Summary
Gli ultrasuoni ad alta risoluzione possono aiutare a semplificare gli esperimenti che richiedono topi in gravidanza a tempo determinando lo stato di gravidanza, l'età gestazionale e le perdite di gravidanza. Presentato qui è un protocollo per illustrare i metodi per valutare le gravidanze del mouse e potenziali insidie (artefatti dell'immagine) che possono imitare la gravidanza.
Abstract
Il topo è il modello animale di mammiferi preferito per molte malattie umane e processi biologici. La biologia dello sviluppo richiede spesso topi in gravidanza a fasi per determinare i processi in evoluzione in vari punti di tempo. Inoltre, l'allevamento ottimale ed efficiente dei topi modello richiede una valutazione delle gravidanze a tempo. Più comunemente, i topi vengono accoppiati durante la notte e viene determinata la presenza di una spina vaginale; tuttavia, il valore predittivo positivo di questa tecnica è non ottimale e bisogna aspettare per sapere se il topo è veramente incinta. La biomicroscopia ad ultrasuoni ad alta risoluzione è uno strumento efficace ed efficiente per l'imaging: 1) Se un topo è incinta; 2) Quale stadio gestazionale ha raggiunto il topo; e 3) Se ci sono perdite intrauterina. Oltre agli embrioni e ai feti, l'investigatore deve anche riconoscere artefatti comuni nella cavità addominale in modo da non scambiarli per un utero gravide. Questo articolo fornisce un protocollo per l'imaging insieme ad esempi illustrativi.
Introduction
Il topo è il modello di mammifero preferito per molte malattie umane e processibiologici 1,2,3,4. La ricerca in biologia dello sviluppo richiede spesso topi in gravidanza a fasi per determinare i processi in evoluzione in varipunti di tempo 5,6,7,8. Inoltre, l'allevamento ottimale ed efficace di topi modello richiede una valutazione delle gravidanze a tempo, in particolare quando gli investigatori stanno studiando gli effetti di una mutazione genica sullo sviluppo. In genere, gli investigatori accoppiano topi eterozigoti durante la notte, cercano una spina vaginale la mattina successiva e sperano che ne suscidauna gravidanza 9. Determinare la perdita intrauterina inizia in genere con il controllo di una cucciolata appena nata per i rapporti mendeliani dei genotipi, quindi lavorando all'indietro sacrificando i topi gravidi in varie fasi gestazionali e recuperando gli embrioni. Gli investigatori possono determinare l'aumento di peso come metrica di una gravidanzapositiva 10,11; tuttavia, specialmente con topi geneticamente modificati, le cucciolate possono essere molto piccole e successivamente riassorbiti quando c'è perdita intrauterina a causa della quale l'aumento di peso potrebbe non essere ovvio (in particolare all'inizio della gravidanza, ~ E6.5-8.5). Un topo può apparire falsamente incinta a causa, ad esempio, di un tumore addominale benigno. In sostanza, si lavora "ciechi".
La biomicroscopia ad ultrasuoni ad alta risoluzione consente la visualizzazione diretta dell'utero gravidato e lo sviluppo di embrioni ditopo 12,13,14,15,16. Sebbene inizialmente avessimo sviluppato metodi per valutare la fisiologia cardiovascolare del topo embrionale16,17, abbiamo riconosciuto l'utilità di questa modalità di imaging per semplificare il nostro allevamento di topi. In particolare, non abbiamo più dovuto aspettare di "vedere" se un topo era incinta, in base all'ovvio aumento di peso o alla consegna di una cucciolata; potremmo determinare lo stato gravid e ri-accoppiare rapidamente i topi se la diga non era incinta. Inoltre, le perdite intrauterina potrebbero anche essere facilmente individuate e una sequenza temporale di perdita potrebbe essere determinata senza sacrificare il mouse (vedi figura 1 per uno schema). Il tempo, i topi modello preziosi e i fondi possono quindi essere risparmiati.
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Protocol
Tutte le fasi di questo protocollo seguono la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal National Institutes of Health e sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Grossman School of Medicine della New York University.
1. Accoppiamento di topi per gravidanze a tempo
- Abbina il topo femmina appropriato (di solito un eterozigote) in una gabbia con il topo maschio appropriato (di solito un eterozigote) per l'accoppiamento notturno.
- Separare i topi la mattina successiva. In alternativa, accoppia continuamente i topi femmine e maschi, aumentando così le possibilità di gravidanza.
NOTA: Tuttavia, una gravidanza accuratamente programmata non può essere garantita con l'alternativa e la stadiazione degli embrioni di topo tramite ultrasuoni non è chiara, specialmente quando il processo della malattia provoca un ritardo della crescita intrauterina. Se si presume che gli embrioni che trasportano la variante genica siano piccoli, cerca i più grandi littermate di tipo selvatico per misurare l'età gestazionale.- Facoltativo: cerca la spina vaginale. Se non c'è una spina vaginale, il topo femmina non è stato accoppiato. Se c'è una spina vaginale, è ancora probabile che il topo femmina non diventi incinta.
- Ora il giorno dopo l'accoppiamento notturno come E0.5.
- Eseguire l'imaging su E6.5–E.8.5 per determinare la gravidanza e ri-accoppiare i topi se il topo non è incinta (vedere il passaggio 1.1).
NOTA: In questa fase, la diga femminile non è ovviamente incinta all'occhio; pertanto, l'imaging ad ultrasuoni consente la determinazione precoce e il riascoscimento.
2. Anestesia e preparazione del topo
- Posizionare il topo incinta nella camera di induzione anestetica.
- Mescolare l'isoflurane con aria ambiente o ossigeno medico, ad una concentrazione del 2%-3% a una portata di 1 L/min per indurre la sedazione del topo incinta nella camera di induzione.
NOTA: La sedazione avviene tipicamente entro 1-2 minuti. Il topo giace fermo e il suo respiro avrà rallentato. - Trasferire rapidamente il mouse sulla piattaforma di imaging. La piattaforma di imaging in genere ha anche elementi riscaldanti, che possono aiutare a mantenere caldo il mouse.
- Posizionare il naso del topo nel cono anestetico.
- Ritrasstradare rapidamente la miscela isoflurane/ossigeno al nosecone della piattaforma di imaging. Mantenere l'isoflurane al 2%-3% a 1 L/min di flusso.
- Determina il livello di sedazione per pizzico di zampa, riflesso corneale, livello di respirazione e qualsiasi movimento.
NOTA: Il riflesso corneale può essere inizialmente determinato applicando un unguento idratante agli occhi per evitare che si asciughino mentre il topo viene anestetizzato (il mouse non chiude gli occhi). - Con il mouse sdraiato supina (sulla schiena), rastremi le zampe sui cuscinetti elettrocardiogramma (EKG) della piattaforma di imaging.
NOTA: Tuttavia, un elettrocardiogramma non è necessario per questo tipo di imaging. - Rimuovere la pelliccia dall'addome della diga incinta come segue:
- Bagnare accuratamente la pelliccia addominale con il 70% di etanolo, anche fino ai bordi laterali. Non applicare così tanto che c'è il de-de-off sulla piattaforma.
NOTA: L'etanolo funziona meglio come lubrificante da barba che come acqua. - Utilizzare la lama del rasoio per radere accuratamente l'addome. Fare attenzione a non tagliare i capezzoli.
- Pulire la pelliccia rasata dall'addome con garza o alcune salviette.
- In alternativa, utilizzare una crema depilatoria dopo aver usato le tosaerba per rimuovere la maggior parte della pelliccia.
- Bagnare accuratamente la pelliccia addominale con il 70% di etanolo, anche fino ai bordi laterali. Non applicare così tanto che c'è il de-de-off sulla piattaforma.
3. Imaging transabdominale del (presunto) topo incinta
- Dopo che l'addome è stato rasato, ridurre l'isoflurane all'1%-1,5%, mantenendo comunque una portata di 1 L/min. Monitorare il livello di sedazione in base al livello di respirazione e agli eventuali movimenti, nonché al pizzico di zampa e / o riflesso corneale.
NOTA: La frequenza cardiaca del mouse anestetizzato sarà in genere di 400-500/min, a seconda della temperatura del nucleo (rettale). Ai fini di un rapido controllo della gravidanza, non riscaldare il topo a una temperatura interna fisiologica; la frequenza cardiaca sarà più vicina a 400-450/min, ma potrebbe scendere ulteriormente con un ritmo irregolare se il topo si raffredda con immagini prolungate.- È importante sottolineare che le respirazioni siano moderate in profondità e regolarità, non irregolari o agonali (ansimando: profonde, lente ed irregolari, con profonde retrazioni intercostali e sottocostali).
NOTA: La frequenza respiratoria del topo anestetizzato non ventilato sarà in genere di 60-100/https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html min.
- È importante sottolineare che le respirazioni siano moderate in profondità e regolarità, non irregolari o agonali (ansimando: profonde, lente ed irregolari, con profonde retrazioni intercostali e sottocostali).
- Applicare generosamente il gel ad ultrasuoni (accoppiamento acustico) sull'addome.
- Posizionare il trasduttore di imaging sull'addome per orientarlo su un piano orizzontale: orientare la sonda per ottenere un orientamento sinistro-destro sul sistema di imaging; il "punto" o la cresta indicata sul lato della sonda di imaging deve essere rivolto a destra.
NOTA: lo scorrimento della sonda di imaging verso destra del mouse dovrebbe spostare l'immagine corrispondente sul sistema ad ultrasuoni a destra del mouse (immagina di guardare "verso l'alto" dalla coda del mouse: la destra del mouse verrà lasciata sul monitor).- In genere, utilizzare il sistema di montaggio trasduttore e il sistema di manipolatore ferroviario del sistema di imaging. Qui, è stata utilizzata l'imaging "mano libera" in cui il trasduttore di imaging è tenuto a mano (due mani sono più stabili di una) e che consente movimenti più rapidi intorno all'addome. Questi movimenti, come verrà delineato di seguito, includono sia movimenti rotazionali che traslazionali. Tuttavia, ciò richiede più pratica.
- Identificare la vescica sullo schermo (Video 1).
- Scansionando caudally dalla vescica, identificare la vagina. Quindi, scansionando lentamente e senza intoppi in una direzione cranica, identificare la biforcazione della vagina nelle corna uterine sinistra e destra (Figura 2; Video 1).
- Iniziare l'indagine sull'utero (corna uterine sinistra e destra)13 (Figura 3; Video 2).
NOTA: Fino alla gestazione media (E10.5 o E11.5), gli embrioni di topo saranno posizionati lungo le periferie destra e sinistra. Man mano che crescono, le porzioni più distali dell'utero e i loro embrioni corrispondenti si trasformeranno verso l'esterno e posteriormente. Man mano che gli embrioni crescono ulteriormente (E15.5 e versioni successive, in generale), i feti del topo saranno posizionati quasi casualmente in varie direzioni e diventa difficile "tracciare" un utero dal prossimale al distale.- Scansiona rapidamente semplicemente per verificare se un topo è incinta o meno. Questo metodo rapido richiede solo il riconoscimento di un utero gravid e di embrioni di topo.
- In alternativa, prenditi del tempo extra per enumerare gli embrioni (vivi, morti, riassorbiti) in ogni corno uterino.
NOTA: In generale, un embrione vivo esporrà organi distinti come un cuore, arti, testa con ventricoli e occhi. Un embrione morto assume un aspetto omogeneo e "mondo" a meno che non sia morto. Gli embrioni riassorbiti hanno un punto ecogenico millimetro nel mezzo di un utero dall'aspetto gravid(Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8). - Per determinare se un embrione è veramente vivo, cercare il battito cardiaco e / o il flusso sanguigno.
NOTA: La mappatura del flusso Doppler di colore può aiutare a determinare la presenza di flusso sanguigno, sia nell'embrione che nel cordone ombelicale. In generale, questo può essere applicato agli embrioni di età superiore all'E8.5. - Riconoscere potenziali artefatti che possono imitare un utero gravid (Figura 9, Figura 10). Inoltre, poiché il gas intestinale e altri artefatti "ombra" ad ultrasuoni possono oscurare segmenti del corno uterino, eseguire l'imaging da più punti panoramici per garantire un'adeguata visualizzazione dell'utero.
- Al termine dell'indagine, pulire il gel dall'addome con garza o salviette. Cerca di rimuovere il più possibile poiché il gel tende a raffreddare il mouse verso il basso.
- Scoltare le zampe e rimuovere il mouse dal cono del naso anestetico.
- Spostare delicatamente il mouse di nuovo nella sua gabbia. Dovrebbe svegliarsi e iniziare a muoversi nel giro di circa un minuto.
NOTA: I topi geneticamente modificati possono richiedere un po 'più di tempo per riprendersi dall'anestesia e devono essere osservati più da vicino.
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Representative Results
Questo protocollo consentirà a uno sperimentatore di determinare con sicurezza se un topo è incinta, anche durante le prime fasi e di determinare se ci sono evidenti perdite embrionali o fetali prenatali senza dover sacrificare la diga incinta. Questo protocollo è particolarmente utile quando si allevano topi geneticamente modificati; tipicamente, le croci eterozigoti x eterozigoti per produrre prole omozigota portano al fallimento di uno sviluppo adeguato, che causa letalità prenatale. La figura 1 descrive una situazione rappresentativa in cui gli embrioni muoiono progressivamente e poi vengono riassorbiti attraverso la gestazione intermedia. La figura 2 mostra come trovare le corna uterine sinistra e destra seguendo la vagina attraverso la sua biforcazione. La figura 3, la figura 4, la figura 5, la figura 6, la figura 7, la figura 8e il video 3 mostrano gli embrioni di topo nelle varie fasi di sviluppo. Embrioni di topo allo stadio iniziale, embrioni morti o embrioni riassorbiti possono assomigliare ad altri organi nell'addome o nelle feci nell'intestino, o viceversa, gli anelli intestinali possono imitare l'utero non gravid. La figura 9 e la figura 10, nonché il video 4 e il video 5, dimostrano tali potenziali artefatti di imaging che possono imitare l'utero gravidato, per il quale lo sperimentatore deve essere in allerta.
Figura 1: Diagramma schematico di un addome teorico del topo incinta, immaginato su E11.5, poi di nuovo a E14.5. Fino alla gestazione media (E10.5 o E11.5), gli embrioni di topo saranno posizionati lungo gli aspetti periferici destro e sinistro dell'addome. Man mano che gli embrioni crescono, le porzioni più distali dell'utero e i loro embrioni corrispondenti si trasformeranno verso l'esterno e posteriormente. Man mano che gli embrioni crescono ulteriormente (E15.5 e versioni successive, in generale), i feti del topo saranno posizionati quasi casualmente in varie direzioni e diventa difficile "tracciare" un utero dal prossimale al distale. Quando c'è letalità prenatale in un modello di topo geneticamente modificato, gli embrioni (cerchi aperti) possono morire; gli embrioni morti (cerchi tratteggiati) alla fine verranno riassorbiti (cerchi solidi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Una volta individuata la vagina (A), immediatamente a destra della vescica, spazzare cranicamente dimostrerà la biforcazione (B) alle corna uterine destra e sinistra (D) -(F).
Barra di scala (A) = 2 mm.
Figura 3: Immagini di utero non gravide (non incinta) (identificate dalle file di frecce). L'utero può variare di spessore: più spesso in (A), (B), (E); sottile con una linea ecogenica sottile centrale(C),molto sottile (D), o può anche contenere piccole strutture cistiche che non dovrebbero essere scambiate per concepti (B) e (E) in particolare, anche se questo può essere difficile da determinare. (A) è un corno uterino destro; questo è più difficile da seguire distally nella nostra esperienza a causa del gas intestinale. (B)–(F) sono corna uterine lasciate; (F) è piuttosto distale/laterale e quindi diventa più difficile da immaginare a causa dell'aumento dell'artefatto del gas intestinale. Barra di scala (A) = 2 mm.
Figura 4: Gli embrioni riassorbiti e morti hanno un aspetto distinto. Gli embrioni riassorbiti, che si trovano molto comunemente, sono racchiusi all'interno di un sacco uterino rotondo (gravid) che appare relativamente omogeneo ad eccezione di un "punto" ecogenico centrale (molto luminoso) - frecce in (A) e (B). (C) mostra embrioni riassorbiti o morti; c'è un aspetto "mondo" completamente omogeneo dell'utero, e vediamo probabilmente 3-4 embrioni morti in questo fotogramma. (D) mostra un embrione recentemente morto, che mostra ancora alcune strutture; ci sembrano anche detriti cellulari nel sacco amniotico. In (E), l'embrione morto è molto rimpicciolito e ancora collegato alla placenta ("P"). (F) mostra un aspetto omogeneo e "pastoso" di un embrione che probabilmente è morto 1-2 giorni prima, ma non è ancora completamente riassorbito. Barra di scala per (A) e (D) = 2 mm.
Figura 5: Embrioni allo stadio iniziale, da circa E5,5 (A) ed E6.5 (B) a E8.5 ((C) e (D)). Ci sono variazioni nelle apparenze, e le fasi stimate qui erano basate sui tempi di accoppiamento e sulla comparsa degli embrioni stessi. Barra di scala (A) = 2 mm.
Figura 6: Gli embrioni E9.5 sono notevolmente più grandi degli embrioni E8.5 e stanno iniziando a prendere forma. Le immagini rappresentative, che mostrano embrioni adiacenti, sono mostrate nelle( A) e (B). Barre di scala = 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Gli embrioni E10.5 mostrano organi ancora più chiari come la testa, la colonna vertebrale e il cuore. Immagini rappresentative, che mostrano embrioni adiacenti, sono mostrate in tutti i pannelli; in (D), un embrione morto/riassorbente si trova adiacente a un embrione vivo. Barra di scala = 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Embrioni più vecchi, circa E12,5 (A), E14,5 (B) ed E15,5 (C). Piani obliqui di imaging oscurano in qualche modo l'anatomia precisa, ma il cuore (freccia) si trova nella porzione centrale di ogni embrione; in (C), il miocardio è ora più ecogenico del sangue. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: L'intestino, che è l'organo più probabile che venga confuso con l'utero. In (E), un embrione riassorbito (punte di freccia) sovrappone un segmento di intestino (frecce). In (F), un utero non gravid (punte di freccia) sovrappone un breve segmento di intestino (frecce) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Ulteriori artefatti di imaging nell'addome gravide includono reni, milza e fegato. (A) Rene destro; (B) Rene destro con arteria renale (frecce); (C) Rene sinistro; (D) Rene sinistro con arteria renale (frecce); (E) Milza; (F) Fegato che sovrascriva un segmento dell'intestino; (G) Segmento di sovrasatura renale dell'intestino; (H) Milza, fegato e rene sinistro visti in un piano di imaging. B = intestino; K= rene; L= fegato; S= milza. Barra di scala (A) = 2 mm.
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Discussion
Il primo passo più importante nell'imaging è identificare la vagina e quindi determinare la biforcazione del corno uterino a sinistra e a destra. Seguendo ogni corno uterino, è meno probabile che l'imager identifichi erroneamente i loop dell'intestino come utero. Inoltre, comprendere le variazioni nell'aspetto dell'intestino (con /senza materia fecale) è importante per distinguerli dall'utero; occasionalmente, le "palle" fecali negli anelli intestinali possono imitare un utero gravide (incinta). Sebbene altri autori abbiano descritto la diagnosi di gravidanza e la stadiazione dello sviluppo embrionale del topo17,18,19 compresala rilevazione di embrioni riassorbiti20, questo studio è il primo a delineare i passaggi e le potenziali insidie nell'imaging dell'utero murino gravid.
L'imager deve riconoscere potenziali artefatti che possono imitare una gravidanza precoce o utero gravid o che possono interferire con l'imaging dell'utero e degli embrioni. Seguire le corna uterine lateralmente ridurrà la probabilità di confondere altri organi e manufatti nell'addome per l'utero (e piccoli embrioni). I potenziali artefatti che possono essere scambiati per utero, embrioni e / o oggetti ostruttivi includono il gas intestinale e intestinale, le feci, la milza, il fegato e lo stomaco.
Questo metodo richiede anestesia generale e siamo attenti a limitare: 1) tempo di imaging e 2) frequenza dei controlli di gravidanza, per ridurre qualsiasi possibilità di perdita intrauterina dovuta all'anestesia. Sebbene anestetici e analgesici sembrino essere sicuri nel complesso durante lagravidanza 21, un'esposizione significativa può avere conseguenze sulla crescita embrionale deltopo 22. Poiché i modelli knockout del topo spesso dimostrano la morte perinatale prenatale o precoce, l'esposizione degli embrioni all'anestesia generale durante questa imaging può (almeno teoricamente) aumentare il rischio di morte o influenzare la loro biologia in modi sconosciuti. Sebbene un limite di tempo assoluto sia sconosciuto, cerchiamo di limitare ogni sessione di imaging a non più di 15 minuti e a 2-3 sessioni di imaging (massimo) per gravidanza. Il "principio ALARA" è prudente qui: basso quanto ragionevolmente raggiungibile.
Questo metodo consente un allevamento più efficiente e una rapida determinazione della scomparsa intrauterina. Questo è particolarmente importante negli esperimenti che usano modelli knockout che muoiono presto; altri esempi includono studi tossicologici. Mentre alcuni studi hanno dettagliato l'aumento di peso durante la gravidanza, è abbastanza chiaro che l'aumento di peso precoce (prima di E8.5) è piccolo e potrebbe non essere diverso dai cambiamenti di peso diurno. Inoltre, i dati sono stati ricavati solo da topi gravidi per la prima volta e potrebbero non riflettere gli effetti confondenti dei topi multi-gravidi10,11. Le gravidanze a tempo potrebbero non essere evidenti all'inizio, e specialmente con i topi geneticamente modificati, le perdite intrauterina possono essere comuni o addirittura influenzare l'intera lettiera. Quindi, semplicemente perché un topo non consegna una cucciolata non significa che non sia mai stata incinta. I topi possono essere ria accoppiati in una settimana se la femmina non è incinta; altrimenti, i ricercatori dovranno semplicemente aspettare per vedere se la femmina è rimasta incinta. Dopo che le abilità sono state sviluppate per fare di più che controllare semplicemente la gravidanza, questo metodo consentirà anche di mappare e monitorare gli embrioni man mano che la gravidanza progredisce. In questo modo, la tempistica ottimale per la raccolta degli embrioni può essere determinata se i tessuti devono essere raccolti prima della fine23.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilatory cream | |||
| Ethanol, 70% | |||
| Fur clippers | |||
| Gauze or KimWipes | |||
| Isoflurane | |||
| Medical oxygen (optional) | |||
| Medical tape | |||
| Mouse imaging system (including anesthesia set-up and imaging platform) | Fujifilm Visual Sonics | Various | Any system with 40 MHz center-frequency ultrasound transducer probe |
| Razor blade (not a safety razor) | |||
| Scale (to weigh mouse) | |||
| Ultrasound gel |
References
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