Summary
高分辨率超声波可以通过确定怀孕状态、妊娠年龄和怀孕损失来帮助简化需要定时怀孕小鼠的实验。这里介绍的是一个协议，以说明评估小鼠怀孕的方法，以及可能模仿怀孕的潜在陷阱（图像文物）。
Abstract
小鼠是许多人类疾病和生物过程的首选哺乳动物动物模型。发育生物学通常需要分阶段怀孕的小鼠来确定不同时间点的进化过程。此外，模型小鼠的最佳和高效繁殖需要对定时怀孕进行评估。最常见的情况是，小鼠在一夜之间交用，阴道塞的存在被确定：然而，这种技术的正预测值是次优的，人们需要等待知道老鼠是否真的怀孕了。高分辨率超声波生物显微镜是一种有效有效的成像工具：1） 小鼠是否怀孕：2） 鼠标达到的妊娠阶段：和 3） 是否有宫内损失。除了胚胎和胎儿外，研究者还必须识别腹腔中的常见神器，以免误以为这些是子宫。本文提供了成像协议以及说明性示例。
Introduction
小鼠是许多人类疾病和生物过程1，2，3，4的首选哺乳动物模型。发育生物学研究往往要求分阶段怀孕的小鼠确定进化过程在不同的时间点5，6，7，8。此外，模型小鼠的最佳和有效繁殖需要评估定时怀孕，尤其是当研究人员正在研究基因突变对发育的影响时。通常，研究人员在一夜之间与异质小鼠交配，第二天一早寻找阴道塞子，并希望怀孕后9日。确定宫内损失通常从检查新生儿的粪便中是否与门代利人基因型的比例开始，然后通过在不同的妊娠阶段牺牲怀孕的小鼠和恢复胚胎来向后工作。研究者可以确定体重增加是阳性妊娠10、11的指标：然而，特别是与基因工程小鼠，垃圾可能非常小，随后重新吸收时，有宫内损失，由于体重增加可能并不明显（特别是在怀孕早期，~E6.5-8.5）。例如，由于良性腹部肿瘤，小鼠可能出现虚假怀孕。从本质上讲，一个人的作品是"盲目的"。
高分辨率超声波生物显微镜允许直接可视化格拉维德子宫和开发小鼠胚胎12，13，14，15，16。虽然我们最初已经开发出评估胚胎小鼠心血管生理学的方法16，17，我们认识到这种成像方式的效用，以简化我们的小鼠繁殖。具体来说，我们不再需要等待"看"老鼠是否怀孕，基于明显的体重增加或运送垃圾：如果大坝没有怀孕，我们可以确定鼠鰿的状态，并迅速重新交配小鼠。此外，宫内损失也可以很容易地被映像，在不牺牲鼠标的情况下可以确定损失的时间表（见图1的示意图）。因此，可以节省时间、有价值的模型鼠标和资金。
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Protocol
本议定书的所有步骤均遵循美国国家卫生研究院出版的《实验室动物护理和使用指南》，并已得到纽约大学格罗斯曼医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 老鼠为早产而交配
- 将适当的雌性小鼠（通常是异质鼠）与适当的雄性小鼠（通常是异质鼠）配对，进行夜间交配。
- 第二天早上把老鼠分开。或者，继续与雌性小鼠和雄性小鼠交配，从而增加怀孕的机会。
注意：然而，不能用替代方案来保证准确定时怀孕，通过超声波分期小鼠胚胎尚不清楚，特别是当疾病过程导致宫内生长迟缓时。如果携带基因变异的胚胎被认为很小，请寻找较大的野生型垃圾来测量妊娠年龄。- 可选：寻找阴道塞。如果没有阴道塞，雌性鼠标就没有交集。如果有阴道塞，雌性小鼠仍有可能不怀孕。
- 隔夜交配后的第二天时间为 E0.5 。
- 在 E6.5– E.8.5 进行成像以确定怀孕情况，如果小鼠未怀孕，则与小鼠重新交配（参见第 1.1 步）。
注：现阶段，女坝没有明显怀孕的眼睛：因此，超声成像允许早期测定和重新交配。
2. 麻醉和准备鼠标
- 将怀孕的鼠标放在麻醉感应室中。
- 将异氟兰与室内空气或医用氧气混合，浓度为2%-3%，流速为1升/分钟，诱导诱导诱导室中怀孕小鼠的诱惑。
注：Sedation 通常在 1-2 分钟内发生。老鼠将静静地躺着，她的呼吸会变慢。 - 快速将鼠标传输到成像平台。成像平台通常也有加热元件，这有助于保持鼠标的温暖。
- 将鼠标的鼻子放入麻醉鼻锥中。
- 快速将异氟烃/氧气混合物重新路由到成像平台鼻锥。在 1 L/分钟流量下保持在 2%-3% 的异氟兰。
- 通过爪捏、角膜反射、呼吸水平和任何运动确定静止水平。
注意：角膜反射最初可以通过在眼睛上涂上保湿软膏来确定，以防止它们在小鼠麻醉时干燥（小鼠不会闭上眼睛）。 - 鼠标躺在仰卧（背上），将爪子贴在成像平台的心电图（EKG）垫上。
注意：但是，这种成像不需要 EKG。 - 从怀孕的大坝腹部取出皮毛如下：
- 用 70% 乙醇彻底润湿腹部毛皮，包括到横向边缘。不要应用太多，以至于平台上有径流。
注意：乙醇比水更能用作剃须润滑剂。 - 使用剃须刀刀片小心剃腹部。小心不要割。
- 用纱布或一些湿巾擦去腹部剃光的毛皮。
- 或者，使用毛皮剪子去除大部分毛皮后，使用脱毛霜。
- 用 70% 乙醇彻底润湿腹部毛皮，包括到横向边缘。不要应用太多，以至于平台上有径流。
3. （假定） 怀孕小鼠的跨区域成像
- 腹部剃光后，将异氟兰降低到1%-1.5%，但仍保持1升/分钟的流动速度。通过呼吸水平和任何运动以及爪捏和/或角膜反射监测安定水平。
注：麻醉小鼠的心率通常为400-500/分钟，具体取决于核心（直肠）温度。为了快速检查怀孕，不要将鼠标加热到生理核心温度：心率将接近400×450/分钟，但如果老鼠在长时间的成像中变冷，心律可能会进一步下降。- 重要的是，确保呼吸在深度和规律性上是适度的，而不是不稳定或痛苦（喘气：深，慢，不稳定，深间缩和子缩还）。
注：非通风麻醉小鼠的呼吸速率一般为60~100/分钟。请参阅 https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html 和 https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice。
- 重要的是，确保呼吸在深度和规律性上是适度的，而不是不稳定或痛苦（喘气：深，慢，不稳定，深间缩和子缩还）。
- 慷慨地将超声波（声学耦合）凝胶涂抹在腹部。
- 将成像传感器放在腹部，使其定向在水平平面上：定向探头，在成像系统上获得左右方向：成像探头侧指示的"点"或脊应朝右。
注意：将成像探头向右滑动到鼠标右侧时，应将超声波系统上的相应图像移到鼠标的右侧（想象一下，从鼠标的尾部向上看——鼠标的右侧将留在监视器上）。- 通常，使用成像系统的传感器安装和导轨操纵系统。在这里，"自由手"成像已经使用，其中成像传感器是手持的（两只手比一只更稳定），这允许腹部周围的更快速的运动。如下文所述，这些运动包括旋转和转化运动。然而，这需要更多的实践。
- 识别屏幕上的膀胱 （视频1）。
- 从膀胱中扫描，识别阴道。然后，缓慢而平稳地向颅面方向扫描，确定阴道向左右子宫角的分叉（图2：视频 1）.
- 开始子宫（左右子宫角）13（图3：视频2）。
注意：在妊娠中期（E10.5或E11.5）前，小鼠胚胎将沿着左右外围放置。随着它们的生长，子宫及其相应胚胎的分离部分会向外和后部转动。随着胚胎的进一步生长（E15.5和以后，一般来说），小鼠胎儿将几乎随机地放置在不同的方向，并且很难从近部"跟踪"子宫。- 快速扫描，只需检查鼠标是否怀孕。这种快速的方法只需要识别一个肝子宫和小鼠胚胎。
- 或者，花额外的时间来列举每个子宫角中的胚胎（活的、死的、重新吸收的）。
注：一般来说，活胚胎会表现出不同的器官，如心脏、四肢、带心室的头部和眼睛。死胚胎呈现出同质的"模糊"外观，除非只是死了。重新吸收的胚胎在看起来有一个精准的回声点（图4，图5，图6，图7，图8）中间。 - 要确定胚胎是否真的活着，请查找心跳和/或血流。
注：彩色多普勒流图可以帮助确定胚胎和脐带中存在血流。一般来说，这可能适用于E8.5以上的胚胎。 - 识别可能模仿子宫的潜在文物（图9，图10）。此外，由于肠气体和其他超声波"阴影"神器可能遮挡子宫角的片段，因此从多个有利位置进行成像，以确保子宫的充分可视化。
- 测量完成后，用纱布或湿巾擦拭腹部的凝胶。尽量去除凝胶，因为凝胶往往冷却鼠标。
- 解开爪子，将鼠标从麻醉鼻锥中取出。
- 轻轻地把老鼠移回她的笼子里。她应该醒过来，在一分钟左右左右开始四处走动。
注意：转基因小鼠可能需要更长的时间才能从麻醉中恢复过来，需要更密切地观察。
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Representative Results
该协议将允许调查员自信地确定小鼠是否怀孕，包括在早期阶段，并确定是否有明显的产前胚胎或胎儿损失，而无需牺牲怀孕的水坝。这种协议在培育转基因小鼠时特别有用：通常，异质x异质交叉产生同源后代会导致正常发育失败，从而导致产前杀伤力。图1描绘了胚胎在妊娠中期逐渐死亡，然后被重新吸收的代表性情况。图2显示了如何通过通过阴道的分叉来找到左右子宫角。图3、图4、图5、图6、图7、图8和视频3显示小鼠胚胎处于不同的发育阶段。早期小鼠胚胎、死胚胎或重新吸收的胚胎可能类似于腹部或肠道粪便中的其他器官，或者相反，肠道循环可能模仿非肝子宫。图9和图10，以及视频4和视频5，展示了这种潜在的成像文物，可能模仿gravid子宫，调查人员必须保持警惕。
图1： 理论上怀孕的老鼠腹部的示意图图，图像为E11.5，然后再次在E14.5。在妊娠中期（E10.5或E11.5）前，小鼠胚胎将沿着腹部的左右外围位置。随着胚胎的生长，子宫及其相应胚胎的分离部分会向外和后部转动。随着胚胎的进一步生长（E15.5和以后，一般来说），小鼠胎儿将几乎随机地放置在不同的方向，并且很难从近部"跟踪"子宫。当基因工程小鼠模型中存在产前杀伤力时，胚胎（开放圆圈）可能会死亡：死亡的胚胎（孵化圆圈）最终会被重新吸收（固体圆圈）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2： 一旦发现阴道（A），立即在膀胱的右边， 扫颅将证明两叉（B）左右子宫角（D）- （F）.
比例栏（A） = 2 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：非肝（非怀孕）子宫的图像（由箭头行识别）。子宫的厚度可能有所不同：在（A）、（B）、（E）中变厚：薄与中央薄回声线（C），非常薄（D），甚至可能包含小， 囊性结构， 不应该被误认为概念（B）和（E），特别是， 虽然这可能很难确定。（A） 是右子宫角：由于肠气，在我们的经验中，这更难遵循。（B） - （F） 是左子宫角：（F） 是相当解剖/横向，因此变得更加难以想象，由于增加肠气体神器。比例栏（A） = 2 毫米。请单击此处查看此图的较大版本。
图4： 重新吸收和死亡的胚胎有明显的外观。重新吸收的胚胎，这是非常常见的发现，被包裹在一个圆形（gravid）子宫囊，看起来相对均匀，除了一个中央回声（非常明亮）"点"-箭头在（A）和（B）。（C） 显示重新吸收或死亡的胚胎：有一个完全同质的，"糊状"的外观子宫，我们看到可能3-4死胚胎在这个框架。（D） 显示最近死亡的胚胎，它仍然显示一些结构：羊水囊中似乎也有细胞碎片。在 （E）， 死亡的胚胎是大大缩小，仍然连接到胎盘 （"P"）.（F） 显示胚胎的同质性"模糊"外观，该胚胎可能在1-2天前死亡，但尚未完全重新吸收。缩放栏（A）和（D）=2毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5： 早期胚胎，从大约E5.5（A）和E6.5（B）到E8.5（C）和（D）。外观有变化，估计阶段基于交配的时间以及胚胎本身的外观。比例栏（A） = 2 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6： E9.5胚胎比E8.5胚胎大得多，并开始形成。显示相邻胚胎的代表性图像显示在 （A） 和 （B） 中。比例杆 = 2 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7： E10.5胚胎表现出更清晰的器官，如头部、脊椎和心脏。显示相邻胚胎的代表性图像显示在所有面板中：在（D），一个死/重新沉降的胚胎位于一个活胚胎旁边。比例栏 = 2 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8：较老的胚胎，大约E12.5 （A）、E14.5（B）和E15.5（C）。成像的斜平面在一定程度上掩盖了精确的解剖结构，但心脏（箭头）位于每个胚胎的中心部分：在 （C）， 心肌现在比血液更回声。请单击此处查看此图的较大版本。
图9： 肠道，这是最有可能与子宫混淆的器官。在 （E）， 重新吸收的胚胎 （箭头） 使一段肠道 （箭头） 重叠。在（F），一个非格拉维德子宫 （箭头） 超过一小段肠 （箭头） 请点击这里查看此图的更大版本。
图10： 肝腹部的其他成像制品包括肾脏、脾脏和肝脏。（A） 右肾：（B） 右肾有肾动脉（箭头）：（C） 左肾：（D） 左肾有肾动脉（箭头）：（E） 脾脏：（F） 肝脏过度拉过一段肠子：（G） 肠道肾脏过度分割部分：（H） 脾脏、肝脏和左肾在一个成像平面上看到。B = 肠：K= 肾脏;肝脏;S= 脾脏。比例栏（A） = 2 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
成像中最重要的第一步是识别阴道，然后确定左右两侧子宫角的分叉。通过跟随每个子宫喇叭，成像仪不太可能错误地识别肠道的循环作为子宫。此外，了解肠道外观的变化（有/无粪便物质）对于区分这些和子宫非常重要：偶尔，排便环中的粪便"球"可能模仿大肠（怀孕）子宫。虽然其他作者描述了诊断怀孕和分期小鼠胚胎发育17，18，19包括检测重新吸收的胚胎20，这项研究是第一次概述步骤和潜在的陷阱成像的gravid murine子宫。
成像仪必须识别可能模仿早孕或子宫或可能干扰子宫和胚胎成像的潜在人工制品。横向跟随子宫角将减少将腹部其他器官和神器误认为子宫（和小胚胎）的可能性。可能被误认为是子宫、胚胎和/或阻塞物的潜在文物包括肠胃、粪便、脾脏、肝脏和胃。
这种方法需要全身麻醉，我们小心地限制：1） 成像时间和 2） 怀孕检查的频率，以减少因麻醉而失去宫内的任何机会。虽然麻醉剂和镇痛剂在怀孕21期间整体看来是安全的，但大量暴露可能会对小鼠胚胎生长产生影响。由于小鼠淘汰模型经常显示产前或产前死亡，胚胎在这种成像过程中暴露于全身麻醉可能（至少理论上）增加其死亡的风险或以未知的方式影响其生物学。虽然绝对时间限制未知，但我们尝试将每次成像会话限制在不超过 15 分钟，并将每次怀孕的成像会话限制为 2–3 次（最大）。"阿拉拉原则"在这里是谨慎的：尽可能低，以合理实现。
这种方法可以更有效地繁殖，以及快速确定宫内死亡。这在使用早期死亡的淘汰模型的实验中尤为重要：其他例子包括毒理学研究。虽然一些研究已经详细说明了怀孕期间的体重增加，但很明显，体重增加早（在E8.5之前）很小，可能与白天体重变化没有什么不同。此外，这些数据仅来自首次怀孕的小鼠，可能无法反映10、11号多重受孕小鼠的混淆效应。定时怀孕可能在早期并不明显，尤其是基因工程小鼠，宫内损失可能很常见，甚至影响整个垃圾。因此，仅仅因为老鼠不送垃圾并不意味着她从未怀孕。如果雌性没有怀孕，老鼠可以在一周内重新怀孕：否则，研究人员将不得不等待它出来，看看女性是否已经怀孕。在技能发展后，不仅仅是检查怀孕，这种方法也将允许映射和监测胚胎的怀孕进展。这样，胚胎收获的最佳时机可以确定组织是否必须在死亡前收获23。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilatory cream | |||
| Ethanol, 70% | |||
| Fur clippers | |||
| Gauze or KimWipes | |||
| Isoflurane | |||
| Medical oxygen (optional) | |||
| Medical tape | |||
| Mouse imaging system (including anesthesia set-up and imaging platform) | Fujifilm Visual Sonics | Various | Any system with 40 MHz center-frequency ultrasound transducer probe |
| Razor blade (not a safety razor) | |||
| Scale (to weigh mouse) | |||
| Ultrasound gel |
References
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