Summary
O ultrassom de alta resolução pode ajudar a agilizar experimentos que requerem camundongos com tempo cronometrado, determinando o estado da gravidez, idade gestacional e perdas de gravidez. Apresentado aqui é um protocolo para ilustrar métodos para avaliar a gravidez do rato, bem como potenciais armadilhas (artefatos de imagem) que podem imitar a gravidez.
Abstract
O camundongo é o modelo animal mamífero de escolha para muitas doenças humanas e processos biológicos. A biologia do desenvolvimento muitas vezes requer camundongos grávidas em estágio para determinar processos em evolução em vários momentos. Além disso, a melhor e eficiente criação de camundongos modelo requer uma avaliação das gestações cronometrárias. Mais comumente, os ratos são acasalados durante a noite, e a presença de um plugue vaginal é determinada; no entanto, o valor preditivo positivo dessa técnica é subótimo, e é preciso esperar para saber se o rato está realmente grávida. A biomicroscopia de ultrassom de alta resolução é uma ferramenta eficaz e eficiente para a imagem: 1) Se um rato está grávida; 2) Que estágio gestacional o mouse atingiu; e 3) Se há perdas intrauterinas. Além dos embriões e fetos, o pesquisador também deve reconhecer artefatos comuns na cavidade abdominal para não confundi-los com um útero gravido. Este artigo fornece um protocolo para imagens, juntamente com exemplos ilustrativos.
Introduction
O camundongo é o modelo mamífero preferido para muitas doenças humanas e processos biológicos1,2,3,4. Pesquisas em biologia do desenvolvimento muitas vezes exigem camundongos gestantes em estágio para determinar processos em evolução em vários momentos5,6,7,8. Além disso, a melhor e eficaz criação de camundongos modelo requer uma avaliação das gestações cronometrárias, particularmente quando os pesquisadores estão estudando os efeitos de uma mutação genética no desenvolvimento. Normalmente, os investigadores acasalam ratos heterozigos durante a noite, procuram um plugue vaginal no início da manhã seguinte e esperam que uma gravidez se acontebem. Determinar a perda intrauterina normalmente começa com a verificação de uma ninhada recém-nascida para proporções mendelianas de genótipos, depois trabalhando para trás sacrificando camundongos gestantes em vários estágios gestacionais, e recuperando os embriões. Os pesquisadores podem determinar o ganho de peso como métrica de uma gravidez positiva10,11; no entanto, especialmente com camundongos geneticamente modificados, as ninhadas podem ser muito pequenas e posteriormente ressordidas quando há perda intrauterina devido à qual o ganho de peso pode não ser óbvio (particularmente no início da gravidez, ~E6.5-8.5). Um rato pode parecer falsamente grávida devido, por exemplo, a um tumor abdominal benigno. Em essência, funciona "cego".
A biomicroscopia de ultrassom de alta resolução permite a visualização direta do útero gravid e o desenvolvimento de embriões de camundongos12,13,14,15,16. Embora tivéssemos inicialmente desenvolvido métodos para avaliar a fisiologia cardiovascular do camundongo embrionário16,17, reconhecemos a utilidade desta modalidade de imagem para agilizar a criação do nosso camundongo. Especificamente, não tínhamos mais que esperar para "ver" se um rato estava grávida, com base no óbvio ganho de peso ou no parto de uma ninhada; poderíamos determinar o estado gravid e reapreirto de ratos rapidamente se a represa não estivesse grávida. Além disso, perdas intrauterinas também poderiam ser facilmente imagens, e uma linha do tempo de perda poderia ser determinada sem sacrificar o mouse (ver Figura 1 para um esquema). Tempo, ratos modelo valiosos e fundos podem, assim, ser salvos.
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Protocol
Todas as etapas deste protocolo seguem o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina Grossman da Universidade de Nova York.
1. Acasalamento de camundongos para gestações cronometras
- Emparelhe o rato fêmea apropriado (geralmente um heterozigoto) em uma gaiola com o rato macho apropriado (geralmente um heterozigoto) para acasalamento durante a noite.
- Separe os ratos na manhã seguinte. Alternativamente, acasalam continuamente os camundongos femininos e machos, aumentando assim as chances de gravidez.
NOTA: No entanto, uma gravidez com tempo preciso não pode ser garantida com a alternativa, e o estadiamento de embriões de camundongos por ultrassom não é claro, especialmente quando o processo da doença resulta em retardamento do crescimento intrauterino. Se os embriões que carregam a variante genética forem considerados pequenos, procure os maiores companheiros de ninhada selvagens para medir a idade gestacional.- Opcional: Procure o plugue vaginal. Se não há plugue vaginal, o rato fêmea não foi acasalado. Se há um plugue vaginal, ainda é provável que o rato feminino não engravide.
- Hora do dia após o acasalamento noturno como E0.5.
- Realize imagens em E6.5-E.8.5 para determinar a gravidez e acasale os camundongos se o rato não estiver grávida (ver passo 1.1).
NOTA: Nesta fase, a represa feminina não está obviamente grávida aos olhos; portanto, a imagem de ultrassom permite determinação precoce e re-acasalamento.
2. Anestesia e preparação do rato
- Coloque o rato grávida na câmara de indução anestésico.
- Misture isoflurane com ar de sala ou oxigênio médico, com uma concentração de 2%-3% a 1 L/min de fluxo para induzir a sedação do camundongo gestante na câmara de indução.
NOTA: A sedação normalmente ocorre dentro de 1-2 min. O rato estará deitado ainda, e sua respiração terá diminuído. - Transfira rapidamente o mouse para a plataforma de imagem. A plataforma de imagem normalmente tem elementos de aquecimento também, o que pode ajudar a manter o mouse aquecido.
- Coloque o nariz do rato no nariz anestésico.
- Redirecione rapidamente a mistura isoflurane/oxigênio para o nariz da plataforma de imagem. Mantenha o isoflurane em 2%-3% a 1 L/min de fluxo.
- Determine o nível de sedação por pinça de pata, reflexo córnea, nível de respiração e qualquer movimento.
NOTA: O reflexo da córnea pode ser inicialmente determinado aplicando pomada hidratante aos olhos para evitar que eles sequem enquanto o rato é anestesiado (o rato não fecha os olhos). - Com o mouse deitado supino (em suas costas), tape as patas nas almofadas de eletrocardiograma (ECG) da plataforma de imagem.
NOTA: No entanto, um Eletrocardiograma não é necessário para este tipo de imagem. - Remova a pele do abdômen da represa grávida da seguinte forma:
- Molhe bem a pele abdominal com 70% de etanol, incluindo até as bordas laterais. Não aplique tanto que haja escorrida na plataforma.
NOTA: O etanol funciona melhor como lubrificante de barbear do que água. - Use a lâmina de barbear para raspar cuidadosamente o abdômen. Tenha cuidado para não cortar os mamilos.
- Limpe a pele raspada do abdômen com gaze ou alguns lenços umedecidos.
- Alternativamente, use um creme depilatório depois de usar os cortadores de pele para remover a maior parte da pele.
- Molhe bem a pele abdominal com 70% de etanol, incluindo até as bordas laterais. Não aplique tanto que haja escorrida na plataforma.
3. Imagem transabdominal do (presumido) rato grávida
- Depois que o abdômen for raspado, reduza o isoflurane para 1%-1,5%, mantendo ainda uma taxa de fluxo de 1 L/min. Monitore o nível de sedação pelo nível de respiração e quaisquer movimentos, bem como pitada de pata e/ou reflexo corneal.
NOTA: A frequência cardíaca do mouse anestesiado normalmente será de 400 a 500/min, dependendo da temperatura do núcleo (retal). Para fins de uma rápida verificação de gravidez, não aqueça o camundongo a uma temperatura fisiológica do núcleo; a frequência cardíaca estará mais próxima de 400-450/min, mas pode cair ainda mais com um ritmo irregular caso o rato fique frio com imagens prolongadas.- É importante ressaltar que as respirações são moderadas em profundidade e regularidade, não erráticas ou agonas (ofegante: profunda, lenta e errática, com profundas retrações intercostais e subcostais).
NOTA: A taxa respiratória do rato não ventilado e anestesiado normalmente será de 60-100/min. Veja https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html e https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice.
- É importante ressaltar que as respirações são moderadas em profundidade e regularidade, não erráticas ou agonas (ofegante: profunda, lenta e errática, com profundas retrações intercostais e subcostais).
- Aplique o gel de ultrassom (acoplamento acústico) ao abdômen generosamente.
- Coloque o transdutor de imagem no abdômen para orientá-lo em um plano horizontal: oriente a sonda para obter uma orientação esquerda-direita no sistema de imagem; o "ponto" ou cume indicado na lateral da sonda de imagem deve estar voltado para a direita.
NOTA: Deslizar a sonda de imagem para a direita do mouse deve deslocar a imagem correspondente no sistema de ultrassom para a direita do mouse (imagine olhar "para cima" da cauda do mouse — a direita do mouse ficará no monitor).- Normalmente, use o sistema de transmissão do sistema de imagem e o sistema manipulador de trilhos. Aqui, imagens de "mão livre" têm sido usadas em que o transdutor de imagem é portátil (duas mãos são mais firmes que uma) e que permite movimentos mais rápidos ao redor do abdômen. Esses movimentos, como será descrito abaixo, incluem movimentos rotacionais e translacionais. No entanto, isso requer mais prática.
- Identifique a bexiga na tela(Vídeo 1).
- Escaneando caudally da bexiga, identificar a vagina. Em seguida, escaneando lentamente e suavemente em uma direção craniana, identificar a bifurcação da vagina nos chifres uterinos esquerdo e direito(Figura 2; Vídeo 1).
- Iniciar o levantamento do útero (chifres uterinos esquerdo e direito)13 (Figura 3; Vídeo 2).
NOTA: Até a meia gestação (E10.5 ou E11.5), os embriões do rato serão posicionados ao longo das periferias direita e esquerda. À medida que crescem, as porções mais distais do útero e seus embriões correspondentes se transformarão para fora e posteriormente. À medida que os embriões crescem ainda mais (E15,5 e posteriores, geralmente), os fetos do rato serão posicionados quase aleatoriamente em várias direções, e torna-se difícil "rastrear" um útero de proximal a distal.- Escaneie rapidamente simplesmente para verificar se um rato está grávida ou não. Este método rápido requer apenas o reconhecimento de um útero gravid e embriões de camundongos.
- Alternativamente, tome tempo extra para enumerar os embriões (vivos, mortos, resorgados) em cada chifre uterino.
NOTA: Em geral, um embrião vivo exibirá órgãos distintos, como coração, membros, cabeça com ventrículos e olhos. Um embrião morto assume uma aparência homogênea e "mole", a menos que apenas morto. Os embriões resorulados têm uma mancha ecogênica no meio de um útero de aparência gravida(Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8). - Para determinar se um embrião está realmente vivo, procure os batimentos cardíacos e/ou fluxo sanguíneo.
NOTA: O mapeamento do fluxo doppler de cor pode ajudar na determinação da presença do fluxo sanguíneo, tanto no embrião quanto no cordão umbilical. Em geral, isso pode ser aplicado a embriões com mais de idade que o E8.5. - Reconhecer artefatos potenciais que podem imitar um útero gravi(Figura 9, Figura 10). Além disso, como o gás intestinal e outros artefatos de "sombra" de ultrassom podem obscurecer segmentos do chifre uterino, realizar a imagem a partir de múltiplos pontos de vista para garantir a visualização adequada do útero.
- Após a conclusão da pesquisa, limpe o gel do abdômen com gaze ou lenços umedecidos. Tente remover o máximo possível, pois o gel tende a esfriar o mouse.
- Desarpe as patas e remova o rato do nariz anestésico.
- Mova suavemente o rato de volta para a gaiola dela. Ela deve acordar e começar a se mover dentro de um minuto ou mais.
NOTA: Camundongos geneticamente modificados podem demorar um pouco mais para se recuperar da anestesia e precisam ser observados mais de perto.
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Representative Results
Este protocolo permitirá que um investigador determine com confiança se um camundongo está grávida, inclusive durante os estágios iniciais e determinar se há perdas embrionárias ou fetais óbvias sem precisar sacrificar a represa grávida. Este protocolo é especialmente útil ao criar camundongos geneticamente modificados; tipicamente, cruzes heterozigous x heterozigosas para produzir descendentes homozigos leva ao fracasso do desenvolvimento adequado, o que causa letalidade pré-natal. A Figura 1 retrata uma situação representativa na qual os embriões morrem progressivamente e, em seguida, são resorvidos através da gestação média. A Figura 2 mostra como encontrar os chifres uterinos esquerdo e direito seguindo a vagina através de sua bifurcação. Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Figura 8e Vídeo 3 mostram embriões de camundongos em vários estágios de desenvolvimento. Embriões de camundongos em estágio inicial, embriões mortos ou embriões resordidos podem se assemelhar a outros órgãos no abdômen ou fezes nos intestinos, ou, por outro lado, as alças intestinais podem imitar o útero não gravid. As figuras 9 e figura 10,bem como o Vídeo 4 e o Vídeo 5,demonstram tais artefatos de imagem potenciais que podem imitar o útero gravid, para o qual o investigador deve estar em alerta.
Figura 1: Diagrama esquemático de um abdômen teórico de camundongos grávidas, retratado em E11,5, e novamente em E14,5. Até a gestação média (E10.5 ou E11.5), os embriões do camundongo serão posicionados ao longo dos aspectos periféricos direito e esquerdo do abdômen. À medida que os embriões crescem, as porções mais distais do útero e seus embriões correspondentes se transformarão para fora e posteriormente. À medida que os embriões crescem ainda mais (E15,5 e posteriores, geralmente), os fetos do rato serão posicionados quase aleatoriamente em várias direções, e torna-se difícil "rastrear" um útero de proximal a distal. Quando há letalidade pré-natal em um modelo de camundongo geneticamente modificado, os embriões (círculos abertos) podem morrer; os embriões mortos (círculos eclodidos) eventualmente se tornarão resordidos (círculos sólidos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Uma vez que se encontre a vagina(A),imediatamente à direita da bexiga, varrer cranialmente demonstrará a bifurcação(B)para os chifres uterinos direito e esquerdo(D)–(F).
Barra de escala (A) = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens de útero não gravid (não gestante) (identificado pelas linhas de setas). O útero pode variar em espessura: mais grosso em (A), (B), (E); fina com uma linha ecogênica fina central(C), muito fina(D),ou pode até conter estruturas císticas pequenas que não devem ser confundidas com concepti (B) e (E) especialmente, embora isso possa ser difícil de determinar. (A) é um chifre uterino direito; isso é mais difícil de seguir em nossa experiência devido ao gás intestinal. (B)–(F) são chifres uterinos esquerdos; (F) é bastante distal/lateral e por isso torna-se mais difícil de imagem devido ao aumento do artefato de gás intestinal. Barra de escala (A) = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Embriões resorgados e mortos têm aparências distintas. Os embriões resored, que são muito comumente encontrados, são envoltos dentro de um saco uterino redondo (gravid) que parece relativamente homogêneo, exceto por um "ponto" ecológico central (muito brilhante) — flechas em (A) e(B). (C) mostra embriões resorulados ou mortos; há uma aparência totalmente homogênea e "mole" no útero, e vemos provavelmente 3-4 embriões mortos neste quadro. (D) mostra um embrião recentemente morto, que ainda mostra algumas estruturas; também parece haver detritos celulares no saco amniótico. Em(E),o embrião morto é muito encolhido e ainda está ligado à placenta ("P"). (F) mostra uma aparência homogênea e "mole" de um embrião que provavelmente morreu de 1 a 2 dias antes, mas ainda não está completamente resorgado. Barra de escala para (A) e (D) = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Embriões em estágio inicial, de aproximadamente E5.5 (A) e E6.5 (B) a E8.5 ((C) e (D)). Há variações nas aparências, e os estágios estimados aqui foram baseados no tempo de acasalamento, bem como no aparecimento dos próprios embriões. Barra de escala (A) = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Os embriões E9.5 são consideravelmente maiores que os embriões E8.5 e estão começando a tomar forma. Imagens representativas, mostrando embriões adjacentes, são mostradas em (A) e(B). Barras de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Os embriões E10.5 exibem órgãos ainda mais claros, como a cabeça, a coluna e o coração. Imagens representativas, mostrando embriões adjacentes, são mostradas em todos os painéis; em(D), um embrião morto/resorção está adjacente a um embrião vivo. Barra de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Embriões mais antigos, aproximadamente E12,5(A),E14,5(B)e E15,5 (C). Planos oblíquos de imagem obscurecem um pouco a anatomia precisa, mas o coração (flecha) está na porção central de cada embrião; em(C), o miocárdio é agora mais ecogênico do que o sangue. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: O intestino, que é o órgão mais provável de ser confundido com o útero. Em (E), um embrião resored (pontas de flecha) sobreviva a um segmento de intestino (flechas). Em (F), um útero não gravid (pontas de flecha) sobresso um pequeno segmento de intestino (setas) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Artefatos de imagem adicionais no abdômen gravid incluem os rins, baço e fígado. (A) Rim direito; (B) Rim direito com artéria renal (setas); (C) Rim esquerdo; (D) Rim esquerdo com artéria renal (setas); (E)Baço; (F) Fígado sobreomentando um segmento de intestino; (G) Segmento de sobressoção renal do intestino; (H) Baço, fígado e rim esquerdo vistos em um plano de imagem. B = intestino; K= rim; L= fígado; S= baço. Barra de escala (A) = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O primeiro passo mais importante na imagem é identificar a vagina e, em seguida, determinar a bifurcação do chifre uterino para a esquerda e para a direita. Seguindo cada chifre uterino, o imager é menos propenso a identificar mal os laços do intestino como o útero. Além disso, compreender as variações no aparecimento do intestino (com/sem matéria fecal) é importante para distingui-las do útero; ocasionalmente, "bolas" fecais em laços intestinais podem imitar um útero gravid (grávida). Embora outros autores tenham descrito o diagnóstico de gravidez e encenação do desenvolvimento embrionário do camundongo17,18,19 incluindo a detecção de embriões resorgados20, este estudo é o primeiro a delinear os passos e potenciais armadilhas na imagem do útero murino gravid.
O imager deve reconhecer artefatos potenciais que podem imitar uma gravidez precoce ou útero gravid ou que podem interferir com a imagem do útero e dos embriões. Seguir os chifres uterinos lateralmente reduzirá a probabilidade de confundir outros órgãos e artefatos no abdômen para o útero (e pequenos embriões). Artefatos potenciais que podem ser confundidos com útero, embriões e/ou itens obstrutivos incluem o gás intestinal e intestinal, fezes, baço, fígado e estômago.
Este método requer anestesia geral, e temos o cuidado de limitar: 1) tempo de imagem e 2) frequência de verificações de gravidez, para reduzir qualquer chance de perda intrauterina devido à anestesia. Embora anestésicos e analgésicos pareçam ser seguros no geral durante a gravidez21, exposição significativa pode ter consequências no crescimento embrionário do camundongo22. Como os modelos de nocaute de camundongos frequentemente demonstram a morte pré-natal ou perinatal precoce, a exposição dos embriões à anestesia geral durante esta imagem pode (pelo menos teoricamente) aumentar o risco de morte ou influenciar sua biologia de maneiras desconhecidas. Embora um prazo absoluto seja desconhecido, tentamos limitar cada sessão de imagem a não mais do que 15 minutos, e a 2-3 sessões de imagem (máximo) por gravidez. O "princípio da ALARA" é prudente aqui: Tão baixo quanto razoavelmente alcançável.
Este método permite uma reprodução mais eficiente, bem como a rápida determinação da morte intrauterina. Isso é especialmente importante em experimentos usando modelos de nocaute que morrem cedo; outros exemplos incluem estudos toxicológicos. Embora alguns estudos tenham detalhado o ganho de peso durante a gravidez, é bastante claro que o ganho de peso precoce (antes do E8.5) é pequeno e pode não ser diferente das mudanças de peso diurnos. Além disso, os dados foram derivados apenas de camundongos gestantes de primeira hora e podem não refletir os efeitos confusos dos camundongos multi-gravid10,11. Gestações cronometradas podem não ser evidentes no início, e especialmente com camundongos geneticamente modificados, perdas intrauterinas podem ser comuns ou até mesmo afetar toda a ninhada. Assim, simplesmente porque um rato não entrega uma ninhada não significa que ela nunca esteve grávida. Os camundongos podem ser acasalados em uma semana se a fêmea não estiver grávida; caso contrário, os pesquisadores simplesmente terão que esperar para ver se a fêmea engravidou. Depois que as habilidades são desenvolvidas para fazer mais do que simplesmente verificar a gravidez, este método também permitirá mapear e monitorar os embriões à medida que a gravidez progride. Dessa forma, o tempo ideal para a colheita de embriões pode ser determinado se os tecidos devem ser colhidos antes da morte23.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Depilatory cream | |||
| Ethanol, 70% | |||
| Fur clippers | |||
| Gauze or KimWipes | |||
| Isoflurane | |||
| Medical oxygen (optional) | |||
| Medical tape | |||
| Mouse imaging system (including anesthesia set-up and imaging platform) | Fujifilm Visual Sonics | Various | Any system with 40 MHz center-frequency ultrasound transducer probe |
| Razor blade (not a safety razor) | |||
| Scale (to weigh mouse) | |||
| Ultrasound gel |
References
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