Summary
Burada, Nasonia vitripennis'te etkili pupal ve yetişkin enjeksiyonları için yöntemleri embriyo mikroenjeksiyonuna erişilebilir alternatifler olarak tanımlıyoruz ve RNA paraziti (RNAi) yoluyla RNA susturma veya CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi yoluyla gen nakavt kullanarak ilgi genlerinin fonksiyonel analizini sağlıyoruz.
Abstract
Mücevher eşekarısı, Nasonia vitripennis, haplo-diploid cinsiyet tayini, B kromozomu biyolojisi, konak-symbiont etkileşimleri, speciation ve zehir sentezinin epigenetiklerini incelemek için verimli bir model sistemi haline gelmiştir. CRISPR/Cas9 da dahil olmak üzere çeşitli moleküler araçların mevcudiyetine rağmen, fonksiyonel genetik çalışmalar bu organizmada hala sınırlıdır. CRISPR/Cas9 teknolojisinin N. vitripennis'te uygulanmasının başlıca sınırlaması embriyonik mikroenjeksiyonların zorluklarından kaynaklanmaktadır. Embriyo enjeksiyonları, küçük embriyo büyüklüğü ve embriyonik gelişim için konak pupa gereksinimi nedeniyle, bu organizmada ve genel olarak birçok parazitoid eşekarısında özellikle zordur. Bu zorlukları ele almak için Cas9 ribonikleoprotein, embriyonik mikroenjeksiyon yerine yetişkin enjeksiyonu ile kadın yumurtalıklarına karmaşık doğum optimize edildi ve bu da hem somatik hem de kalıtsal germline düzenlemelerine neden oldu. Enjeksiyon prosedürleri, ReMOT Kontrolü (Reseptör Aracılı Yük Transdüksiyonu) veya BAPC (Dallı Amfifilik Peptit Kapsülleri) kullanılarak pupa ve dişi eşekarısında optimize edildi. Bu yöntemlerin embriyo enjeksiyonuna etkili alternatifler olduğu, bölgeye özgü ve kalıtsal germline mutasyonlarına olanak sağladığı gösterilmiştir.
Introduction
CRISPR / Cas9 gen düzenleme, özellikle mücevher yabanatı, Nasonia vitripennisgibi birçok yükselen model organizmada fonksiyonel genetik çalışmalar için güçlü bir teknolojidir. Yetiştirme kolaylığı ve tam bir genomun mevcudiyeti, mücevher yaban arısını farklı biyolojik süreçlerin moleküler mekanizmalarını aydınlatan önemli bir deneysel sistem haline getirir. Örneğin, N. vitripennis son zamanlarda haplodiploid cinsiyet belirleme sisteminin epigenetik temelini çözmek için kullanılmıştır1,2, B kromozomlarının biyolojisi3,4,5,6ve sirkadiyen ve mevsimsel düzenlemenin genetik temeli7,8. N. vitripennis'i çalışmaya elverişli kılan özelliklerden bazıları arasında kısa nesil süre (~2 hafta 25 °C), yüksek üreme oranları, pupal aşamasında kolay cinsiyet ayrımı ve suşları 4 °C'de diapause ve depolama yeteneği bulunur. Yaşam döngüsü, dişi eşekarısının blowfly, Lahit bullata'nınpupalarını parazitleştirmesiyle başlar. Ovipozitörleri aracılığıyla dişiler, üfleme üflemeli pupal durumunda 50'ye kadar yumurta bırakırlar. Yumurtalar S. bullata pupa ile beslenen larvalara dönüşür, önümüzdeki birkaç gün boyunca gelişmeye devam eder ve daha sonra yavrular, ardından yetişkin eklozyonu ve konak puparium9'danortaya çıkar.
RNA girişim (RNAi) 10 ve CRISPR/Cas9 11,12 gibi N. vitripennis'tefonksiyonel genetik çalışmalar yapmak için moleküler araçlar mevcuttur, ancak öncelikle embriyonik mikroenjections13'ün gerçekleştirilmesinde zorluklar nedeniyle sınırlıdır. N. vitripennis yumurtaları gelişim için bir pupal konak gerektirdiği için yumurta manipülasyonu çok zordur. Pre-blastoderm evre embriyoları konak üflemeli pupalardan toplanmalı, hızlı bir şekilde mikroenjeze edilmeli ve hemen geliştirme için ana bilgisayara geri aktarılmalıdır13. Bu adımlar, mikroenjected embriyolara veya pupal konaklarına zarar vermemek için hassas ve özel eğitim gerektirir13. Dahası, yumurtalar çok küçük ve kırılgandır, özellikle mikroenjections sonra, enjekte iğnesinin sürekli tıkanması neden olan çok viskoz bir sitoplazmaile 13. Bu özellikler embriyonik mikroenjections son derece zorlu hale getirir, yüksek eğitimli operatörler ve çoğu N. vitripennis laboratuvarlarında bulunmayan özel ekipman gerektirir.
CRISPR reaktiflerinin teslimi için alternatif enjeksiyon yöntemlerinin optimizasyonu, N. vitripennis'in bir model organizma olarak birleştirilmesine katkıda bulunacaktır. Pupaların ve yetişkinlerin manipülasyonu embriyoları manipüle etmekten daha az zordur ve temel bir enjeksiyon kurulumu ile gerçekleştirilebilir. Burada, pupa ve yetişkinlerin enjeksiyonu için iki protokol tanımlanmıştır: biri enjeksiyonlar için özel ekipman içeren, diğeri ise cam kılcal iğne ile donatılmış bir aspiratör tüp tertibatının kullanımını içeren. Aspiratör tüpünün kullanımı özellikle embriyo mikroenjections için özel ekipmana erişimi olmayan laboratuvarlar için uygundur. Beyaz veya siyah pupalar ve yetişkin eşekarısı da dahil olmak üzere N. vitripennis'infarklı gelişim aşamalarının verimli enjeksiyonları gösterilmiştir. Beyaz pupal aşamasındaki eşekarısı özellikle RNAi aracılı nakavt deneyleri için uygundur. Nasonia'daki RNAi ilk olarak Lynch ve Desplan tarafından 200610'datanımlanmış olmasına rağmen, RNAi enjeksiyonlarının nasıl yapıldığına dair görsel bir prosedür yoktur. RNAi son zamanlarda B kromozomu PSR (Paternal Sex Ratio)3'ün haploidizer genini keşfetmek ve saat geninin tutulumunun incelenmesi için kullanıldı, nokta, N. vitripennis biyolojik ritimlerinde7.
Siyah pupa ve yetişkin eşekarısı, ReMOT Kontrolü (Reseptör Aracılı Kargo Transdüksiyonu) ve BAPC (Dallı Amfifilik Peptit Kapsülleri) protokollerini kullanarak CRISPR/Cas9 germline gen düzenlemesini teşvik etmek için kullanılabilir. Bu iki yumurtalık doğum yönteminin son zamanlarda Nasonia'da hedef gende germline mutasyonları üretmek için etkili olduğu tanımlanmıştır, cinnabar7,12. Burada, nasonia'da ve muhtemelen diğer parazitoid eşekarısılarda fonksiyonel genetik çalışmalar üretmek için kullanılabilecek hem pupal hem de yetişkin enjeksiyonları için, özel ekipman gerektirmeden ve embriyonik mikroenjeksiyonları atlayarak adım adım bir metodolojinin görsel prosedürünü içeren enjeksiyonlar için basitleştirilmiş bir protokol sağlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nasonia yetiştirme
- Pamukla tıkanmış küçük cam test tüplerinde ~20 çift dişiyi tekil olarak kurun.
NOT: Yetiştirme alanını azaltmak için 10 x 85 cm, 4 mL tüpler en uygun olanıdır. Dişiler, daha büyük kanatlar ve ovipositör varlığı nedeniyle erkeklerden kolayca ayırt edilir (Şekil 1A). N. vitripennis yetiştirmek için ayrıntılı protokoller diğer literatürde de bulunabilir13,14,15.- Tüp başına iki S. bullata konakçısı ekleyin ve eşekarısını 25 ± 1 °C ve% 30 bağıl nemde, 2-3 gün boyunca 12:12 açık-karanlık bir döngü ile koruyun.
NOT: Yaban arıları daha düşük sıcaklıkta veya oda sıcaklığında tutulabilir; ancak, geliştirme yavaşlatılacaktır.
- Tüp başına iki S. bullata konakçısı ekleyin ve eşekarısını 25 ± 1 °C ve% 30 bağıl nemde, 2-3 gün boyunca 12:12 açık-karanlık bir döngü ile koruyun.
- 2-3 gün sonra, ince uçlu bir boya fırçası yardımıyla, yavru gelişiminde sürekli yumurtlama ve asenkronluktan kaçınmak için dişileri hafifçe çıkarın.
NOT: Çıkarılan dişiler isteğe bağlı olarak bir aya kadar 5 °C'de yeniden barındırılabilir veya saklanabilir.- Parazitlenmiş konağı 25 ° C'de ve% 30 bağıl nemde, istenen enjeksiyon aşaması beyaz pupa gerektiriyorsa 7 gün boyunca 12:12 açık-karanlık bir döngü ile koruyun; gerekli gelişim aşaması siyah pupa ise 13 gün boyunca; veya genç, yeni ortaya çıkan yetişkinler için 14 gün.
NOT: Sarı ve siyah pupalar da bir haftaya kadar 5 °C'de saklanabilir. Daha uzun depolama, gelecek nesil için larvalarda diapause sıklığını artıracak, enjeksiyon sonrası taramayı ve mutant hatlarının kurulmasını zorlaştıracaktır. - N. vitripennis pupaları ve yetişkinleri istenen aşamada kurtarmak için konak pupariumunu bir diseksiyon iğnesi ile açın (Şekil 1A).
NOT: Belirli bir yetişkin yaştaki enjeksiyonlar veya bakire kadınların toplanması için, 13.
- Parazitlenmiş konağı 25 ° C'de ve% 30 bağıl nemde, istenen enjeksiyon aşaması beyaz pupa gerektiriyorsa 7 gün boyunca 12:12 açık-karanlık bir döngü ile koruyun; gerekli gelişim aşaması siyah pupa ise 13 gün boyunca; veya genç, yeni ortaya çıkan yetişkinler için 14 gün.
2. Beyaz ve siyah pupaların hizalanması
- Merkeze bir dizi okul yapıştırıcısı uygulayarak cam bir slayt hazırlayın. Pupayı hizalamak için kullanılacak kalın bir tabaka elde etmek için yapıştırıcıyı bir diseksiyon iğnesi ile yayın (Şekil 1B). Pupayı aktarmadan önce tutkalın ~2 dakika kurumasına izin verin.
NOT: Yapıştırıcıyı aşırı sıkma, aksi takdirde pupalar slayda düzgün bir şekilde takılmaz ve enjeksiyonlar sırasında kayacaktır. - Bir diseksiyon mikroskobu altında, diseksiyon iğnesini kullanarak, pupa başının arkasına tutkal uygulayın.
- Pupayı, karnı yukarı bakacak şekilde slayttaki tutkal tabakasına takın. Slaytta 20-30 pupayı yan yana hizalayın (Şekil 1C).
NOT: Karına tutkalla dokunmaktan kaçının ve pupaları tutkalın içine batırmaktan kaçının; aksi takdirde, yetişkinler ortaya çıkamayacaktır. - Pupa ile kaydırağı bir Petri kabına yerleştirin ve tutkalın ~10 dakika kurumasını bekleyin. Enjeksiyonlara başlamadan önce, pupaların yapıştırıcıya yapışmasını, diseksiyon iğnesi ile hafifçe iterek test edin. Pupaların çoğu gevşetilirse, yeni bir slayt hazırlayın. Alternatif olarak, gevşek olan tüm pupaları çıkarın ve slayda düzgün bir şekilde tutturulmuş olanları enjekte etmeye devam edin.
3. İğne hazırlama
- Bir kılcal cam tüpü bir iğne çekeceğine yükleyin ve üreticinin talimatlarına uyarak iğneleri çekin.
NOT: Bu gösteride P-1000 platin filament iğne çekeceği ve alüminyum silikat cam kılcal damarlar kullanılmaktadır. Bu cihazın kullanım kılavuzu (bkz. Malzeme Tablosu),kılcal cam tüplerin nasıl düzgün bir şekilde yüklendiğini ve bu cihaza programların nasıl kurulacaktır. Aşağıdaki parametreleri kullanın (Isı: 536; Çekme: 80; Vel: 100; Gecikme: 70) alüminyum silikat cam kılcal damarlarda sarı pupa, siyah pupa ve yetişkinler enjekte etmek için.
Ek olarak, P-2000 iğne çekeceği parametreleri takip eden kuvars iğneleri hazırlamak için kullanılmıştır(Isı: 805; Çekme: 145; Vel: 50; Gecikme: 145). Kılavuz, kılcal kuvars tüplerin yüklenmesi ve bu cihazdaki programların kurulumu için talimatlar sağlar. Bir çekmecinin yokluğunda, özelleştirilebilir kılcal cam mevcuttur. - Mikro doldurucu pipet uçlarını kullanarak iğneyi enjeksiyon karışımının 5 μL'si ile yükleyin (N. vitripennis'teRNAi10 veya CRISPR / Cas9 ribonucleoprotein12 (RNP) enjeksiyonları için önceki protokolleri takiben önceden hazırlanmıştır).
NOT: Gösteri sırasında iğne, beyaz evre pupa enjeksiyonu için kırmızı boya (bkz. Malzeme Tablosu)ve siyah pupa eşekarısı ve yetişkin enjeksiyonu için BAPC-Cas9-sgRNA ile birlikte çift telli RNA (dsRNA) ile yüklenir. Bu reaktifler cinnabar genini hedef alacak. Başarılı bir şekilde yere serilen / dışarı çıkan eşekarısı, vahşi tip kahverengi gözler yerine kırmızı gözler gösterecektir. - İğneyi açın, ucu üst üste binen iki slayttan yapılmış bir yüzeye kaydırın (Şekil 1D). Alternatif olarak, keskin bir kenar oluşturmak için veya eşekarısının toraksını veya karnını yavaşça delerek iğnenin ucunu bir çift ince tostiki ile açın.
4. Femtojet ile Pupal enjeksiyonu
- Slaydı hizalanmış pupa ile bir diseksiyon mikroskobun altına yerleştirin. İğneyi femtojetin enjeksiyon tüpüne yerleştirin ve kavrama kafasını sıkın.
- Mikroskop altındaki iğneye bakarak, femtojeti açın ve döner düğmeleri döndürerek Pc ve Pi enjeksiyon parametrelerini ayarlayın.
NOT: Sıvının sürekli akışı için 600 hPa'lık bir Bilgisayar değeri önerilir. Pc değeri iğnenin açılmasına bağlıdır. P-1000 iğne çekmede belirtilen parametreler kullanılarak hazırlanan iğneler için 500 hPa ile 700 hPa arasındaki pc değerleri sabit bir akış üretir. Pc'nin daha düşük değerleri gerekiyorsa, bu açıklığın çok büyük olabileceğini ve böceklere zarar verebileceğini gösterirken, daha yüksek değerler iğnenin hala kapalı olduğunu veya açıklığın çok küçük olduğunu gösterir. - İğneyi yaklaşık 30° dikey açıyla 2 ila 3 görünür karın segmenti arasına dikkatlice yerleştirin (Şekil 1E). Beyaz evre pupa durumunda tüm karın pembeleşene kadar veya siyah pupa durumunda karın büyüklüğü artana kadar sürekli bir akışla enjekte edin. Karın daha fazla sıvı alamayacağı açık olduğunda veya sıvı vücuttan akmaya başladığında enjekte etmeyi bırakın. Bir sonraki pupaya dikkatlice ilerleyin ve bu adımları tekrarlayın.
NOT: Enjeksiyon sırasında iğne ile ovipozitöre dokunmaktan ve zarar vermekten kaçının. - Enjekte edilen pupa ile kaydırağı, nemi korumak için deiyonize su ile ıslatılmış bir kağıt havlu içeren bir Petri kabına aktarın. Kabı kapağıyla örtün ve yabanarısı ortaya olana kadar 25 °C'yeyerleştirin (Şekil 1F).
5. Aspiratör tüpü ile Pupal enjeksiyonu
- Faktörü kullanarak enjeksiyon karışımının miktarını hesaplayın: 4 pupa enjekte edildi/1 μL çözelti.
NOT: Tipik bir 20-30 pupa enjeksiyonu, BAPC12ile ~ 5-8 μL ribonikleoprotein (RNP) kompleks-saponin karışımı veya RNP gerektirir. - Pupaları bölüm 2'de öner edildiği gibi hizalayın ve bir slaytı hizalanmış pupa ile bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin (Şekil 1E).
- Kılcal iğnelerden birini alın ve adım 3.4'te belirtildiği gibi iki cam slayt arasındaki ucu kırın (Şekil 1D). İğne ucunun ağızla hava üfleyerek enjeksiyon çözeltisinin dışarı çıkmasına izin vermek için yeterince açık olduğundan emin olun, ancak sıvı kaybetmemek ve pupalara zarar vermemek için çok açık olmasın (Şekil 1E).
NOT: Bu adım kritiktir, çünkü kullanıcı enjeksiyon karışımını böcek hemolimfine itmek için ağızdan hava kullanacaktır. Belirli bir çözelti karışımının viskozitesi için ne tür bir iğne diyaframının en uygun olduğunu belirlemek için pratik yapmak daha iyidir. Ağız enjeksiyon sistemine alışmak için set başına 20 pupalık beş set enjeksiyon yeterli olabilir. - Bir iğneyi ribonucleoproteinçözeltisi 12 ile bir mikro yükleme ucu kullanarak yükleyin ve iğneyi aspiratör tüpü tertibatının konektör paketine yerleştirin.
NOT: Gösteri sırasında iğne, Nasonia cinnabar geni12'yihedefleyen BAPC-Cas9-sgRNA ile yüklenir. - İğneyi yaklaşık 30° dikey açıyla 2 ila 3 görünür karın segmenti arasına dikkatlice yerleştirin (Şekil 1E). Beyaz evre pupa durumunda tüm karın pembeleşene kadar veya siyah pupa durumunda karın büyüklüğü artana kadar sürekli bir akışla enjekte edin. Karın daha fazla sıvı alamayacağı açık olduğunda veya sıvı vücuttan akmaya başladığında enjekte etmeyi bırakın. Bir sonraki pupaya dikkatlice gitme ve bu adımları yineleme
NOT: Enjeksiyon sırasında iğne ile ovipozitöre dokunmaktan ve zarar vermekten kaçının. - Enjekte edilen pupa ile kaydırağı, nemi korumak için deiyonize su ile ıslatılmış bir kağıt havlu içeren bir Petri kabına aktarın. Kabı kapağıyla örtün ve yabanarısı ortaya olana kadar 25 °C'ye yerleştirin (Şekil 1F).
6. Aspiratör tüpü ile yetişkin enjeksiyonu
- Yetişkin hazırlığı için, 20 bakire dişiden oluşan ayrı gruplar, ince bir boya fırçası ile temiz bir küçük test tüpünde. Dişiler uyuşturulup uyuşturuluna kadar tüpü 5 dakika boyunca buza yerleştirin. Alternatif olarak, dişiler CO2kullanılarak uyuşturulabilir ve enjekte edilebilir.
NOT: Yetişkin eşekarısı soğuğa dayanıklı olduğu ve enjeksiyonlardan sonra kolayca iyileştiği için anestezik olarak buz tercih edilir. Dişiler pupadan daha fazla enjekte edilmiş sıvı alabilir: Dört pupa yerine üç dişi için 1 μL çözelti kullanılabilir. Hacimleri buna göre hazırlayın. - Buzun üstüne bir cam slayt yerleştirerek bir buz kovası hazırlayın. Dişileri soğuk kaydırakta yan yana, karınları bir diseksiyon kapsamı altında yukarı bakacak şekilde hizalayın (Şekil 1E).
- Bir iğneyi ribonucleoproteinçözeltisi 12 ile bir mikro yükleme ucu kullanarak yükleyin ve iğneyi aspiratör tüpü tertibatının konektör paketine yerleştirin. Diğer taraftan karnına yavaşça enjekte ederken, dişileri körelmiş kesme iğneleriyle karşı taraftan destekleyin. Ovipozitöre dokunmaktan kaçının, bu kritik üreme yapısına ciddi şekilde zarar verecektir (Şekil 1E).
NOT: Operatör tercihine bağlı olarak her iki yönlendirme de kabul edilebilir. - İğneyi yaklaşık 30° dikey açıyla 2 ila 3 görünür karın segmenti arasına dikkatlice yerleştirin (Şekil 1E). Çözeltiyi dişi karın bölgesine enjekte edin, daha fazla sıvı giremediğinde veya fazla çözelti sızıntısı gözlendiğinde durun. Bir sonraki yaban arısına dikkatlice gitme ve bu adımları yineleme
NOT: İğneyi çok yavaş çıkarmadan önce karın içinde yaklaşık 3 sn bırakarak yavaşça enjekte edin. Bu, iç sıvı basıncını ayarlamaya ve iğne çıkarıldıktan sonra enjeksiyon bölgesinden çözelti sızmasını önlemeye yardımcı olacaktır. - Bittiğinde, tek enjekte edilen dişileri bir boya fırçası kullanarak bir konakla yeni bir tüpe hafifçe aktarın. Yaklaşık 1 saat oda sıcaklığında iyileşmeye bırakın, hayatta kalmayı onaylayın ve ardından tüpleri yetiştirme inkübatörüne geri verin.
NOT: Gösteri sırasında iğne, Nasonia cinnabar geni12'yihedefleyen BAPC-Cas9-sgRNA ile yüklenir.
7. Enjeksiyon sonrası bakım ve mutant taraması
- Enjekte edilen pupadan yetişkin eklozyonundan sonra, pamukla takılı bir cam tüpe tek eşekarısı yerleştirin ve bir S. bullata konağı(Şekil 1G) yerleştirin. Buna karşılık, enjekte edilen dişileri enjeksiyondan hemen sonra konakçılarla birlikte bireysel tüplere yerleştirin.
- CRISPR/Cas9 nakavt deneyleri için, dişilerin bir gün boyunca konakçıları parazitleştirmesine izin verin ve her gün ardışık üç gün boyunca konağı değiştirin.
NOT: N. vitripennis16'dakihaplodiploid cinsiyet belirleme sistemi sayesinde, bakire dişiler mutasyonların tespitini kolaylaştıran haploid erkek yavruları üretecektir. Erkeklere özgü genlerin RNAi'si aracılığıyla nakavt için, enjekte edilen bireyler vahşi tip bireylerle tekil olarak çiftleştirilebilir ve konakları parazitleştirmelerine izin verilir. Günde bir ana bilgisayar kullanın ve deneysel kuruluma göre ana bilgisayarları değiştirin. - Parazitlenmiş konakçıları G0 erkek yavruları ortaya olana kadar 25 °C'ye yerleştirin (~13-14 gün boyunca).
- Bir diseksiyon mikroskobu altında, G0 erkeklerini mutasyona uğramış fenotipler için tarayın. Cinnabar geni göz pigmentasyonundan sorumludur12: kahverengi gözlü eşekarısı vahşi tiptir ve parlak kırmızı gözlü eşekarısı veya kırmızı ve kahverengi gözler arasındaki varyasyonlar mutanttır (Şekil 1H).
8. Enjeksiyon sonrası haçlar ve yetiştirme
- Kırmızı gözlü tüm mutant G0 erkeklerini (fenotipik olarak bozulan cinnabar12geni) vahşi tip bakire dişilerle 1-2 gün boyuncayerleştirin (Şekil 2A).
NOT: Bozulan gen görünür bir fenotip vermezse, mutant hayvanları tanımlamak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve ardından hedef genin dizilimi gerekir. PCR için G0 erkeklerinden DNA'yı almadan önce, onları vahşi tip bakire dişilerle çiftleşmek ideal olacaktır. Alternatif olarak, mutantları tanımlamak için bir G0 erkeğinin bacağından DNA çıkarın ve sadece doğrulanmış mutasyonları olanları çiftleştirin. - Kadın başına iki S. bullata konakçısı ekleyin ve 12:12 açık-karanlık döngü ile 25 ° C ve% 30 bağıl nemde ovipoz yapmaya izin verin. Her 2-3 günde bir ana bilgisayarları değiştirin.
- Parazitlenmiş konakları 25 °C ve %30 bağıl nemde, 12:12 açık-karanlık döngü ile ~10 gün boyunca saklayın.
- ~10 gün sonra, parazitlenmiş konağı bir diseksiyon iğnesi ile açın ve her N. vitripennis pupasını konaktan çıkarın.
- İnce uçlu bir boya fırçası yardımıyla, dişi pupaları seçin (Şekil 1A).
NOT: Dişiler diploid ve heterozipözdir ve böylece göz rengi vahşi tip olacaktır.
- Ortaya kadar 25 °C'de cam tüplere 15-20 dişi pupa yerleştirin. Ortaya çıkmasından sonra~ 20 S. bullata konakçı ekleyin ve bakire G1 dişilerinin 2-3 gün boyunca konakçıları parazitleştirmesine izin verin.
NOT: Bu dişiler% 50 G2 mutant erkekler üretecektir.- Parazitlenmiş konakları 25 °C ve % 30 bağıl nemde, G2 erkek yetişkin ortaya olana kadar 12:12 açık-karanlık bir döngü ile saklayın.
- Kalan G1 pupalarını 8-10 gün boyunca 5 °C'ye yerleştirin. Bu süreden sonra, bunları çıkarın ve ortaya çıkana kadar 12:12 açık-karanlık bir döngü ile 25 ° C ve% 30 bağıl neme yerleştirin (Şekil 2A).
- Adım 8.3.1'de G2 erkeklerinin ortaya çıkmasından sonra, kırmızı gözlü mutant fenotipinin varlığını tarayın. İnce uçlu bir boya fırçası yardımıyla, kırmızı gözlü erkekleri vahşi tip erkeklerden ayırın.
NOT: Bu nesilde kırmızı gözlü eşekarısının varlığı (G2, Şekil 2A),mikrop hattında gen düzenlemenin gerçekleştiğini ve mutasyonun kalıtsal olduğunu gösterir. - 8.3.2 (Şekil 2A) adımda yeni ortaya çıkan G1 dişileri ile kırmızı gözlü erkekleri yerleştirin ve 1-2 gün çiftleşmelerine izin verin. Dişi başına 2 S. bullata konakçı ekleyin ve 10-11 gün boyunca 12:12 açık-karanlık döngü ile 25 ° C ve% 30 bağıl neme yerleştirin.
- 10-11 gün sonra, parazitlenmiş konağı bir diseksiyon iğnesi ile açın ve her N. vitripennis pupasını konaktan çıkarın (Şekil 2A).
- İnce uçlu bir boya fırçası yardımıyla, kırmızı gözlü eşekarısı (erkekler ve dişiler) vahşi tipten ayırın (Şekil 1H). Kırmızı gözlü eşekarısı yetiştirmeye cam tüplerde birlikte devam edin ve vahşi tip eşekarısı ile karıştırmayın.
NOT: Bu aşamada (G3, Şekil 2A),haploid erkekler ve diploid dişiler cinnabar mutasyonları için fenotip taşır ve gösterir. Etkilenen gen görünmez bir fenotip için kodlanırsa, G0 erkeğini tek başına bir vahşi tip dişi ile ~1 gün boyunca çaprazlayın. Daha sonra, PCR ve dizileme ile mutasyonun moleküler karakterizasyonu için erkeği çıkarın ve dişinin bir konağı parazitleştirmesine izin verin. Geçiş şemasına sadece onaylanmış bir mutant erkeğin yavrularıyla devam edin (Şekil 2B). Amaç bir aday genin RNAi tarafından nakavt olmasıysa, dsRNA enjekte edilen bireyleri doğrudan kullanarak istenen fonksiyonel tahlilleri (öldürücülük, sterilite veya diapause indüksiyon tahlil3,7gibi) gerçekleştirin. RNAi geçici olduğundan, istenen fenotip ile bir koloni oluşturmak mümkün değildir (Şekil 2C)3,7.
Şekil 1: Pupal ve yetişkin Nasonia vitripennis mikroenjeksiyonu için zaman çizelgesi. (A) Erkek ve dişi beyaz (üst) ve siyah (alt) pupalar toplanır, (B-C) hizalanır ve enjeksiyon için bir cam kaydırağa yapıştırılır. (D) Kılcal iğne, üst üste binen iki kaydırağa kaydırılarak hazırlanır ve açılır. (E) İğne, enjeksiyonlar için Femtojet'e (üstte) veya bir aspiratör tüpüne (alt) tutturulur. (F) Kaydırağa enjekte edilen pupa, nemi korumak için altta ıslak bir doku olan bir Petri kabına aktarılır. Ortaya çıkmasından sonra, (G) dişiler tekil olarak küçük cam tüplere yerleştirilir ve Lahit pupasına ovipoz yapmasına izin verilir. (H) Mutantları tespit etmek için yavruların taranır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Enjeksiyondan sonra geçiş şeması. Görünür bir fenotipe neden olan genlerin (A) CRISPR/Cas9 aracılı gen düzenlemesi durumunda geçiş şeması prosedürünün şematik gösterimi ve (B) görünür fenotip vermeyen. (C) RNAi tarama prosedürünün şematik gösterimi. Kısaltmalar: cin = cinnabar; PCR = polimeraz zincir reaksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu makale, bir femtojet veya aspiratör tüpü kullanarak pupal ve yetişkin mikroenjeksiyon için iki kolay yöntem sönmektedir. İlk yöntem, RNAi tutarlılığı için önemli olan daha hassas bir sıvı enjeksiyonuna izin verirken, ikincisi Nasonia pupalarına veya yetişkinlere daha büyük miktarlarda sıvı enjeksiyonuna izin verir.
Tablo 1'de sunulan temsili sonuçlar iyi hayatta kalma oranları göstermektedir (%20 ila%89) ve zahmetli yumurta enjeksiyonlarına gerek kalmadan burada açıklanan enjeksiyon yöntemlerini kullanarak istenen fenotipi (RNAi ile nakavt veya CRISPR ile gen düzenleme) elde etmenin verimliliği.
| safha | reaktif | Konsantrasyon ng/μL (Protein/gRNA veya dsRNA) | N Enjekte Edildi | N Hayatta Kalma (%) | Yavru yumurtlayan enjekte edilen bireyler | Fenotipli yavru üreten enjekte edilmiş bireyler | Nakavt/nakavt fenotiplerini gösteren yavrular | ||||
| N | % | N | Enjekte edilen toplamdan %1 | Yavru üreten bireylerden %10 | N | Mutantlar / enjekte edilmiş pupalar veya yetişkin | |||||
| Beyaz pupa | dsRNA* | 3000-4000 | 80 | 69 (86%) | 69 | 100% | 45 | 56% | 65% | 1263 | Na |
| Siyah pupa | Cas9 | 2903/2741 | 39 | 34 (87%) | 19 | 49% | 2 | 5% | 11% | 2 | 0.05 |
| P2C-CAS9-EGFP** | 454/227 | 40 | 6 (15%) | 2 | 5% | 1 | 3% | 50% | 3 | 0.08 | |
| P2C-Cas9 | 725/750 | 28 | 28 (100%) | 16 | 57% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC | 500/200 | 20 | 11 (55%) | 9 | 45% | 3 | 15% | 33% | 5 | 0.25 | |
| BAPC | 400/600 | 20 | 17 (85%) | 10 | 50% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 | |
| BAPC | 360/360 | 20 | 16 (80%) | 16 | 80% | 2 | 10% | 13% | 3 | 0.15 | |
| 24 h-48-h-yaşlı yetişkin | Cas9 | 2769/3290 | 11 | 10 (90%) | 1 | 9% | 0 | 0% | 0% | 0 | 0.00 |
| P2C-CAS9-EGFP | 454/227 | 34 | 30 (89%) | 12 | 35% | 3 | 9% | 25% | 3 | 0.06 | |
| P2C-Cas9 | 2903/3076 | 36 | 36 (100%) | 17 | 47% | 4 | 11% | 24% | 4 | 0.05 | |
| *RNAi deneyleri daha sonra enjekte edilmeyen wildtype dişilerle çiftleşen erkekler üzerinde yapıldı. Bu nedenle sayılar, yavru üreten haçların ve fenotip üretenlerin sayısını yeniden ortaya çıkardı. | |||||||||||
| ** Yazarlar tarafından pupa üzerine çok ilk enjeksiyon. Kısaltmalar: dsRNA = çift iplikli RNA; EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein; BAPC = dallı amfifilik peptit kapsülleri. | |||||||||||
Tablo 1: Pupal ve yetişkin enjeksiyonları ile RNAi ve CRISPR/Cas9'un hayatta kalma ve verimlilik oranı. RNAi deneylerinde verimlilik, ilgi geninin devrilmesinde verimliliği temsil eder ve cinsiyet oranı bozulması3gibi ölçülebilir bir etki sağlar. CRISPR/Cas9 için verimlilik, mutant yavruları üreten enjekte edilen dişilerin sayısını temsil eder. Kısaltmalar: dsRNA = çift iplikli RNA; gRNA = kılavuz RNA; EGFP = gelişmiş yeşil floresan protein; BAPC = dallı amfifilik peptit kapsülleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nasonia vitripennis'in çeşitli biyolojik sorular için model organizma olarak son zamanlarda artan kullanımı ile2,3,7,17, N. vitripennis genlerinin fonksiyonel analizi için basitleştirilmiş ve verimli bir protokol sağlamak için enjeksiyon yöntemlerinin geliştirilmesine ve optimize edilmesine ihtiyaç vardır. Gen düzenleme reaktiflerinin embriyonik mikroenjeksiyonını içeren mevcut yöntemler, özel ekipman ve yüksek eğitimli personel gerektiren13'emeydan okuyor. Bu nedenle, gen düzenleme teknolojisini uzman olmayan laboratuvarlar için daha erişilebilir hale getirmek için CRISPR reaktiflerinin alternatif teslimat yaklaşımlarının geliştirilmesi kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, burada gösterilen, düzenleme reaktiflerinin (CRISPR / Cas9 veya dsRNA) böcek hemolimf ve yumurtalıklara teslimine izin vermek için iki alternatif enjeksiyon prosedürünü açıklayan ayrıntılı bir görsel tekniktir.
Böcek hemokoel içine dsRNA enjeksiyonu eklembacaklıların çeşitli türlerinde dsRNA teslim etmek için yaygın bir yaklaşımdır18,19,20,21,22. Ayrıca, daha önce bildirildiği gibi beyaz pupalarda kullanıldığında N. vitripennis'te de etkilidir3,7. Germline böcek mutajenisi için CRISPR/Cas9 yöntemleri neredeyse sadece embriyonik mikroinjeksiyonlara dayanır. CRISPR reaktiflerini nimflere veya yetişkinlere ulaştırarak yapılan birkaç başarılı deneybildirilmiştir 12,23,24,25,26,27. Genel olarak, burada açıklanan yöntemler mevcut yöntemlerle ilgili bir dizi önemli fayda sunar13. İlk olarak, N. vitripennis eşekarısının birkaç gelişim aşamasının enjeksiyonuna olanak tanırlar: beyaz, siyah pupa ve yetişkinler. Ek olarak, hemolimf içine enjeksiyon, embriyonik mikroenjeksiyonları atlayarak RNAi veya CRISPR aracılığıyla germline gen düzenleme yoluyla nakavt sağlar.
Bu protokolün ilk adımı, nasonia eşekarısı, fonksiyonel ilgi testine (örneğin, genom düzenleme, RNAi) dayanarak doğru gelişim aşaması için belirlemek ve taramaktır. Beyaz ve koyu pupalarda ve yetişkinlerde hem cinsiyetleri tanımlamaya alışmak önemlidir. N. vitripennis dişileri, blowfly, S. bullatave yaban arısı pupal durumunda elliye kadar yumurta bırakır ve yaban arısı pupaları beyaz aşamadan başlayarak çok sayıda kolayca toplanabilir ve taranabilir. Ek olarak, pupaların 5 °C'de haftalarca geliştirme hızını yavaşlatmak için farklı aşamalarda depolanması olasılığı, sistemi zaman ve organizasyon açısından çok esnek hale getirir9.
Enjeksiyondan sonra pupaların ve yetişkinlerin hayatta kalması, kullanıcılar tarafından optimize edilmesi gereken bir husustur. Örneğin, bu protokolde, CRISPR/Cas9 reaktiflerinin pupalara ilk enjeksiyonu sağkalımını önemli ölçüde etkiledi (%15) enjekte edilen yetişkinlerin hayatta kalmasına kıyasla (%90). Bununla birlikte, ikinci seansta pupa sağkalım% 60'a kadar artmıştır. Birkaç enjeksiyon seansından sonra, benzer bir sağkalım sağlamak mümkündü (%80-%100) pupa veya yetişkinler enjekte ettikten sonra. Gerçekten de, eşekarısı hizalama, iğne için doğru diyaframı seçme ve eşekarısı iğne ile delinme veya bıçaklamadan kaçınma ile ilgili parametreler optimize edilirse enjeksiyondan sonra hayatta kalma iyileştirilebilir.
Burada sunulan protokole dayanarak pupa ve dişilerin enjeksiyonlara hizalanıp hazırlanması mortaliteyi azaltabilir. Ayrıca, hareketsiz pupaları slayda yapıştırarak hizalamak için sunulan yöntem enjeksiyon işlemini kolaylaştırabilir, çünkü enjeksiyon sırasında hareket etmelerini önler. Böylece, pupalar daha sonra embriyonik mikroenjeksiyonlarda yer alan adımların zaman alıcı doğasının üstesinden gelen çok hızlı bir şekilde enjekte edilebilir. Ek olarak, enjeksiyonlar bir ağız aspiratörü ile yapılabildiği için gen düzenleme olaylarını gerçekleştirmek için özel bir ekipmana gerek yoktur. Bununla birlikte, bu teknik eşekarısının tutkal üzerinde zamanında yerleştirilmesini gerektirir; aksi takdirde, düzgün bir şekilde takılmaz ve iğne takma sırasında slayttan kayarlar. Bu, birkaç hizalama denemesinden sonra düzeltilebilir.
Yetişkinler bu yöntem kullanılarak hizalanamazlar, çünkü karınlarını ve bacaklarını hareket ettirebilirler; bu nedenle, uyuşturulmaları gerekir. Bu protokolde tercih edilen yöntem, eşekarısı içeren tüpün eşekarısı yere düşürülene kadar ~5 dakika boyunca buza yerleştirilmesini ve daha sonra gruplar halinde buz üzerinde önceden soğutulmuş bir kaydıraktan aktarılmasını içerir. Bu yöntem, her yeni enjeksiyon grubu için buz içeren yeni bir Petri kabı ile 10-15 eşekarısı grupları halinde enjeksiyon için eşekarısının hizalanmasına ve hazırlanmasına izin verir. Enjeksiyon sırasında buzun erimesini önlemek, kaydırağı sabit tutmaya ve iğneleri kırma veya eşekarısı öldürme riskini azaltmaya yardımcı olacaktır. Bu adım, erişilebilirse bir soğutma tablosu kullanılarak geliştirilebilir.
Alternatif olarak, EŞEKArısı anestezik için CO2 pedleri kullanılabilir. Bunu yapmak için, enjeksiyon sırasında CO2'ye maruz kalma süresini optimize etmek ve CO2 maruziyetinin hayatta kalma ve doğurganlık üzerindeki etkilerini belirlemek gerekir, daha önce diğer türler için bildirildiği gibi18. Yetişkinlere enjekte ederken bir ek engel, enjeksiyon için uyuşturulmuş yaban etini tutmak için kullanılan yönteme dayanır. Yaban atasını delip bıçaklama riski olmadan tutabilen künt sivri uçlu bir nesne en uygunudur. Genel olarak, diseksiyon iğneleri veya künt kümes uçları iyi çalışır.
Eşekarısının hizalanması ve uygun şekilde tutulması ustalaştıktan sonra, enjeksiyon işlemi çok hızlı bir şekilde devam edebilir. Pupa ve yetişkin enjeksiyonları, kullanıcının tercihine göre farklı konsantrasyonlarda hazırlanmasını kolaylaştıran yüzlerce nanolitre aralığında çözelti hacimleri ile enjekte edilebilir. Bununla birlikte, yaban atasına zarar verme ve öldürme riski olmadan doğru miktarda sıvı enjekte etmek için uygun iğnelerin kullanılması önemlidir. Genel olarak, çok küçük diyafram açıklıklarına sahip çok uzun iğneler daha iyidir, çünkü pupaların karın bölgesinde daha az fiziksel hasara neden olurlar. Ayrıca, sıvının akışı yavaştır, basınçtaki büyük değişikliklerden kaçınır ve en önemlisi çözeltinin iğnenin oluşturduğu delikten sızmasını önler.
Küçük bir diyaframın dezavantajları, iğnelerin eşekarısının sert dış iskeletine dokunurken kolayca kırılmış olması ve ayrıca karın içinden gelen malzeme ile tıkanabilmesidir. Bu nedenle, küçük diyaframlı iğneler bir femtojet veya nanoject kullanarak çok iyi çalışır ve kullanımları onları kırmamak için büyük özen gerektirir. Bu iğneler ağız aspiratörü için uygun değildir, çünkü küçük bir diyaframdan ağızla sıvı enjekte etmek çok zordur. Bu yöntem için ideal iğne, büyük diyafram iğnesi ile ortaya çıkan hasarı önlerken çözeltinin sorunsuz akmasını sağlayan minimum diyafram gerektirir. Yine, bu yönün kullanıcılar tarafından optimize edilmesi gerekir. Her durumda, iğneyi sık sık değiştirmek, hayatta kalma ve verimliliği azaltacak ucun tıkanmasını ve zarar vermesini önlemeye yardımcı olacaktır.
N. vitripennis'te, karındaki herhangi bir yer hemolimf içine reaktifler vermek için kullanılabilir. Bununla birlikte, yaban arısının ovipozitöre zarar vermemek için ekstra özen göstermelisiniz, çünkü bu beslenme ve yumurtlama için kullanılır. Hem pupalar hem de yetişkinler için, bu protokolde hareketsizleştirme teknikleri, özellikle karın ön kısmına doğru ventral bölgede, ovipozitörden enjekte edilmesine izin vermek için önerilmiştir. Ek olarak, yetişkinlerde, bu yanlara veya sırt bölgesine enjekte edilerek de elde edilebilir. Burada açıklanan pupa için hizalama yöntemi yan enjeksiyonu kolaylaştırabilir, ancak dorsal olmayabilir. Her durumda, diğer vücut parçalarının delinmesi veya karına zarar vermemesi için çabalar önceliklidir.
İğne yerleştirildikten sonra, sıvının akışı yavaş ve sabit olmalıdır. Femtojet buna kolayca izin verir, ancak basıncın her iğne için ayarlanması gerekebilir. Ağız aspiratörü kullanırken, çok hızlı miktarda sıvı enjeksiyonundan kaçınılmalıdır, çünkü bu enjeksiyonun gözeneğinden sızmasına neden olabilir. Aslında, karın şişmesini sıvı ile gözlemlemenin yanı sıra, sızıntı bir enjeksiyonu durdurmak için bir işarettir. Enjeksiyon bittikten sonra, yetişkin eşekarısı iyileşene kadar slaytta bırakılmalı ve daha sonra konakçılarla bir tüpe aktarılmalıdır.
Burada sunulan sistemler, özellikle yumurta mikroenjections için zorlayıcı olan diğer böcek türlerine kolayca uyarlanabilir. Örneğin, birçok parazitoid eşekarısı diğer böcek larvalarına yumurta bırakır. Bu nedenle yumurtalara ulaşmak ve bu türlere enjekte etmek imkansızdır. Asya narenciye psyllid Diaphorina citri gibi diğer haşere türlerinin yumurtalarına da enjeksiyon için ulaşmak çok zordur, çünkü yumurtlandıkları bitkiye bağlanırlar. Yeni bir rapor, BAPC'nin Asya narenciye psyllid, D. citri27'deCRISPR gen düzenlemesi için kullanılabileceğini göstermektedir. Benzer şekilde, proteinin P2C aracılı teslimatı, mCherry, bu türün yumurtalıklarında28, burada açıklanan bu enjeksiyon tekniklerinin çok çeşitli böcek zararlısı türlerinde RNAi ve CRISPR'ın uygulanmasını kolaylaştırabileceğini ve onlarla ilişkili mahsul hasarını önlemeye yardımcı olan kontrol stratejilerinin tasarlanmasına yardımcı olabileceğini düşündürmektedir.
Diğer türlerde uygulama, ilgi çekici türlerin yaşam döngüsüne göre optimizasyon gerektirir. Örneğin, fonksiyonel ilgi testine dayanarak doğru enjeksiyon aşamasını oluşturmak önemlidir. Bu nedenle, CRISPR / Cas9'un yumurtalıklara teslimi için, vitellogenez'in gen düzenleme reaktiflerinin yumurtalıklar tarafından alınmasına izin vermek için ne zaman aktif olduğunu bilmek önemlidir24,25,26,27,28. Buna karşılık, etkili bir nakavt için, genin ne zaman ifade edildiğini ve işlevsel olduğunu bilmek önemlidir. Bu enjeksiyon tekniklerinin gelecekteki uygulaması, plazmid DNA gibi farklı nükleik asit türlerinin böcek hemolimf ve yumurtalıklara verilmesini içerebilir. Bu, plazmid DNA'da bulunan genlerin geçici ekspresyonunun teşvikini mümkün kılar. Buna ek olarak, CRISPR/Cas reaktifini bir şablon DNA ile birleştirmek, transgenezin homolojiye yönelik onarım (HDR) yoluyla aracılık etmelerine yardımcı olabilir veya transposon aracılı bir transgenez indükleerek embriyonik mikroenjeksiyonu atlatabilir. Sonuç olarak, bu geliştirilmiş teknik, RNAi yoluyla nakavt, mutasyonların indüksiyonu, silmeler ve hatta transgene eklemeleri transgene eklemeleri gibi birçok türde fonksiyonel analiz oluşturmak için kullanılabilir Transgene eklemeleri transgene N. vitripennis, transposonları BAPC ile ilişkilendirmek, bu organizmadaki fonksiyonel araştırmaları büyük ölçüde hızlandırmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JLR ve DCR, ReMOT Control teknolojisi için geçici patent koruması başvurusunda bulunmuştur. O.S.A. Agragene, Inc.'in kurucusudur, özkaynak menfaati vardır ve şirketin Bilimsel Danışma Kurulu'nda görev yapmaktadır. Diğer tüm yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen O.S.A.'ya yönlendirilen UCSD başlangıç fonları ve J.L.R.'a 1645331 NSF/BIO hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
References
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
