هنا، ونحن نصف أساليب لحقن الجرو والكبار كفاءة في Nasonia vitripennis كبدائل يمكن الوصول إليها للتحنيم الدقيق الجنين، وتمكين التحليل الوظيفي للجينات ذات الأهمية باستخدام إما الحمض النووي الريبي إسكات عن طريق تدخل الحمض النووي الريبي (RNAAi) أو خروج المغلوب الجينات عن طريق CRISPR / Cas9 تحرير الجينوم.
دبور جوهرة، Nasonia vitripennis،أصبح نظام نموذج فعال لدراسة علم الوراثة اللاجينية لتحديد الجنس haplo-diploid، بيولوجيا كروموسوم B، التفاعلات المضيفة- symbiont، speciation، وتوليف السم. على الرغم من توافر العديد من الأدوات الجزيئية، بما في ذلك CRISPR/Cas9، لا تزال الدراسات الوراثية الوظيفية محدودة في هذا الكائن الحي. وينبع القيد الرئيسي لتطبيق تكنولوجيا CRISPR/Cas9 في N. vitripennis من تحديات الميكروبيكشن الجنيني. حقن الأجنة صعبة بشكل خاص في هذا الكائن الحي وبشكل عام في العديد من الدبابير الطفيليات ، بسبب صغر حجم الجنين ومتطلبات جروة مضيفة للتطور الجنيني. ولمعالجة هذه التحديات، تم تحسين الولادة المعقدة للريبونوكليوبروتين Cas9 إلى المبيضين الإناث عن طريق حقن البالغين، بدلا من الحقن المجهري الجنيني، مما أدى إلى تعديلات جرثومية جسدية وقابلة للتكرار. تم تحسين إجراءات الحقن في الخوادر والدبابير الأنثوية باستخدام إما التحكم في ReMOT (تحويل المبيض بوساطة المستقبلات للشحن) أو BAPC (كبسولات الببتيد الأمفيفيلية المتفرعة). وتبين أن هذه الأساليب بدائل فعالة لحقن الأجنة، مما يتيح حدوث طفرات جرثومية محددة الموقع وقابلة للتكسيت.
CRISPR/Cas9 تحرير الجينات هي تقنية قوية للدراسات الوراثية الوظيفية، وخاصة في العديد من الكائنات الحية نموذج ارتفاع مثل دبور جوهرة، Nasonia vitripennis. سهولة تربية وتوافر الجينوم الكامل يجعل دبور جوهرة نظام تجريبي مهم لتوضيح الآليات الجزيئية للعمليات البيولوجية المختلفة. على سبيل المثال، N. vitripennis وقد استخدمت مؤخرا لكشف الأساس اللاجيني لنظام تحديد الجنس haplodiploid1،2، وبيولوجيا الكروموسومات B3،4،5،6، والأساس الوراثي للتنظيم circadian والموسمية7،8. بعض الميزات التي تجعل N. vitripennis قابلة للعمل مع تشمل وقت الجيل القصير (~ 2 أسابيع عند 25 درجة مئوية)، وارتفاع معدلات الإنجاب، وسهولة فصل الجنس في مرحلة pupal، والقدرة على diapause وتخزين سلالات في 4 درجة مئوية. تبدأ دورة الحياة مع الدبابير الإناث تطفل الخوادر من الذبابة ، بولاتا التابوت. من خلال ovipositor بهم ، تضع الإناث ما يصل إلى 50 بيضة في حالة الجراء من الذبابة. البيض تتطور إلى اليرقات التي تتغذى على الجراء S. بولاتا، تستمر في التطور على مدى الأيام القليلة المقبلة، ومن ثم pupate، تليها eclosion الكبار والظهور من puparium المضيف9.
الأدوات الجزيئية لإجراء الدراسات الجينية الوظيفية في N. vitripennis, مثل تدخل الحمض النووي الريبي (RNAAi)10 و CRISPR/Cas911,12, متوفرة, ولكنها محدودة, ويرجع ذلك في المقام الأول إلى صعوبات في إجراء الميكروبيكشنات الجنينية13. كما N. vitripennis البيض تتطلب مضيف الجرو للتنمية، والتلاعب البيض هو صعب للغاية. يجب جمع الأجنة مرحلة ما قبل blastoderm من الخوادر blowfly المضيف، وميكرونجيكت بسرعة، ونقلها على الفور مرة أخرى إلى المضيف للتنمية13. تتطلب هذه الخطوات الدقة والتدريب المتخصص لتجنب إتلاف الأجنة المجهرية أو يستضيف الجرو13. وعلاوة على ذلك ، فإن البيض صغير جدا وهش ، خاصة بعد الاحتراط الدقيق ، مع السيتوبلازم اللزج جدا مما يسبب انسداد مستمر لإبرة الحقن13. هذه الميزات تجعل الاختبارات الدقيقة الجنينية صعبة بشكل استثنائي ، مما يتطلب مشغلين مدربين تدريبا عاليا ومعدات متخصصة غائبة في معظم مختبرات N. vitripennis.
ومن شأن تحسين أساليب الحقن البديلة لتوصيل الكواشف CRISPR أن يسهم في توطيد N. vitripennis ككائن حي نموذجي. التلاعب من الخوخ والبالغين هو أقل تحديا من التلاعب الأجنة ويمكن تحقيقه مع الإعداد حقن الأساسية. هنا، يتم وصف بروتوكولين لحقن الخوادر والبالغين: واحد ينطوي على معدات متخصصة للحقن، والآخر ينطوي على استخدام تجميع أنبوب التنفس مزودة إبرة شعرية زجاجية. استخدام أنبوب التنفس مناسب بشكل خاص للمختبرات التي لا يمكنها الوصول إلى المعدات المتخصصة للأنابيب الدقيقة للجنين. يتم إظهار الحقن الفعالة لمراحل النمو المختلفة من N. vitripennis، بما في ذلك الخوخ الأبيض أو الأسود والدبابير البالغة. الدبابير في مرحلة الجرو الأبيض مناسبة بشكل خاص لتجارب الضربة القاضية بوساطة RNAi. على الرغم من أن RNAi في ناسونيا وصفت لأول مرة من قبل لينش وديسبلان في 200610, لا يوجد إجراء بصري متاح لكيفية إجراء حقن RNAi. وقد استخدمت مؤخرا RNAi لاكتشاف الجين haploidizer من B-كروموسوم PSR(نسبة الجنس الأبوي) 3 ودراسة مشاركة الجين على مدار الساعة, الفترة, في N. vitripennis الإيقاعات البيولوجية7.
يمكن استخدام الخوادر السوداء والدبابير البالغة للحث على تحرير الجينات الجرثومية CRISPR/Cas9 باستخدام ReMOT Control (تحويل المبيض بوساطة المستقبلات للشحن) وبروتوكولات BAPC (كبسولات الببتيد الأمفيفيلية المتفرعة). وقد وصفت هذه الطرق تسليم المبيض اثنين مؤخرا لتكون فعالة في ناسونيا لتوليد الطفرات الجرثومية في الجين المستهدف, cinnabar7,12. هنا ، يتم توفير بروتوكول مبسط للحقن بما في ذلك إجراء بصري لمنهجية خطوة بخطوة لكل من الحقن الجروية وحقن البالغين التي يمكن استخدامها لتوليد دراسات علم الوراثة الوظيفية في Nasonia وعلى الأرجح في الدبابير الطفيليات الأخرى ، دون الحاجة إلى معدات متخصصة وتجاوز التجميل الجنيني الدقيق.
مع الاستخدام المتزايد مؤخرا من nasonia vitripennis ككائن حي نموذجي لمختلف الأسئلة البيولوجية2،3،7،17، هناك حاجة لتطوير وتحسين أساليب الحقن لتمكين بروتوكول مبسط وفعال للتحليل الوظيفي لجينات N. vitripennis. الأساليب الحالية ا…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صناديق بدء UCSD الموجهة إلى O.S.A. ومنحة NSF/BIO 1645331 إلى J.L.R.
100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
Food colorant dye | |||
Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |