Summary
이 프로토콜은 동물 및 인간 피험자의 분변 샘플에서 고품질 총 RNA를 분리합니다. 상용 miRNA 분리 키트는 최적화된 양과 품질로 순수 RNA를 분리하기 위해 상당한 적응과 함께 사용됩니다. RNA 분리는 시퀀싱, 마이크로 어레이 및 RT-PCR과 같은 대부분의 다운스트림 RNA 분석에 적합합니다.
Abstract
RNA가 동물과 인간의 장 내강과 대변에 존재한다는 것이 분명해지고 있습니다. 아래에 설명된 프로토콜은 동물 및 인간 피험자의 분변 샘플에서 microRNA를 포함한 전체 RNA를 분리합니다. 목표는 RNA 시퀀싱, RT-PCR 및 마이크로 어레이와 같은 다운스트림 분석을 위해 총 RNA를 고순도 및 양으로 분리하는 것입니다. miRNA 분리에서 이 최적화된 프로토콜의 장점은 설명된 추가 세척 단계를 통해 고도로 정제된 RNA 생성물을 분리하는 기능, 샘플 재현탁에서 개선된 방법으로 얻은 RNA의 양 증가, 중요한 오염 제거 팁입니다. 한 가지 한계는 이러한 샘플 크기가 간기의 명확한 형성에 어려움을 야기하기 때문에 200mg 이상의 더 큰 샘플을 처리하고 정제할 수 없다는 것입니다. 결과적으로, 큰 샘플 크기는 프로토콜에 설명된 대로 추출될 수성상을 최종적으로 분리된 RNA의 품질에 영향을 미치는 유기물로 오염시킬 수 있습니다. 그러나 최대 200mg의 샘플에서 분리 된 RNA는 대부분의 다운 스트림 분석에 충분합니다.
Introduction
세포외 RNA는 많은생물학적 과정을 매개하는 중요한 인자로 인식되고 있다1. 대변의 세포외 RNA는 2008년 대장암 및 활동성 궤양성 대장염2의 마커로 처음 보고되었으며, 최근에는 장내강 및 대변의 정상 성분으로 밝혀졌으며 숙주-미생물 소통 3,4,5를 매개합니다. 이 RNA 분리 프로토콜의 목적은 동물 및 인간 피험자로부터 수집 한 분변 샘플에서 고품질 세포 외 RNA를 추출하는 것입니다. 이 프로토콜은 상용 miRNA 분리 키트에서 채택되었습니다. 획득한 RNA는 RNA 시퀀싱, RT-PCR 및 마이크로 어레이와 같은 다운스트림 분석에 활용됩니다. 이 프로토콜에는 동물과 인간의 대변에서 발견되는 RNA의 양과 질을 극대화하기위한 몇 가지 중요하고 유용한 팁이 포함되어 있습니다. 이 RNA (microRNA 포함) 분리 방법을 개발하고 최적화하는 이유는 대변의 미생물 RNA를 줄이고 연구 연구의 변수를 제한하며 다양한 교란 요인과 오염원을 고려하지 않고 장의 RNA 구성을 분석하기 위해서입니다. 참고로, 이 RNA 분리는 살아있는 세포 및 살아있는 미생물(세포 RNA)에서 RNA의 방출을 최소화합니다. 장 세포에서 방출되거나 음식 섭취를 통해 획득 된 세포 외 RNA에 중점을 둡니다. 원칙적으로이 방법은 미생물 전사체를 조사하는 연구에는 적합하지 않습니다.
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Protocol
여기에 설명 된 연구 동물과 관련된 모든 방법은 하버드 의과 대학 브리검 여성 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
여기에 설명 된 인간 연구 주제와 관련된 모든 방법은 파트너 인간 연구위원회가 정한 지침을 따릅니다.
1. 분변 샘플 수집
- 오토클레이브 또는 스크류 캡이 있는 멸균 및 뉴클레아제가 없는 2 mL 마이크로원심분리 튜브를 실험에서 각 동물 대상체에 대해 준비하였다.
- 인간 피험자의 경우, 각 피험자에 대해 적절하고 뉴클레아제가 없는 멸균 대변 표본 수집 장치를 제공합니다.
- 멸균 환경에서 각 동물 대상의 대변 샘플 25-100mg(마우스 분변 샘플의 경우 약 1-4개의 분변 펠릿)을 수집합니다.
알림: 두 개 이상의 분변 펠릿(~50mg 이상)이 최고 순도의 RNA를 얻는 데 선호됩니다.- 필요한 모든 개인 보호 장비 (PPE) 및 재료 (예 : 실험실 장갑 한 켤레, 소독제 스프레이 및 멸균 종이 타월)를 활용하여 동물 연구 대상이 놓인 작업 영역을 살균하여 분변 샘플 오염을 방지하십시오.
- 인간 피험자의 경우 각 연구 피험자 / 수집가에게 가능한 한 멸균 된 환경에서 100-200mg의 대변 샘플을 수집하도록 지시하십시오. 표준 멸균 작업을 사용하고 대변 표본 오염을 방지하십시오.
- 필요한 모든 개인 보호 장비 (PPE) 및 재료 (예 : 실험실 장갑 한 켤레, 소독제 스프레이 및 멸균 종이 타월)를 활용하여 동물 연구 대상이 놓인 작업 영역을 살균하여 분변 샘플 오염을 방지하십시오.
- 오염을 방지하기 위해 다른 표면을 건드리지 않고 스크류 캡이 있는 2mL 미세 원심분리 튜브에 각 동물 피험자의 분변 샘플을 직접 수집합니다.
- 인간 피험자의 경우, 오염을 피하기 위해 제공된 적용 가능한 수집 장치(예: 멸균 대변 표본 수집 키트)에 직접 배변하도록 각 피험자에게 지시합니다.
알림: 변기 표면, 물, 소변 또는 기타 멸균되지 않은 표면/물체에 의한 오염을 피하도록 지시하십시오.
- 인간 피험자의 경우, 오염을 피하기 위해 제공된 적용 가능한 수집 장치(예: 멸균 대변 표본 수집 키트)에 직접 배변하도록 각 피험자에게 지시합니다.
- 아래 단계에 설명된 대로 분변 재현탁 전에 RNA의 양과 품질을 높이기 위해 2mL 미세 원심분리 튜브에서 수집한 분변 샘플을 -80°C에서 즉시 동결하거나 드라이아이스 양동이에 넣습니다.
- 인간 대변 표본의 경우, 200mg의 각 신선한 검체를 스크류 캡이 있는 2mL 미세 원심분리 튜브에 분취하고 아래 설명된 대로 대변 재현탁 전에 -80°C에서 동결합니다.
- 스크류 캡이 있는 2mL 미세 원심분리 튜브에 없는 대변 표본을 보관하려면 아래 설명된 대로 대변 재현탁 전에 냉동 검체 100-200mg을 각각 칭량하고 스크류 캡이 있는 별도의 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
알림: 인간 대변 표본의 경우 RNA 분리를 위해 200mg 이상의 대변 검체를 복용하면 다음 단계에서 어려움을 겪을 수 있으므로 피하십시오. 2mL 미세 원심분리 튜브에 과부하된 시료를 사용하면 수성상, 유기상 및 간상이 명확하게 형성되지 않고 분리되지 않을 수 있습니다. 여기서 절차를 일시 중지할 수 있습니다.
- 스크류 캡이 있는 2mL 미세 원심분리 튜브에 없는 대변 표본을 보관하려면 아래 설명된 대로 대변 재현탁 전에 냉동 검체 100-200mg을 각각 칭량하고 스크류 캡이 있는 별도의 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 인간 대변 표본의 경우, 200mg의 각 신선한 검체를 스크류 캡이 있는 2mL 미세 원심분리 튜브에 분취하고 아래 설명된 대로 대변 재현탁 전에 -80°C에서 동결합니다.
2. 세척액의 준비
- 21mL의 미국 화학 학회(ACS) 등급 100% 에탄올을 miRNA 분리 키트( 재료 표 참조)에 제공된 세척 용액 1에 추가하여 병에 표시된 대로 최종 부피 30mL에 도달합니다. 모든 것이 병에 녹을 때까지 소용돌이.
- 병에 표시된 대로 제공된 세척액 2/3에 ACS 등급 100% 에탄올 40mL를 추가하여 최종 부피 50mL에 도달합니다. 5초 동안 또는 최종 혼합물이 잘 혼합될 때까지 와동합니다.
3. 장비 및 재료의 준비
- 작업 영역 및 장비(예: 실험실 벤치, 화학 흄 후드의 작업 영역 및 마이크로 원심분리기 튜브 랙)에 리보뉴클레아제(RNase) 오염 제거 용액(예: 시판되는 RNase 오염 제거 용액)을 스프레이합니다. 오염을 방지하려면 RNase 오염 제거 용액과 함께 필요할 때마다 표면에 바르십시오.
- 깨끗한 실험실 코트를 입고 안면 마스크를 착용하고 적절한 실험실 장갑을 착용하여 대변 샘플의 RNA를 인간 피부에 존재하는 뉴클레아제로부터 보호하십시오. 장갑에 RNase 오염 제거 용액을 뿌리고 장갑을 자주 교체하여 오염을 방지하십시오.
- 대변 재현탁 전에 해동을 방지하기 위해 -80 ° C에서 보관 된 분변 샘플 용 드라이 아이스 양동이와 저장 수명을 연장하기 위해 산 페놀 : 클로로포름과 같은 재료 용 얼음 양동이를 준비하십시오.
알림: 프로토콜에 사용된 배지를 포함한 물질이 뉴클레아제의 오염 없이 멸균되었는지 확인하십시오.
4. 대변 재현탁
- 25-100mg의 분변 샘플을 600μL의 멸균 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)에 재현탁합니다.
주의 : 분변 샘플은 샘플의 세포가 해동 될 때 얼음 결정이 내부 및 외부 세포 구획을 파열하므로 RNase와 세포 RNA의 방출을 최소화하기 위해 부분 해동없이 -80 ° C에서 해동 될 때 즉시 처리되어야합니다.- 실온(RT)에서 분변 샘플이 들어 있는 스크류 캡을 사용하여 2mL 미세 원심분리 튜브에 600μL의 1x DPBS를 추가합니다.
- 분변 샘플 600μL에 잠긴 1x DPBS의 혼합물을 RT에서 30분 동안 캡핑된 2mL 마이크로원심분리 튜브에 인큐베이션합니다.
- 1mL 피펫 팁으로 으깨고 뚜껑을 덮은 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 잘 와동하여 혼합물을 재현탁합니다. RNA의 양과 품질을 최적화하고 높이려면 S4000 (또는 4000rpm) 및 45 초에서 1 사이클 동안 설정된 균질 기가있는 혼합물을 재현탁하십시오.
5. 유기 추출
주의 : 독성 및 인화성으로 인해 산-페놀 : 클로로포름 및 ACS 등급 100 % 에탄올을 사용하여 6 단계까지 다음 단계에 유해 화학 흄 후드를 사용하십시오. 필요에 따라 PPE를 교체하고 위험 물질을 취급할 때 적절한 표준 예방 조치를 따르십시오.
- 600 μL의 산-페놀:클로로포름으로 RNA를 추출한다(필요한 산-페놀:클로로포름의 부피는 단계 4.1에서 첨가된 1x DPBS의 초기 부피와 동일함).
- 600 μL의 산-페놀:클로로포름을 단계 4.1의 현탁액에 첨가한다.
참고: 산-페놀: 상부 상이 수성 완충액과 혼합됨에 따라 병의 하부 단계에서 클로로포름을 철회합니다. 이 두 단계 사이의 간기가 교란되면 오염을 피하기 위해 간기가 다시 확립 될 때만 산 - 페놀 : 클로로포름을 기다렸다가 철회하십시오.
- 600 μL의 산-페놀:클로로포름을 단계 4.1의 현탁액에 첨가한다.
- 혼합물을 60 초 동안 와동시켜 완전히 혼합하십시오. 대안적으로, 수율에서 RNA의 양을 최적화하고 증가시키기 위해, S4000 및 45 s에서 1 사이클 동안 설정된 균질기를 사용하여 혼합한다.
- RT에서 10,000 x g 에서 15분 동안 원심분리하여 미세 원심분리기로 수성 및 유기상을 분리합니다. 원심 분리 후, 간상은 콤팩트해야한다. 그렇지 않은 경우 원심 분리를 반복하십시오.
참고: 원심분리를 여러 번 반복한 후 첨가된 산-페놀:클로로포름의 부피에 대한 초기 부피의 비율이 고르지 않아 간기가 원하는 만큼 콤팩트할 수 없는 경우 오염을 피하기 위해 더 주의해서 성상을 회수하십시오. - 수성 상을 회수하고 힌지 캡이 있는 새 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다(miRNA 분리 키트에서 제공하지 않음).
- 하부 상을 방해하지 않고 수성(또는 상부)상을 조심스럽게 제거하고 힌지 캡이 있는 새 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 전송된 부피(예: ~500μL)에 유의하십시오.
참고 : 간기가 콤팩트하고 상부 상이 명확하게 분리되면 수성 상 상단에 몇 개의 작은 잔류 입자가있을 수 있습니다. 이러한 잔류물을 피하고 소량의 수성상만 얻을 수 있는 경우에도 고품질 RNA 수율을 보장하기 위해 가시적이고 명확하게 분리된 수성상만 회수하도록 조심스럽게 피펫팅하십시오.
- 하부 상을 방해하지 않고 수성(또는 상부)상을 조심스럽게 제거하고 힌지 캡이 있는 새 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 전송된 부피(예: ~500μL)에 유의하십시오.
6. 최종 RNA 분리
- 1.25 부피의 RT ACS 등급 100% 에탄올을 2 mL 미세원심분리 튜브 내의 수성상에 첨가한다(예를 들어, 단계 5.4로부터 500μL의 수성상을 회수하는 경우 625μL의 100% 에탄올을 추가한다). 소용돌이 3 초.
- miRNA 분리 키트에 제공된 필터 카트리지를 통해 수성상/에탄올 혼합물을 로드합니다.
- 각 샘플에 대해 필터 카트리지를 키트에서 제공하는 수집 튜브 중 하나에 넣습니다.
- 600μL의 수성상/에탄올 혼합물을 피펫팅하여 필터 카트리지에 넣습니다.
참고: 피펫팅하기 전에 혼합물을 잠시 와동시켜 에탄올을 수용액과 완전히 혼합합니다. 한 번에 700μL 이하의 수성상/에탄올 혼합물을 로딩할 수 있습니다.
- 600μL의 수성상/에탄올 혼합물을 피펫팅하여 필터 카트리지에 넣습니다.
- 혼합물을 여과하기 위해 10,000 x g 에서 90초 동안 원심분리합니다. 더 빠른 속도로 회전하면 필터가 손상될 수 있습니다.
- 여과액을 버리고 모든 혼합물이 연속적인 적용에서 동일한 필터 멤브레인을 통해 여과될 때까지 6.2.1 내지 6.2.2단계를 반복한다. 아래 세척 단계에 동일한 수집 튜브를 보관하고 재사용하십시오.
- 700μL의 miRNA 세척 용액 1로 필터를 세척합니다.
주의: miRNA 세척 용액 1에는 피부 자극과 심각한 눈 손상을 유발할 수 있는 구아니딘 티오시아네이트가 포함되어 있습니다. 필요한 PPE를 착용하십시오 (예 : 장갑, 안면 보호대, 보호용 실험실 코트). 필요에 따라 장갑을 자주 교체하십시오.- ACS 등급 100% 에탄올로 준비된 작업 용액인 miRNA 세척 용액 1 700μL를 필터 카트리지에 적용합니다.
- 60초 동안 원심분리하여 필터 카트리지를 통해 miRNA 세척 용액 1을 여과합니다.
- 수집 튜브에서 여과액을 버리고 동일한 필터 카트리지를 동일한 수집 튜브에 넣습니다.
- 세척액으로 필터를 2/3회 각각 700μL, 500μL 및 250μL의 부피로 연속적으로 세척합니다.
- ACS 등급 100% 에탄올로 준비된 작업 용액인 세척액 2/3 700μL를 필터 카트리지에 바릅니다.
- 10,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 수집 튜브에서 여과액을 버리고 동일한 필터 카트리지를 동일한 수집 튜브에 넣습니다.
- 500μL의 세척액 2/3을 필터 카트리지에 바릅니다.
- 10,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 수집 튜브에서 여과액을 버리고 동일한 필터 카트리지를 동일한 수집 튜브에 넣습니다.
- 250μL의 세척액 2/3을 필터 카트리지에 바릅니다.
- 10,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 수집 튜브에서 여액을 폐기하십시오.
- 필터 카트리지를 새 수집 튜브로 옮기고 어셈블리를 5분 동안 돌려 필터에서 잔류 유체를 제거합니다.
- ACS 등급 100% 에탄올로 준비된 작업 용액인 세척액 2/3 700μL를 필터 카트리지에 바릅니다.
- 각 샘플에 대해 필터 카트리지를 키트에서 제공하는 수집 튜브 중 하나에 넣습니다.
7. 50 μL 뉴클레아제가 없는 물로 RNA 용리
- 필터 카트리지를 새 수집 튜브로 옮깁니다. 뉴클레아제가 없는 물 50μL를 필터 중앙에 피펫팅하고 수집 튜브를 캡핑합니다.
- RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
- RNA를 새 수집 튜브로 회수하기 위해 8,000 x g 에서 5분 동안 회전합니다.
- 형광계를 사용하여 회수된 분변 RNA의 농도와 순도를 결정합니다. 회수된 분변 RNA는 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
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Representative Results
대표적인 RNA를 50mg 마우스 분변 샘플(2개의 마우스 분변 펠릿) 및 100mg 인간 대변 샘플에서 각각 분리하고 50μL 뉴클레아제가 없는 물에서 용리시켰다. 농도의 분광 광도계 분석은 각각 49 μg 및 16 μg RNA의 총량이 분리되었음을 시사한다 (표 1). RNA 순도는 ~2.0의 A260/A280 비율 및 ~1.8의 A260/A230 비율로 표시된 바와 같이 높았다(표 1). 보고된바와 같이 3, 대변에 있는 대부분의 RNA는 마이크로RNA이며 이러한 마이크로RNA는 엑소좀에 존재할 수 있습니다. 이와 일치하게, RNA의 칩 기반 전기영동 분석은 마우스 및 인간 대변에서 분리된 대표적인 RNA가 18S 및 28S rRNA 조성이 낮거나 부족하고, 분리된 RNA의 크기가 작은 RNA 영역에 속한다는 것을 시사합니다(그림 1A). 칩 기반 전기영동을 통한 더 작은 RNA 전기영동은 RNA의 상당 부분이 microRNA 크기임을 보여줍니다(그림 1B). 이는 소형 RNA 바이오분석기를 사용하여 완료된 정량화가 이전 분석6으로 얻은 정량과 유사하다는 관찰과 일치합니다.
| 샘플 아이디 | 용리 부피 (μL) | RNA 농도 (초당 밀리엘) | A260/A280 | A260/A230 | 수율 (ng) |
| 마우스 | 50 | 978.333 | 2.036 | 1.897 | 48916.65 |
| 사람의 | 50 | 330.759 | 1.981 | 1.849 | 16537.95 |
표 1: 이 프로토콜로 분리된 RNA의 대표적인 나노드롭 분석. 대표적인 RNA는 2개의 마우스 대변 펠릿 또는 100mg의 인간 대변 표본으로부터 분리되었고, 50μL 뉴클레아제가 없는 물에서 용리되었다. RNA 농도, A260/A280의 비율 및 A260/A230의 비율을 나노드롭으로 측정하였다.
그림 1: 분변 RNA 분리물의 크기 분포에 대한 대표적인 칩 기반 전기영동 분석. (a) 2개의 마우스 대변 펠릿 (왼쪽 패널) 및 100 mg 인간 대변 표본 (오른쪽 패널)으로부터 단리된 대표적인 RNA를 여기에 기재된 프로토콜을 사용하여 칩 기반 전기영동 분석을 사용하여 특성화하였다. 이 분석은 대부분의 RNA 분리가 작은 RNA임을 시사합니다. (b) 분리물을 칩 기반 전기영동 시스템으로 소형 RNA 전기영동을 실시한 후 분리물의 크기 분포를 분석하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
분리 7 동안 RNase 오염을 방지하기 위해 RNase가없는 기술을 사용하는 것이중요합니다. 원심분리 및 조밀한 간상의 형성 후, 성상을 회수할 때 간상, 하부상 및 수성상 상단에 떠 있는 입자 오염 물질을 피하는 것이 중요합니다. 또한 500μL 및 250μL 세척액 2/3을 사용한 두 가지 세척 단계가 추가되어 최적화된 품질을 위해 필터 멤브레인의 오염 물질을 제거합니다. 또한, 200mg 이상의 시작 샘플 물질은 간기의 명확한 형성에 어려움을 초래할 수 있으므로 권장하지 않습니다. 유사하게, 25mg 미만의 샘플 물질은 다운스트림 분석을 위해 충분한 RNA 샘플을 추출하기에 충분하지 않을 수 있으므로 권장되지 않습니다.
마이크로바이옴 연구의 놀라운 성장은 미생물 종, 유전자의 측정을미생물 프로파일의 메타전사 연구로 이끌었습니다8. 대변의 MicroRNA는 질병 9,10,11의 마커로 연구되었습니다. 숙주-미생물 상호작용을 매개하는 분변 마이크로RNA에 대한 첫 번째 보고3 이후, 장내 생태계에서 숙주와 식단의 기여도를 조사하기 위한 연구가 증가하고 있습니다12,13,14. 주목할 만하게도, 장내 내강과 대변에 미생물이 풍부하기 때문에 숙주-미생물 상호 작용의 숙주 팔에 초점을 맞춘 연구는 미생물의 RNA 오염을 최소화해야합니다. 따라서, 세포 용해 단계(15)를 포함하는 RNA 추출 프로토콜은 숙주 및 식이로부터 방출된 RNA의 연구에 이상적이지 않다. 따라서 우리는 대변에서 살아있는 박테리아와 살아있는 숙주 세포에서 RNA의 오염을 최소화하기 위한 용해 단계를 제거하기 위해 이 프로토콜을 조정했습니다.
이 프로토콜은 분변 또는 장 내강 함량의 세포 외 RNA가 관심의 대상인 연구에 효과적입니다. 이 프로토콜을 사용하여 분리된 RNA는 마이크로RNA를 주요 성분으로 포함하는 전체 RNA이다. 이 프로토콜은 RNA가 엑소 좀, 미세 소포 또는 소포가없는 형태인지 여부를 구별하지 않습니다.
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Disclosures
저자는이 프로토콜 논문에 설명 된 연구 방법과 관련된 관련 또는 물질적 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 하버드 의과 대학의 바이오 폴리머 시설에서 바이오 분석기에 대한 기술 지원을 받았습니다. 이 연구는 국립 다발성 경화증 학회 연구 보조금 RG-1707-28516 (HLW 및 SL)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Thermo Fischer Scientific | AM9720 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-144 | |
| Gloves | |||
| Microcentrifuge | |||
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1561 | |
| Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL) | |||
| Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) | Thermo Fischer Scientific | AM9937 | |
| Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter) | |||
| PowerLyzer 24 Homogenizer | QIAGEN | 13155 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fischer Scientific | AM9780 | |
| Vortex Shaker |
References
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