Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fecale (micro) RNA-isolatie

Published: October 28, 2020 doi: 10.3791/61908
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Evergrande Center for Immunologic Diseases, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

Summary

Dit protocol isoleert totaal RNA van hoge kwaliteit uit fecale monsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Een commerciële miRNA-isolatiekit wordt gebruikt met aanzienlijke aanpassing om zuiver RNA te isoleren met geoptimaliseerde kwantiteit en kwaliteit. De RNA-isolaten zijn goed voor de meeste downstream RNA-assays zoals sequencing, micro-array en RT-PCR.

Abstract

Het wordt duidelijk dat RNA voorkomt in het darmlumen en uitwerpselen bij dieren en mensen. Het hieronder beschreven protocol isoleert totaal RNA inclusief microRNA's uit fecale monsters van dierlijke en menselijke proefpersonen. Het doel is om totaal RNA met een hoge zuiverheid en hoeveelheid te isoleren voor downstream analyses zoals RNA-sequencing, RT-PCR en micro-array. De voordelen van dit geoptimaliseerde protocol in de miRNA-isolatie zijn mogelijkheden om sterk gezuiverde RNA-producten te isoleren met extra wasstappen beschreven, verhoogde hoeveelheid RNA verkregen met een verbeterde methode in de resuspensie van monster en belangrijke tips voor decontaminatie. Een beperking is het onvermogen om grotere monsters van meer dan 200 mg te verwerken en te zuiveren, omdat deze steekproefgroottes een probleem zouden veroorzaken bij de duidelijke vorming van de interfase. Bijgevolg kan de grote monstergrootte de te extraheren waterige fase zoals beschreven in het protocol verontreinigen met organische stoffen die uiteindelijk de kwaliteit van het geïsoleerde RNA beïnvloeden. RNA-isolaten uit een monster van maximaal 200 mg zijn echter voldoende voor de meeste downstream-analyses.

Introduction

Extracellulair RNA wordt erkend als een belangrijke factor die veel biologische processen bemiddelt1. Extracellulair RNA in de ontlasting werd voor het eerst gemeld in 2008 als een marker voor darmkanker en actieve colitis ulcerosa2, en het werd onlangs onthuld als een normaal onderdeel van het darmlumen en de ontlasting en bemiddelt gastheer-microbe communicatie 3,4,5. Het doel van dit RNA-isolatieprotocol is om extracellulair RNA van hoge kwaliteit te extraheren uit fecale monsters die zijn verzameld van dierlijke en menselijke proefpersonen. Het protocol is aangepast van een commerciële miRNA Isolation Kit. Het verkregen RNA wordt gebruikt voor downstream-analyses zoals RNA-sequencing, RT-PCR en micro-array. Het protocol bevat verschillende belangrijke en nuttige tips om de kwantiteit en kwaliteit van RNA in de ontlasting van dieren en mensen te maximaliseren. De reden om deze methode van RNA (inclusief microRNA) isolatie te ontwikkelen en te optimaliseren, is om microbieel RNA in de ontlasting te verminderen, de variabelen in de onderzoeksstudies te beperken en de RNA-samenstelling in de darm te analyseren zonder rekening te houden met verschillende verstorende factoren en bronnen van besmetting. Van belang is dat deze RNA-isolatie de afgifte van RNA uit levende cellen en levende microben (cellulair RNA) minimaliseert. Het richt zich op extracellulaire RNA's die zijn vrijgegeven door darmcellen of zijn verkregen via voedselinname. In principe is deze methode niet geschikt voor studies waarbij het microbiële transcriptoom wordt onderzocht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle methoden met onderzoeksdieren die hier worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.

Alle methoden met menselijke proefpersonen die hier worden beschreven, zijn in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door de Partners Human Research Committee.

1. Verzameling fecale monsters

  1. Autoclaaf of bereid een steriele en nucleasevrije 2 ml microcentrifugebuis met een schroefdop voor elke proefpersoon in een experiment.
    1. Zorg voor menselijke proefpersonen voor een geschikt, nucleasevrij en steriel ontlastingsmonsterverzamelapparaat voor elk onderwerp.
  2. Verzamel 25-100 mg (ongeveer 1-4 fecale pellets voor fecale monsters van muizen) fecale monsters van elke proefpersoon in een steriele omgeving.
    OPMERKING: Twee of meer fecale pellets (~ 50 mg of zwaarder) hebben de voorkeur voor het verkrijgen van RNA van de hoogste zuiverheid.
    1. Gebruik alle benodigde persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) en materialen, bijvoorbeeld: een paar laboratoriumhandschoenen, een desinfecterende spray en een steriel papieren handdoekje, om het werkgebied te steriliseren, waar het proefdier op wordt geplaatst, om besmetting met fecale monsters te voorkomen.
      1. Voor menselijke proefpersonen, instrueer elke proefpersoon / verzamelaar om 100-200 mg ontlastingsmonsters te verzamelen in een omgeving die zo steriel mogelijk is. Gebruik standaard steriele werking en vermijd besmetting van ontlastingsmonsters.
  3. Verzamel fecale monsters van elk dier rechtstreeks in een microcentrifugebuis van 2 ml met een schroefdop zonder andere oppervlakken aan te raken om besmetting te voorkomen.
    1. Voor menselijke proefpersonen, instrueer elke proefpersoon om rechtstreeks te poepen in een toepasbaar verzamelapparaat (bijvoorbeeld een steriele verzamelkit voor ontlastingsmonsters) om besmetting te voorkomen.
      OPMERKING: Instrueer de patiënt om besmetting door toiletoppervlakken, water, urine of andere niet-steriele oppervlakken/voorwerpen te voorkomen.
  4. Vries fecale monsters die zijn verzameld in 2 ml microcentrifugebuizen onmiddellijk bij -80 °C of plaats in een emmer droogijs voor de betere hoeveelheid en kwaliteit van RNA voordat de ontlasting resuspensie zoals beschreven in de onderstaande stappen.
    1. Voor menselijke ontlastingsmonsters aliquot elk vers monster van 200 mg in 2 ml microcentrifugebuizen met schroefdoppen en vriest deze in bij -80 °C vóór de resuspensie van de ontlasting, zoals hieronder beschreven.
      1. Voor de opslag van ontlastingsmonsters die niet in 2 ml microcentrifugebuizen met schroefdoppen zijn, weegt en brengt u 100-200 mg bevroren monsters over in afzonderlijke microcentrifugebuizen van 2 ml met schroefdoppen vóór reuspensie van uitwerpselen zoals hieronder beschreven.
        OPMERKING: Vermijd voor menselijke ontlastingsmonsters het nemen van meer dan 200 mg ontlastingsmonsters voor RNA-isolatie, omdat dit problemen kan veroorzaken bij de volgende stappen. Bij een overbelast monster in een microcentrifugebuis van 2 ml zijn de waterige fase, de organische fase en de interfase mogelijk niet duidelijk gevormd en gescheiden. De procedure kan hier worden gepauzeerd.

2. Bereidingen van wasoplossingen

  1. Voeg 21 ml 100% ethanol van de American Chemical Society (ACS) toe aan de wash solution 1 in de miRNA-isolatiekit (zie materiaaltafel) om het uiteindelijke volume van 30 ml te bereiken, zoals aangegeven op de fles. Vortex totdat alles oplost in de fles.
  2. Voeg 40 ml ACS-ethanol van ACS-kwaliteit 100% toe aan de bijgeleverde wasoplossing 2/3 om het uiteindelijke volume van 50 ml te bereiken, zoals aangegeven op de fles. Vortex gedurende 5 s of totdat het uiteindelijke mengsel goed gemengd is.

3. Voorbereidingen van apparatuur en materialen

  1. Spuit het werkgebied en de apparatuur, bijvoorbeeld: de laboratoriumbank, het werkgebied in de chemische zuurkast en de microcentrifugebuisrekken, met een Ribonuclease (RNase) decontaminatieoplossing (bijv. In de handel verkrijgbare RNase-ontsmettingsoplossing). Om besmetting te voorkomen, brengt u met de RNase-decontaminatieoplossing aan op de oppervlakken waar en wanneer dat nodig wordt geacht.
  2. Trek een schone laboratoriumjas aan, zet een gezichtsmasker op en draag geschikte laboratoriumhandschoenen om het RNA in de fecale monsters te beschermen tegen nucleasen die op de menselijke huid aanwezig zijn. Spuit handschoenen met een RNase-decontaminatieoplossing en wissel regelmatig van handschoenen om besmetting te voorkomen.
  3. Bereid een emmer droogijs voor fecale monsters opgeslagen bij -80 °C om ontdooien te voorkomen voordat de ontlasting resuspensie en een emmer ijs voor materialen, bijvoorbeeld: Zuur-Fenol: Chloroform, om de houdbaarheid te verlengen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat materialen, inclusief de media die in het protocol worden gebruikt, steriel zijn zonder besmetting van nucleasen.

4. Uitwerpselen resuspensie

  1. Resuspendeer 25-100 mg fecale monsters in 600 μL steriele 1x Dulbecco's Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (DPBS).
    LET OP: Fecale monsters moeten onmiddellijk worden verwerkt wanneer ze worden ontdooid vanaf -80 ° C zonder zelfs maar gedeeltelijk te ontdooien om de afgifte van RN's en cellulair RNA te minimaliseren, omdat ijskristallen zowel de binnenste als de buitenste cellulaire compartimenten scheuren wanneer cellen in het monster ontdooien.
    1. Voeg 600 μL 1x DPBS toe aan de microcentrifugebuis van 2 ml met een schroefdop met fecale monsters bij kamertemperatuur (RT).
    2. Incubeer het mengsel van fecale monsters ondergedompeld in 600 μL 1x DPBS in de 2 ml microcentrifugebuis die gedurende 30 minuten bij RT is afgedekt.
    3. Resuspendeer het mengsel door te pureren met 1 ml pipetpunt en vortex goed met de 2 ml microcentrifugebuis afgedekt. Om de hoeveelheid en kwaliteit van RNA te optimaliseren en te verhogen, resuspenseer het mengsel met een homogenisator met de instelling voor één cyclus bij S4000 (of 4000 rpm) en 45 s.

5. Biologische extractie

LET OP: Gebruik de gevaarlijke chemische zuurkast voor de volgende stappen tot stap 6 met het gebruik van zuurfenol: chloroform en ACS-kwaliteit 100% ethanol vanwege hun toxiciteit en ontvlambaarheid. Vervang PBM's indien nodig en volg de juiste standaard voorzorgsmaatregelen bij het omgaan met gevaarlijk materiaal.

  1. Extract RNA met 600 μL zuurfenol: chloroform (het volume zuur-fenol: chloroform vereist is gelijk aan het initiële volume van toegevoegde 1x DPBS in stap 4.1).
    1. Voeg 600 μL zuurfenol: chloroform toe aan de suspensie uit stap 4.1.
      OPMERKING: Trek zuurfenol op: chloroform uit de onderste fase in de fles terwijl de bovenste fase wordt gemengd met een waterige buffer. Als de interfase tussen deze twee fasen wordt verstoord, wacht dan en trek zuur-fenol op: chloroform alleen wanneer de interfase zich opnieuw vestigt om besmetting te voorkomen.
  2. Vortex het mengsel gedurende 60 s om grondig te mengen. Als alternatief, om de hoeveelheid RNA in de opbrengst te optimaliseren en te verhogen, mengt u met behulp van een homogenisator met de instelling voor één cyclus op S4000 en 45 s.
  3. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 10.000 x g bij RT om de waterige en organische fasen te scheiden met een microcentrifuge. Na centrifugatie moet de interfase compact zijn. Zo niet, herhaal dan de centrifugatie.
    OPMERKING: Als de interfase niet zo compact kon zijn als gewenst, mogelijk als gevolg van een ongelijke verhouding van het beginvolume tot het volume toegevoegd zuur-fenol: chloroform na verschillende herhalingen van centrifugatie, ga dan verder met het herstellen van de waterige fase met een grotere zorg om besmetting te voorkomen.
  4. Herstel de waterige fase en breng deze over naar een nieuwe 2 ml microcentrifugebuis met een scharnierdop (niet geleverd door de miRNA-isolatiekit).
    1. Verwijder de waterige (of bovenste) fase voorzichtig zonder de onderste fase te verstoren en breng deze over naar een nieuwe 2 ml microcentrifugebuis met een scharnierdop. Noteer het overgedragen volume (bijv. ~500 μL).
      OPMERKING: Wanneer de interfase compact is en de bovenste fase duidelijk gescheiden is, zweven er mogelijk een paar kleine restdeeltjes op de top van de waterige fase. Pipetteer zorgvuldig om deze residuen te vermijden en herstel alleen zichtbaar en duidelijk gescheiden waterige fase om een kwaliteitsvolle RNA-opbrengst te garanderen, zelfs als u slechts een klein volume van de waterige fase kunt verkrijgen.

6. Definitieve RNA-isolatie

  1. Voeg 1,25 volumes RT ACS-ethanol van kwaliteit 100% toe aan de waterige fase in de microcentrifugebuis van 2 ml (voeg bijvoorbeeld 625 μL 100% ethanol toe als 500 μL waterige fase wordt teruggewonnen uit stap 5.4.). Vortex 3 s.
  2. Laad het waterige fase/ethanolmengsel door het filterpatroon in de miRNA-isolatiekit.
    1. Plaats voor elk monster het filterpatroon in een van de verzamelbuizen die door de kit worden geleverd.
      1. Pipetteer en laad 600 μL van het waterige fase/ethanolmengsel in het filterpatroon.
        OPMERKING: Vortex het mengsel kort om de ethanol grondig te mengen met de waterige fase voordat u pipetteert. Niet meer dan 700 μL van het waterige fase/ethanolmengsel kan per keer worden geladen.
    2. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 90 s om door het mengsel te filteren. Draaien met een hogere snelheid kan het filter beschadigen.
    3. Gooi het filtraat weg en herhaal stap 6.2.1 tot en met 6.2.2 totdat het mengsel in opeenvolgende toepassingen door hetzelfde filtermembraan is gefilterd. Bewaar en hergebruik dezelfde opvangbuis voor de onderstaande wasstappen.
    4. Was het filter met 700 μL miRNA Wash Solution 1.
      LET OP: miRNA Wash Solution 1 bevat guanidinethiocyanaat dat huidirritatie en ernstig oogletsel kan veroorzaken. Draag noodzakelijke PBM's, bijvoorbeeld: handschoenen, gezichtsscherm, beschermende laboratoriumjas. Wissel indien nodig regelmatig van handschoenen.
      1. Breng 700 μL miRNA Wash Solution 1, de werkoplossing bereid met de ACS-klasse 100% ethanol, aan in het filterpatroon.
      2. Centrifugeer gedurende 60 s om de miRNA Wash Solution 1 door het filterpatroon te filteren.
      3. Gooi het filtraat uit de opvangbuis en plaats dezelfde filterpatroon in dezelfde opvangbuis.
    5. Was het filter met Wash Solution 2/3 één keer met volumes van achtereenvolgens 700 μL, 500 μL en 250 μL.
      1. Breng 700 μL Wash Solution 2/3, de werkoplossing bereid met de ACS-kwaliteit 100% ethanol, aan in het filterpatroon.
        1. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 1 min.
        2. Gooi het filtraat uit de opvangbuis en plaats dezelfde filterpatroon in dezelfde opvangbuis.
      2. Breng 500 μL Wash Solution 2/3 aan in het filterpatroon.
        1. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 1 min.
        2. Gooi het filtraat uit de opvangbuis en plaats dezelfde filterpatroon in dezelfde opvangbuis.
      3. Breng 250 μL Wash Solution 2/3 aan in het filterpatroon.
        1. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 1 min.
        2. Gooi het filtraat uit de opvangbuis.
      4. Breng de filterpatroon over in een nieuwe opvangbuis en draai de assemblage gedurende 5 minuten om restvloeistof uit het filter te verwijderen.

7. Elute RNA met 50 μL nucleasevrij water

  1. Breng de filterpatroon over in een nieuwe opvangbuis. Pipetteer 50 μL nucleasevrij water naar het midden van het filter en sluit de opvangbuis af.
    1. Incubeer bij RT gedurende 10 min.
    2. Draai gedurende 5 minuten op 8.000 x g om RNA terug te winnen in de nieuwe verzamelbuis.
    3. Bepaal de concentratie en zuiverheid van teruggewonnen fecaal RNA met behulp van een fluorometer. Teruggewonnen fecaal RNA kan worden bewaard bij -80 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representatieve RNA's werden geïsoleerd uit respectievelijk 50 mg muis fecale monsters (2 muis fecale pellets) en 100 mg menselijke ontlastingsmonsters en geëlueerd in 50 μL nucleasevrij water. Spectrofotometeranalyse van de concentratie suggereert dat een totale hoeveelheid van respectievelijk 49 μg en 16 μg RNA werd geïsoleerd (tabel 1). De RNA-zuiverheid was hoog zoals aangegeven door een A260/A280-verhouding van ~2,0 en een A260/A230-verhouding van ~1,8 (tabel 1). Zoals gemeld3, zijn de meeste RNA's in de ontlasting microRNA en die microRNA's kunnen in het exosoom voorkomen. In overeenstemming hiermee suggereert een chipgebaseerde elektroforesetest van RNA dat representatieve RNA-isolaten van muizen en menselijke uitwerpselen laag zijn in of ontbreken van 18S- en 28S-rRNA-samenstellingen, en de grootte van RNA-isolaten valt in het kleine RNA-gebied (figuur 1A). Een andere kleine RNA-elektroforese met de op chips gebaseerde elektroforese onthult dat een groot deel van de RNA's van microRNA-grootte is (figuur 1B). Dit komt overeen met de constatering dat de kwantificering die is voltooid met behulp van een kleine RNA-bioanalyzer vergelijkbaar is met die verkregen met eerdere testen6.

Voorbeeld-ID Elutievolume (μL) RNA-concentratie (ng/μL) A260/A280 A260/A230 Opbrengst (ng)
Muis 50 978.333 2.036 1.897 48916.65
Menselijk 50 330.759 1.981 1.849 16537.95

Tabel 1: Representatieve nanodruppelanalyse van RNA geïsoleerd met dit protocol. Representatieve RNA's werden geïsoleerd uit 2 fecale pellets van muizen of 100 mg menselijke ontlastingsmonsters, geëlueerd in 50 μL nucleasevrij water. RNA-concentratie, verhouding van A260/A280 en verhouding van A260/A230 werden gemeten met nanodruppel.

Figure 1
Figuur 1: Representatieve chipgebaseerde elektroforeseanalyses van de grootteverdeling van fecale RNA-isolaten. (A) Representatieve RNA's geïsoleerd uit 2 fecale pellets van muizen (linkerpaneel) en 100 mg menselijke ontlastingsmonsters (rechterpaneel) met behulp van het hier beschreven protocol werden gekarakteriseerd met behulp van de op chips gebaseerde elektroforesetest. Deze test suggereert dat de meerderheid van de RNA-isolaten klein RNA waren. (B) De isolaten werden vervolgens onderworpen voor de kleine RNA-elektroforese met het op chips gebaseerde elektroforesesysteem om de grootteverdeling van de isolaten te analyseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het is belangrijk om RNase-vrije techniek te gebruiken om RNase-besmetting tijdens de isolatie te voorkomen7. Na centrifugatie en de vorming van een compacte interfase is het belangrijk om de interfase, de onderste fase en de deeltjesverontreiniging die op de top van de waterige fase zweven te vermijden bij het herstellen van de waterige fase. Daarnaast worden twee wasstappen met 500 μL en 250 μL Wash Solution 2/3 toegevoegd om verontreinigingen in het filtermembraan te verwijderen voor een optimale kwaliteit. Bovendien wordt een startmonstermateriaal van meer dan 200 mg niet aanbevolen, omdat dit problemen kan veroorzaken bij de duidelijke vorming van een interfase. Evenzo wordt een monstermateriaal van minder dan 25 mg niet aanbevolen, omdat het mogelijk niet voldoende is om voldoende RNA-monsters te extraheren voor downstream-analyse.

De ongelooflijke groei in microbioomstudie heeft de metingen van microbiële soorten, genen tot metatranscriptionale studies van het microbiële profiel8 gedreven. MicroRNA's in de ontlasting zijn onderzocht als markers voor ziekten 9,10,11. Sinds het eerste rapport van fecaal microRNA dat gastheer-microbe interacties bemiddelt3, beginnen toenemende studies de bijdragen van gastheer en dieet in het darmecosysteem te onderzoeken 12,13,14. Opmerkelijk is dat, vanwege de rijkdom aan microben in het darmlumen en de ontlasting, studies gericht op de gastheerarm van de gastheer-microbe-interactie minimale RNA-besmetting van microben vereisen. Een RNA-extractieprotocol dat stappen van cellysing15 bevat, is dus niet ideaal voor de studie van RNA's die vrijkomen uit gastheer en dieet. Als zodanig hebben we dit protocol aangepast om lysisstappen te elimineren voor het minimaliseren van verontreinigingen van RNA van levende bacteriën en levende gastheercellen in uitwerpselen.

Dit protocol werkt voor studies waarbij extracellulair RNA in het fecale of darmlumengehalte een interessant doel is. RNA geïsoleerd met behulp van dit protocol is totaal RNA, inclusief microRNA als hoofdcomponent. Dit protocol maakt geen onderscheid of het RNA zich in exosoom, microvesicles of in een blaasjesvrije vorm bevindt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen relevante of materiële financiële belangen die verband houden met de onderzoeksmethode die in dit protocol wordt beschreven.

Acknowledgments

We kregen technische assistentie van de Biopolymers Facility aan de Harvard Medical School voor bioanalyzer. Dit werk werd ondersteund door de National Multiple Sclerosis Society onderzoeksbeurs RG-1707-28516 (H.L.W. en S.L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Thermo Fischer Scientific AM9720
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fischer Scientific 14190-144
Gloves
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Fischer Scientific AM1561
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) Thermo Fischer Scientific AM9937
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer QIAGEN 13155
RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fischer Scientific AM9780
Vortex Shaker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
  3. Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
  4. Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
  5. Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
  6. Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028 (2009).
  7. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).
  8. Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
  9. Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers. Crohn's & Colitis. 2 (1), 003 (2020).
  10. Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
  11. Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70 (2019).
  12. Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
  13. Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
  14. Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
  15. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).

Tags

Immunologie en infectie microRNA fecale monsters ontlastingsmonsters RNA-isolatie totaal RNA miRNA
Fecale (micro) RNA-isolatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dhang, F. H., Weiner, H. L., Liu, S. … More

Dhang, F. H., Weiner, H. L., Liu, S. Fecal (micro) RNA Isolation. J. Vis. Exp. (164), e61908, doi:10.3791/61908 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter