 145). El manual proporciona instrucciones para cargar tubos capilares de cuarzo y la configuración de los programas en este instrumento. En ausencia de un tirador, vidrio capilar personalizable está disponible. - Cargue la aguja con 5 μL de la mezcla de inyección (preparada de antemano siguiendo los protocolos anteriores para inyecciones de RNAi10 o CRISPR/Cas9 ribonucleoproteína12 (RNP) en N. vitripennis)utilizando puntas de pipeta microcargadora.
NOTA: Durante la demostración, la aguja se carga con ARN de doble cadena (dsRNA) combinado con colorante rojo (ver Tabla de Materiales)para inyección de pupas de etapa blanca y con BAPC-Cas9-sgRNA para inyección de avispas y adultos de pupas negras. Estos reactivos se dirigirán al gen del cinabrio. Las avispas que son derribadas / salidas con éxito mostrarán ojos rojos en lugar de los ojos marrones de tipo salvaje. - Abra la aguja, deslizando la punta sobre una superficie hecha de dos diapositivas superpuestas (Figura 1D). Alternativamente, abra la punta de la aguja con un par de pórceps finos para crear un borde afilado o perforando lentamente el tórax o el abdomen de la avispa.
4. Inyección pupal con femtojet
- Coloque el portaobjetos con las pupas alineadas bajo un microscopio de disección. Inserte la aguja en el tubo de inyección del femtojet y apriete el cabezal de agarre.
- Mirando la aguja bajo el microscopio, encienda el femtojet y configure los parámetros de inyección de Pc y Pi girando las perillas giratorias.
NOTA: Se recomienda un valor de Pc de 600 hPa para un flujo continuo del líquido. El valor de Pc depende de la apertura de la aguja. Para las agujas preparadas utilizando los parámetros indicados en el tirador de agujas P-1000, los valores de Pc entre 500 hPa y 700 hPa producen un flujo constante. Si se requieren valores más bajos de Pc, esto indica que la abertura puede ser demasiado grande y podría dañar a los insectos, mientras que los valores más altos indican que la aguja todavía está cerrada, o que la abertura es demasiado pequeña. - Inserte cuidadosamente la aguja entre los 2 y 3 segmentos abdominales visibles con un ángulo vertical de aproximadamente 30° (Figura 1E). Inyecte con un flujo continuo hasta que todo el abdomen se vuelva rosado en el caso de las pupas de etapa blanca, o hasta que el abdomen aumente de tamaño en el caso de las pupas negras. Deje de inyectarse cuando esté claro que el abdomen no puede tomar más líquido, o cuando el líquido comience a fluir fuera del cuerpo. Muévase con cuidado a la siguiente pupa y repita estos pasos.
NOTA: Evite tocar y dañar el ovipositor con la aguja durante la inyección. - Transfiera el portaobjetos con las pupas inyectadas a una placa de Petri que contenga una toalla de papel empapada con agua desionizada para mantener la humedad. Tapar el plato con su tapa, y colocarlo a 25 °C hasta la aparición de la avispa (Figura 1F).
5. Inyección pupal con tubo aspirador
- Calcule la cantidad de mezcla de inyección utilizando el factor: 4 pupas inyectadas/1 solución de μL.
NOTA: Una inyección típica de 20-30 pupas requiere ~ 5-8 μL de ribonucleoproteína (RNP) mezcla de complejo-saponina o RNP con BAPC12. - Alinee las pupas, como se sugiere en la sección 2, y coloque un portaobjetos con las pupas alineadas bajo un microscopio de disección (Figura 1E).
- Tome una de las agujas capilares y rompa la punta entre dos portaobjetos de vidrio, como se indica en el paso 3.4(Figura 1D). Asegúrese de que la punta de la aguja esté lo suficientemente abierta como para permitir que la solución inyectable se ata soplando aire con la boca, pero no demasiado abierta para evitar perder líquido y dañar las pupas (Figura 1E).
NOTA: Este paso es crítico porque el usuario va a utilizar el aire de la boca para empujar la mezcla de inyección en la hemolinfa de insectos. Es mejor practicar para determinar qué tipo de apertura de aguja es óptima para la viscosidad de una mezcla de solución en particular. Cinco series de inyecciones de 20 pupas por serie pueden ser suficientes para acostumbrarse al sistema de inyección bucal. - Cargue una aguja con la solución de ribonucleoproteína12 usando una punta de microcarga e inserte la aguja en el paquete conector del conjunto del tubo del aspirador.
NOTA: Durante la demostración, la aguja se carga con BAPC-Cas9-sgRNA apuntando al gen del cinabrio de Nasonia 12. - Inserte cuidadosamente la aguja entre los 2 y 3 segmentos abdominales visibles con un ángulo vertical de aproximadamente 30° (Figura 1E). Inyecte con un flujo continuo hasta que todo el abdomen se vuelva rosado en el caso de las pupas de etapa blanca o hasta que el abdomen aumente de tamaño en el caso de las pupas negras. Deje de inyectarse cuando esté claro que el abdomen no puede tomar más líquido o cuando el líquido comience a fluir fuera del cuerpo. Vaya con cuidado a la siguiente pupa y repita estos pasos
NOTA: Evite tocar y dañar el ovipositor con la aguja durante la inyección. - Transfiera el portaobjetos con las pupas inyectadas a una placa de Petri que contenga una toalla de papel empapada con agua desionizada para mantener la humedad. Tapar el plato con su tapa y colocarlo a 25 ºC hasta la aparición de la avispa (Figura 1F).
6. Inyección para adultos con tubo aspirador
- Para la preparación de adultos, grupos separados de 20 hembras vírgenes en un pequeño tubo de ensayo limpio con un pincel fino. Coloque el tubo sobre hielo durante 5 minutos hasta que las hembras sean anestesiadas. Alternativamente, las hembras pueden ser anestesiadas e inyectadas usando CO2.
NOTA: El hielo es preferible como anestésico ya que las avispas adultas son tolerantes al frío y se recuperan fácilmente después de las inyecciones. Las hembras pueden tomar más líquido inyectado que las pupas: 1 μL de solución se puede utilizar para tres hembras en lugar de para cuatro pupas. Prepare los volúmenes en consecuencia. - Prepare un cubo de hielo, colocando un portaobjetos de vidrio en la parte superior del hielo. Alinee las hembras una al lado de la otra en el tobogán frío con los abdomenes hacia arriba (Figura 1E) bajo un alcance de disección.
- Cargue una aguja con la solución de ribonucleoproteína12 usando una punta de microcarga e inserte la aguja en el paquete conector del conjunto del tubo del aspirador. Apoye a las hembras desde el lado opuesto con agujas de disección embotada mientras inyecta lentamente en el abdomen desde el otro lado. Evite tocar el ovipositor, esto dañará severamente esta estructura reproductiva crítica (Figura 1E).
Nota : cualquier orientación es aceptable, dependiendo de la preferencia del operador. - Inserte cuidadosamente la aguja entre los 2 y 3 segmentos abdominales visibles con un ángulo vertical de aproximadamente 30° (Figura 1E). Inyecte la solución en el abdomen femenino, deteniéndose cuando no pueda entrar más líquido, o cuando se observe una fuga de la solución sobrante. Muévase con cuidado a la siguiente avispa y repita estos pasos
NOTA: Inyecte lentamente, dejando la aguja dentro del abdomen durante aproximadamente 3 s antes de retirarla muy lentamente. Esto ayudará a ajustar la presión interna del líquido y evitará que la solución se escape del sitio de inyección después de la extracción de la aguja. - Cuando termine, transfiera suavemente hembras inyectadas individuales a un nuevo tubo con un huésped usando un pincel. Dejar recuperar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h, confirmando la supervivencia, y luego devolver los tubos a la incubadora de cría.
NOTA: Durante la demostración, la aguja se carga con BAPC-Cas9-sgRNA apuntando al gen del cinabrio de Nasonia 12.
7. Atención postinyección y detección de mutantes
- Después de la eclosión adulta de las pupas inyectadas, coloque las avispas individuales en un tubo de vidrio tapado con algodón e inserte un huésped S. bullata (Figura 1G). En contraste, coloque a las hembras inyectadas en tubos individuales con huéspedes inmediatamente después de la inyección.
- Para los experimentos knockout CRISPR/Cas9, permita que las hembras parasiten a los huéspedes durante un día y reemplace al huésped cada día durante tres días consecutivos.
NOTA: Debido al sistema de determinación de sexo haplodiploide en N. vitripennis16,las hembras vírgenes producirán crías masculinas haploides, lo que facilita la detección de mutaciones. Para la caída a través de RNAi de genes específicos del hombre, los individuos inyectados pueden ser singularmente apareados con individuos de tipo salvaje y se les permite parasitar a los huéspedes. Utilice un host por día y reemplace los hosts en función de la configuración experimental. - Colocar los huéspedes parasitados a 25 °C hasta la aparición de la descendencia masculina G0 (durante ~13-14 días).
- Bajo un microscopio de disección, examine a los varones G0 para los fenotipos transformados. El gen cinabrio es responsable de la pigmentación ocular12:las avispas con ojos marrones son de tipo salvaje, y las avispas con ojos rojos brillantes o variaciones entre ojos rojos y marrones son mutantes(Figura 1H).
8. Cruces postinyección y crianza
- Coloque todos los machos mutantes G0 con ojos rojos (el gen cinabrio 12fenotípicamente interrumpido) con hembras vírgenes de tipo salvaje durante 1-2 días(Figura 2A).
NOTA: Si el gen interrumpido no confiere un fenotipo visible, se requiere la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) seguida de la secuenciación del gen diana para identificar a los animales mutantes. Antes de obtener el ADN de machos G0 para PCR, lo ideal sería aparearlos con hembras vírgenes de tipo salvaje. Alternativamente, extraiga adn de una pierna de un macho G0 para identificar mutantes, y aparearse sólo aquellos con mutaciones verificadas. - Añadir dos hospedadores de S. bullata por hembra, y dejar ovipositar a 25 °C y 30% de humedad relativa con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12. Reemplace los hosts cada 2-3 días.
- Almacene los huéspedes parasitados a 25 °C y 30% de humedad relativa, con un ciclo claro-oscuro de 12:12 durante ~ 10 días.
- Después de ~ 10 días, abra el huésped parasitado con una aguja de disección y retire cada pupa de N. vitripennis del huésped.
- Con la ayuda de un pincel de punta fina, seleccione pupas hembras (Figura 1A).
NOTA: Las hembras son diploides y heterocigotas, y por lo tanto el color de los ojos será de tipo salvaje.
- Colocar 15-20 pupas hembra en tubos de vidrio a 25 °C hasta la emergencia. Después de la emergencia, agregue ~ 20 S. bullata hosts y deje que las hembras vírgenes G1 parasitar a los anfitriones durante 2-3 días.
NOTA: Estas hembras producirán 50% G2 machos mutantes.- Almacenar hospedadores parasitados a 25 °C y 30% de humedad relativa, con un ciclo claro-oscuro de 12:12 hasta la aparición del adulto macho G2.
- Coloque las pupas G1 restantes a 5 °C durante 8-10 días. Después de este período, retíralos y colócalos a 25 °C y 30% de humedad relativa, con un ciclo claro-oscuro de 12:12 hasta la emergencia (Figura 2A).
- Después de la aparición de los machos G2 en el paso 8.3.1, pantalla para la presencia de fenotipo mutante de ojos rojos. Con la ayuda de un pincel de punta fina, separe a los machos de ojos rojos de los machos de tipo salvaje.
NOTA: La presencia de avispas de ojos rojos en esta generación (G2, Figura 2A)indica que la edición génica ocurrió en la línea germinal, y que la mutación es hereditaria. - Coloque los machos de ojos rojos con las hembras G1 recién emergidas en el paso 8.3.2 (Figura 2A), y déjelos aparearse durante 1-2 días. Agregue 2 S. bullata hosts por hembra, y colóquelos a 25 ° C y 30% de humedad relativa con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 durante 10-11 días.
- Después de 10-11 días, abra el huésped parasitado con una aguja de disección, y retire cada pupa de N. vitripennis del huésped (Figura 2A).
- Con la ayuda de un pincel de punta fina, separe las avispas de ojos rojos (machos y hembras) del tipo salvaje (Figura 1H). Continúe criando avispas de ojos rojos juntas en tubos de vidrio, y no mezcle con las avispas de tipo salvaje.
NOTA: En esta etapa (G3, Figura 2A),los machos haploides y las hembras diploides portan y muestran fenotipos para las mutaciones del cinabrio. Si el gen afectado codifica para un fenotipo invisible, cruce G0 macho singularmente con una hembra de tipo salvaje durante ~1 día. Luego, retire el macho para la caracterización molecular de la mutación por PCR y secuenciación, y deje que la hembra parasparasite a un huésped. Continuar el esquema de cruce sólo con la descendencia de un macho mutante confirmado (Figura 2B). Si el objetivo es la caída por RNAi de un gen candidato, realice el ensayo funcional deseado (como letalidad, esterilidad o ensayo de inducción de diapausa3,7)directamente utilizando individuos inyectados con dsRNA. Como el ARNi es transitorio, no es posible generar una colonia con el fenotipo deseado(Figura 2C)3,7.
Figura 1: Cronología para la microinyección pupal y adulta de Nasonia vitripennis. (A)Se recogen pupas masculinas y femeninas blancas (arriba) y negras (abajo),(B-C)alineadas y pegadas a un portaobjetos de vidrio para inyección. (D)La aguja capilar se prepara y se abre, deslizándola sobre dos portaobjetos superpuestos. (E)La aguja está unida al Femtojet (arriba) o a un tubo aspirador (abajo) para inyecciones. (F) Las pupas inyectadas en el portaobjetos se transfieren a una placa de Petri con un tejido húmedo en la parte inferior para mantener la humedad. Tras la emergencia,(G)las hembras se colocan singularmente en pequeños tubos de vidrio y se les permite ovipositar en Sarcophaga pupa. (H)Cribado de la descendencia para detectar mutantes. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2:Esquema de cruce después de la inyección. Representación esquemática del procedimiento de esquema de cruce en el caso de la edición génica mediada por CRISPR/Cas9 de genes (A) que inducen un fenotipo visible y (B) que no confieren fenotipo visible. (C) Representación esquemática del procedimiento de cribado de RNAi. Abreviaturas: cin = cinabrio; PCR = reacción en cadena de la polimerasa. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Representative Results
Este papel presenta dos métodos fáciles para la microinyección pupal y adulta, usando un femtojet o un tubo del aspirador. El primer método permite una inyección más precisa de líquido, que es importante para la consistencia de RNAi, mientras que el segundo permite la inyección de mayores cantidades de líquido en pupas nasonia o adultos.
Los resultados representativos presentados en la Tabla 1 muestran buenas tasas de supervivencia (de 20% a 89%) y la eficiencia de obtener el fenotipo deseado (ya sea derribo a través de RNAi o edición de genes a través de CRISPR) utilizando los métodos de inyección descritos aquí sin requerir inyecciones de huevo laboriosas.
| etapa | Reactivo | Concentración ng/μL (Proteína/gRNA o dsRNA) | N inyectado | N Supervivencia (%) | Individuos inyectados que ponen descendencia | Individuos inyectados que producen descendencia con fenotipos | Descendencia que muestra fenotipos de knockdown/knockout | ||||
| N | % | N | % del total inyectado | % de los individuos que producen descendencia | N | Mutantes/ pupas inyectadas o adultos | |||||
| Pupas blancas | dsRNA* | 3000-4000 | 80 | 69 (86%) | 69 | 100% | 45 | 56% | 65% | 1263 | Na |
| Pupas negras | Cas9 | 2903/2741 | 39 | 34 (87%) | 19 | 49% | 2 | 5% | 11% | 2 | 0.05 |
| P2C-CAS9-EGFP** | 454/227 | 40 | 6 (15%) | 2 | 5% | 1 | 3% | 50% | 3 | 0.08 | |
| P2C-Cas9 | 725/750 | 28 | 28 (100%) | 16 | 57% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC | 500/200 | 20 | 11 (55%) | 9 | 45% | 3 | 15% | 33% | 5 | 0.25 | |
| BAPC | 400/600 | 20 | 17 (85%) | 10 | 50% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC | 360/360 | 20 | 16 (80%) | 16 | 80% | 2 | 10% | 13% | 3 | 0.15 | |
| 24 h-48-h-viejo adulto | Cas9 | 2769/3290 | 11 | 10 (90%) | 1 | 9% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 |
| P2C-CAS9-EGFP | 454/227 | 34 | 30 (89%) | 12 | 35% | 3 | 9% | 25% | 3 | 0.06 | |
| P2C-Cas9 | 2903/3076 | 36 | 36 (100%) | 17 | 47% | 4 | 11% | 24% | 4 | 0.05 | |
| *RNAi experiments were performed on males that were then mated to non-injected wildtype females. Por lo tanto, los números reperesentes el número de cruces que produjeron descendencia y los que produjeron fenotipos. | |||||||||||
| ** Muy primera inyección en pupas por los autores. Abreviaturas: dsRNA = ARN de doble cadena; EGFP = proteína fluorescente verde aumentada; BAPC = cápsulas anfifílicas ramificadas del péptido. | |||||||||||
Tabla 1: Tasa de supervivencia y eficiencia de RNAi y CRISPR/Cas9 mediante inyecciones pupales y adultas. La eficiencia en experimentos de ARNi representa la eficiencia en la caída del gen de interés, confiriendo un efecto medible como la distorsión de la relación desexos 3. Para CRISPR/Cas9, la eficiencia representa el número de hembras inyectadas que producen descendencia mutante. Abreviaturas: dsRNA = ARN de doble cadena; gRNA = ARN guía; EGFP = proteína fluorescente verde aumentada; BAPC = cápsulas anfifílicas ramificadas del péptido.
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Discussion
Con el reciente aumento del uso de Nasonia vitripennis como organismo modelo para diversas cuestiones biológicas2,3,7,17,existe la necesidad de desarrollar y optimizar los métodos de inyección para permitir un protocolo simplificado y eficiente para el análisis funcional de los genes de N. vitripennis. Los métodos actuales que involucran la microinyección embrionaria de reactivos de edición genética son desafiantes13, que requieren equipo especializado y personal altamente capacitado. Por lo tanto, para hacer que la tecnología de edición genética sea más accesible para los laboratorios no especializados, es fundamental desarrollar enfoques alternativos de administración de reactivos CRISPR. Por lo tanto, aquí se demuestra una técnica visual detallada que describe dos procedimientos de inyección alternativos para permitir la administración de reactivos de edición (CRISPR /Cas9 o dsRNA) en la hemolinfa de insectos y los ovarios.
La inyección de dsRNA en el hemocoel del insecto es un acercamiento común para entregar el dsRNA en varias especies de artrópodos18,19,20,21,22. También es eficiente en N. vitripennis cuando se utiliza en pupas blancas, como se informó anteriormente3,7. Los métodos CRISPR/Cas9 para la mutagénesis de insectos de línea germinal se basan casi exclusivamente en microinyecciones embrionarias. Se han reportado pocos experimentos exitosos que suministran reactivos CRISPR en ninfas o adultos12,23,24,25,26,27. En general, los métodos descritos aquí ofrecen una serie de beneficios significativos con respecto a los métodos existentes13. En primer lugar, permiten la inyección de varias etapas de desarrollo de las avispas N. vitripennis: pupas blancas, negras y adultos. Además, la inyección en la hemolinfa permite la caída a través de RNAi o la edición de genes de línea germinal a través de CRISPR, evitando las microinyecciones embrionarias.
El primer paso en este protocolo es determinar y examinar las avispas nasonia para la etapa de desarrollo correcta basada en la prueba funcional de interés (por ejemplo, edición del genoma, RNAi). Es importante acostumbrarse a identificar ambos sexos en pupas blancas y oscuras y adultos. Las hembras de N. vitripennis ponen hasta cincuenta huevos en el caso pupal de la luciérna, S. bullata,y las pupas de avispa se pueden recolectar y tampar fácilmente en grandes cantidades, a partir de la etapablanca. Además, la posibilidad de almacenar pupas en diferentes etapas para ralentizar la tasa de desarrollo durante semanas a 5 ºC hace que el sistema sea muy flexible en términos de tiempo y organización9.
La supervivencia de pupas y adultos tras la inyección es un aspecto que debe ser optimizado por los usuarios. Por ejemplo, en este protocolo, la primera inyección de reactivos CRISPR/Cas9 en pupas afectó drásticamente la supervivencia (15%) en comparación con la supervivencia de adultos inyectados (90%). Sin embargo, en la segunda sesión, la supervivencia de las pupas aumentó hasta un 60%. Después de varias sesiones de inyección, fue posible mantener una supervivencia similar (80%-100%) después de inyectar pupas o adultos. De hecho, la supervivencia después de la inyección se puede mejorar si se optimizan los parámetros relacionados con la alineación de las avispas, la selección de la abertura correcta para la aguja y evitar perforar o apuñalar las avispas con la aguja.
Alinear y preparar pupas y hembras para inyecciones, según el protocolo presentado aquí, puede reducir la mortalidad. Además, el método presentado para alinear las pupas inmóviles entándolas en el portaobjetos puede facilitar el proceso de inyección, ya que evita que se muevan durante la inyección. Por lo tanto, las pupas se pueden inyectar muy rápidamente, superando la naturaleza lenta de los pasos involucrados en las microinyecciones embrionarias. Además, como las inyecciones se pueden hacer con un aspirador bucal, no se requiere equipo especializado para lograr eventos de edición de genes. Sin embargo, esta técnica requiere que las avispas se coloquen de manera oportuna en el pegamento; de lo contrario, no se unirán correctamente y se deslizarán de la corredera durante la inserción de la aguja. Esto se puede corregir después de varios ensayos de alineación.
Los adultos no pueden alinearse usando este método porque pueden mover su abdomen y piernas; por lo tanto, necesitan ser anestesiados. El método preferido de elección en este protocolo consiste en colocar el tubo que contiene las avispas en hielo durante ~ 5 minutos hasta que las avispas sean derribadas, y luego transferirlas en grupos a un portaobjetos preenfriado sobre hielo. Este método permite la alineación y preparación de las avispas para inyección en grupos de 10-15 avispas orientadas hacia arriba, con una nueva placa de Petri que contiene hielo para cada nuevo grupo de inyección. Prevenir el derretimiento del hielo durante la inyección ayudará a mantener el portaobjetos estable y disminuirá el riesgo de romper las agujas o matar a las avispas por accidente. Este paso se puede mejorar mediante el uso de una mesa de refrigeración, si es accesible.
Alternativamente, las almohadillas de CO2 se pueden usar para anestesiar las avispas. Para ello, sería necesario optimizar el tiempo de exposición al CO2 durante la inyección y determinar los efectos de la exposición al CO2 sobre la supervivencia y la fertilidad, como se informó anteriormente para otras especies18. Un obstáculo adicional al inyectar a los adultos se basa en el método utilizado para mantener la avispa anestesiada para inyección. Un objeto de punta roma que puede sostener la avispa sin el riesgo de perforación o apuñalamiento es el más adecuado. En general, las agujas de disección o los descórceps contundentes funcionan bien.
Después de que se domine la alineación y la sutención adecuada de las avispas, el proceso de inyección puede proceder muy rápidamente. Las pupas y las inyecciones de adultos se pueden inyectar con volúmenes de solución en el rango de cientos de nanolitros, facilitando su preparación a diferentes concentraciones según la preferencia del usuario. Sin embargo, es importante usar agujas adecuadas para inyectar la cantidad correcta de líquido sin el riesgo de dañar y matar a la avispa. En general, las agujas muy largas con aberturas muy pequeñas son mejores porque causan menos daño físico al abdomen de las pupas. Además, el flujo del líquido es lento, evitando grandes cambios en la presión y lo más importante, evitando la fuga de la solución a través del agujero creado por la aguja.
Las desventajas de una apertura pequeña son que las agujas pueden romperse fácilmente al tocar el exoesqueleto duro de las avispas y también pueden obstruirse con el material del interior del abdomen. Por lo tanto, las agujas de pequeña apertura funcionan muy bien usando un femtojet o un nanoject, y su uso requiere un gran cuidado para evitar romperlas. Estas agujas no son adecuadas para un aspirador bucal porque es muy difícil inyectar líquido con la boca a través de una pequeña abertura. Para este método, la aguja ideal requiere la apertura mínima que permite que la solución fluya suavemente mientras previene el daño que se puede causar con una aguja de apertura grande. Una vez más, este aspecto debe ser optimizado por los usuarios. En cualquier caso, cambiar la aguja a menudo ayudará a evitar la obstrucción y dañar la punta que disminuirá la supervivencia y la eficiencia.
En N. vitripennis, cualquier lugar en el abdomen se puede utilizar para entregar reactivos en la hemolinfa. Sin embargo, se debe tener cuidado adicional para evitar daños en el ovipositor de la avispa, ya que se utiliza para la alimentación y la puesta de huevos. Tanto para pupas como para adultos, se han sugerido técnicas de inmovilización en este protocolo para permitir la inyección lejos del ovipositor, principalmente en la zona ventral hacia la parte anterior del abdomen. Además, en los adultos, esto también se puede lograr mediante la inyección en los lados o en la zona dorsal. El método de alineación para las pupas descrito aquí puede facilitar la inyección lateral, pero no dorsal. En cualquier caso, los esfuerzos para evitar perforar otras partes del cuerpo o dañar el abdomen son una prioridad.
Una vez que se inserta la aguja, el flujo del líquido debe ser lento y constante. El femtojet permite esto fácilmente, aunque la presión puede tener que ser ajustada para cada aguja. Cuando se usa un aspirador bucal, se debe evitar la inyección de grandes cantidades de líquido demasiado rápido porque esto puede hacer que se filtre a través del poro de la inyección. De hecho, además de observar la hinchazón del abdomen con líquido, la fuga es una señal para detener una inyección. Después de que termine la inyección, las avispas adultas deben dejarse en el portaobjetos hasta que se recuperen y luego transferirse a un tubo con huéspedes.
Los sistemas presentados aquí se pueden adaptar fácilmente a otras especies de insectos que son particularmente desafiantes para las microinyecciones de huevos. Por ejemplo, muchas avispas parasitoides ponen huevos en otras larvas de insectos. Por lo tanto, los huevos son imposibles de alcanzar e inyectar en esas especies. Los huevos de otras especies de plagas, como el psílido asiático de los cítricos Diaphorina citri, también son muy difíciles de alcanzar para inyección porque están unidos a la planta donde se ponen. Un informe reciente sugiere que BAPC se puede utilizar para la edición del gen CRISPR en el psílido asiático de los cítricos, D. citri27. Del mismo modo, la administración mediada por P2C de la proteína, mCherry, se logró en los ovarios de esta especie28,lo que sugiere que estas técnicas de inyección descritas aquí podrían facilitar la implementación de RNAi y CRISPR en una amplia gama de especies de plagas de insectos y ayudar en el diseño de estrategias de control que ayudan a prevenir el daño al cultivo asociado con ellos.
La implementación en otras especies requiere optimización basada en el ciclo de vida de la especie de interés. Por ejemplo, es importante establecer la etapa correcta de la inyección también basada en la prueba funcional de interés. Así, para la entrega de CRISPR/Cas9 en ovarios, es importante saber cuándo está activa la vitelogénesis para permitir la absorción de los reactivos de edición génica por los ovarios24,25,26,27,28. En contraste, para una caída eficiente, es importante saber cuándo el gen está expresado y funcional. La implementación futura de esas técnicas de inyección podría implicar la entrega de diferentes tipos de ácidos nucleicos, como el ADN plásmido, en hemolinfas y ovarios de insectos. Esto permite promover la expresión transitoria de genes presentes en el ADN del plásmido. Además, la combinación de reactivo CRISPR/Cas con una plantilla de ADN podría ayudar a mediar la transgénesis a través de la reparación dirigida por homología (HDR) o inducir una transgénesis mediada por transposones, eludiendo la microinyección embrionaria. En conclusión, esta técnica mejorada se puede utilizar para generar muchos tipos de análisis funcionales, tales como derribo vía RNAi, inducción de mutaciones, deleciones, y posiblemente incluso inserciones transgénicas para generar N. vitripennistransgénicos, asociando transposones con BAPC, lo que debería acelerar en gran medida la investigación funcional en este organismo.
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Disclosures
JLR y DCR han solicitado la protección provisional de patentes sobre la tecnología de control ReMOT. O.S.A es fundador de Agragene, Inc., tiene una participación accionaria y forma parte del Consejo Asesor Científico de la compañía. Todos los demás autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por los fondos de inicio de UCSD dirigidos a O.S.A. y NSF / BIO 1645331 de subvenciones a J.L.R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
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