Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fekal (mikro) RNA İzolasyonu

Published: October 28, 2020 doi: 10.3791/61908
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Department of Neurology, Partners Multiple Sclerosis Center, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Evergrande Center for Immunologic Diseases, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital

Summary

Bu protokol, hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden yüksek kaliteli toplam RNA'yı izole eder. Ticari bir miRNA izolasyon kiti, saf RNA'yı optimize edilmiş miktar ve kalitede izole etmek için önemli bir adaptasyonla kullanılır. RNA izolatları, dizileme, mikro dizi ve RT-PCR gibi çoğu aşağı akış RNA testi için iyidir.

Abstract

RNA'nın bağırsak lümeninde ve hayvanlarda ve insanlarda dışkıda var olduğu netleşiyor. Aşağıda açıklanan protokol, mikroRNA'lar da dahil olmak üzere toplam RNA'yı hayvan ve insan deneklerin dışkı örneklerinden izole eder. Amaç, RNA dizilimi, RT-PCR ve mikro-dizi gibi aşağı akış analizleri için toplam RNA'yı yüksek saflık ve miktarda izole etmektir. Bu optimize edilmiş protokolün miRNA izolasyonundaki avantajları, yüksek oranda saflaştırılmış RNA ürünlerini tarif edilen ek yıkama adımlarıyla izole etme yetenekleri, numunenin yeniden süspansiyonunda geliştirilmiş bir yöntemle elde edilen RNA miktarının artması ve önemli dekontaminasyon ipuçlarıdır. Bir sınırlama, 200 mg'dan daha büyük numunenin işlenememesi ve saflaştırılamamasıdır, çünkü bu numune büyüklükleri interfazın net oluşumunda bir zorluğa neden olacaktır. Sonuç olarak, büyük örneklem büyüklüğü, protokolde açıklandığı gibi ekstrakte edilecek sulu fazı, sonunda izole edilen RNA'nın kalitesini etkileyen organik maddelerle kirletebilir. Bununla birlikte, 200 mg'a kadar bir numuneden RNA izolatları, aşağı akış analizlerinin çoğu için yeterlidir.

Introduction

Hücre dışı RNA, birçok biyolojik sürece aracılık eden önemli bir faktör olarak kabul edilmektedir1. Dışkıda hücre dışı RNA ilk olarak 2008 yılında kolon kanseri ve aktif ülseratif kolit2 için bir belirteç olarak bildirilmiştir ve yakın zamanda bağırsak lümeninin ve dışkının normal bir bileşeni olarak ortaya çıkmıştır ve konakçı-mikrop iletişimine aracılık eder 3,4,5. Bu RNA izolasyon protokolünün amacı, hayvan ve insan deneklerden toplanan dışkı örneklerinden yüksek kaliteli hücre dışı RNA'yı çıkarmaktır. Protokol, ticari bir miRNA İzolasyon Kitinden uyarlandı. Elde edilen RNA, RNA dizilimi, RT-PCR ve mikro-dizi gibi aşağı akış analizleri için kullanılır. Protokol, hayvanların ve insanların dışkısında bulunan RNA'nın miktarını ve kalitesini en üst düzeye çıkarmak için birkaç önemli ve yararlı ipucu içerir. RNA (mikroRNA dahil) izolasyonunun bu yöntemini geliştirmenin ve optimize etmenin nedeni, dışkıdaki mikrobiyal RNA'yı azaltmak, araştırma çalışmalarındaki değişkenleri sınırlamak ve çeşitli kafa karıştırıcı faktörleri ve kontaminasyon kaynaklarını hesaba katmadan bağırsaktaki RNA bileşimini analiz etmektir. Not olarak, bu RNA izolasyonu, RNA'nın canlı hücreden ve canlı mikroplardan (hücresel RNA) salınımını en aza indirir. Bağırsak hücreleri tarafından salınan veya gıda alımı yoluyla edinilen hücre dışı RNA'lara odaklanır. Temel olarak, bu yöntem mikrobiyal transkriptomun araştırıldığı çalışmalar için uygun değildir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada açıklanan araştırma hayvanlarını içeren tüm yöntemler, Harvard Tıp Fakültesi Brigham ve Kadın Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

Burada açıklanan insan araştırma konularını içeren tüm yöntemler, Ortaklar İnsan Araştırma Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygundur.

1. Fekal numune toplama

  1. Bir deneydeki her hayvan deneği için vidalı kapaklı steril ve nükleaz içermeyen 2 mL mikrosantrifüj tüpünü otoklav yapın veya hazırlayın.
    1. İnsan denekler için, her denek için uygun, nükleaz içermeyen ve steril bir dışkı örneği toplama cihazı sağlayın.
  2. Her hayvan deneklerinden 25-100 mg (fare dışkı örnekleri için yaklaşık 1-4 dışkı peleti) dışkı örneğini steril bir ortamda toplayın.
    NOT: En yüksek saflıkta RNA elde etmek için iki veya daha fazla dışkı peleti (~ 50 mg veya daha ağır) tercih edilir.
    1. Gerekli tüm Kişisel Koruyucu Ekipman (KKD) ve malzemeleri kullanın, örneğin: dışkı numunesi kontaminasyonunu önlemek için hayvan araştırma konusunun yerleştirildiği çalışma alanını sterilize etmek için bir çift laboratuvar eldiveni, bir dezenfektan spreyi ve steril bir kağıt havlu.
      1. İnsan denekler için, her araştırma deneğine / toplayıcıya mümkün olduğunca steril bir ortamda 100-200 mg dışkı örneği toplamasını söyleyin. Standart steril çalışma kullanın ve dışkı numunesi kontaminasyonundan kaçının.
  3. Kontaminasyonu önlemek için her bir hayvan deneklerinden dışkı numunelerini, diğer yüzeylere dokunmadan vidalı kapaklı 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne doğrudan toplayın.
    1. İnsan denekler için, kontaminasyonu önlemek için her bir deneğe doğrudan sağlanan uygulanabilir bir toplama cihazına (örneğin, steril bir dışkı numunesi toplama kiti) dışkılama talimatı verin.
      NOT: Tuvalet yüzeyleri, su, idrar veya diğer steril olmayan yüzeyler/nesneler tarafından kontaminasyondan kaçınılması için konuya talimat verin.
  4. 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplanan dışkı örneklerini hemen -80 ° C'de dondurun veya aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi dışkı yeniden süspansiyonundan önce RNA'nın daha iyi miktarı ve kalitesi için bir kova kuru buz içine yerleştirin.
    1. İnsan dışkı örnekleri için, 200 mg'lık her taze numuneyi vidalı kapaklarla 2 mL mikrosantrifüj tüplerine alın ve dışkı aşağıda açıklandığı gibi yeniden süspansiyondan önce -80 ° C'de dondurun.
      1. Vidalı kapaklı 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde olmayan dışkı örneklerinin depolanması için, dondurulmuş numunelerin her birini tartın ve aşağıda açıklandığı gibi dışkı yeniden süspansiyonundan önce vidalı kapaklı ayrı 2 mL mikrosantrifüj tüplerine 100-200 mg aktarın.
        NOT: İnsan dışkı örnekleri için, RNA izolasyonu için 200 mg'dan fazla dışkı örneği almaktan kaçının, çünkü aşağıdaki adımlarda zorluklara neden olabilir. 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde aşırı yüklenmiş bir numune ile, sulu faz, organik faz ve interfaz net bir şekilde oluşturulamayabilir ve ayrılamayabilir. Prosedür burada duraklatılabilir.

2. Yıkama çözeltilerinin hazırlanması

  1. Şişede gösterildiği gibi 30 mL'lik son hacme ulaşmak için miRNA İzolasyon Kitinde sağlanan Yıkama Çözeltisi 1'e 21 mL Amerikan Kimya Derneği (ACS) dereceli% 100 etanol ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Her şey şişede çözülene kadar vorteks.
  2. Şişede gösterildiği gibi 50 mL'lik son hacme ulaşması sağlanan Yıkama Çözeltisi 2/3'e 40 mL ACS kaliteli% 100 etanol ekleyin. 5 s boyunca veya son karışım iyice harmanlanana kadar vorteks.

3. Ekipman ve malzemelerin hazırlanması

  1. Çalışma alanını ve ekipmanı, örneğin: laboratuvar tezgahına, kimyasal duman davlumbazındaki çalışma alanına ve mikro santrifüj tüp raflarına, bir Ribonükleaz (RNase) dekontaminasyon çözeltisi (örneğin, ticari olarak temin edilebilen RNaz dekontaminasyon çözeltisi) ile püskürtün. Kontaminasyonu önlemek için, RNase dekontaminasyon çözeltisi ile gerekli görülen her yerde ve her zaman yüzeylere uygulayın.
  2. Temiz bir laboratuvar önlüğü giyin, yüz maskesi takın ve dışkı örneklerindeki RNA'yı insan derisinde bulunan nükleazlardan korumak için uygun laboratuvar eldivenleri giyin. Eldivenleri RNase dekontaminasyon çözeltisi ile püskürtün ve kontaminasyonu önlemek için eldivenleri sık sık değiştirin.
  3. Dışkı yeniden süspansiyonundan önce çözülmeyi önlemek için -80 ° C'de depolanan dışkı örnekleri için bir kova kuru buz ve malzemeler için bir kova buz hazırlayın, örneğin: Asit-Fenol: Kloroform, raf ömrünü uzatmak için.
    NOT: Protokolde kullanılan ortam da dahil olmak üzere malzemelerin nükleazların kontaminasyonu olmadan steril olduğundan emin olun.

4. Dışkı süspansiyonu

  1. 600 μL steril 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salininde (DPBS) 25-100 mg dışkı örneğini yeniden askıya alın.
    DİKKAT: Dışkı örnekleri, numunedeki hücreler çözüldüğünde buz kristalleri hem iç hem de dış hücresel bölmeleri yırttığından, RNazların ve hücresel RNA'nın salınımını en aza indirmek için kısmi çözülme bile olmadan -80 ° C'den çözüldüğünde derhal işlenmelidir.
    1. Oda sıcaklığında (RT) dışkı örnekleri içeren vidalı kapaklı 2 mL mikrosantrifüj tüpüne 600 μL 1x DPBS ekleyin.
    2. RT'de 30 dakika boyunca kapatılmış 2 mL mikrosantrifüj tüpünde 600 μL 1x DPBS'ye batırılmış dışkı örneklerinin karışımını inkübe edin.
    3. 1 mL pipet ucu ve vorteks kuyusu ile ezerek karışımı 2 mL mikrosantrifüj tüpü kapatılmış olarak yeniden askıya alın. RNA'nın miktarını ve kalitesini optimize etmek ve arttırmak için, karışımı S4000 (veya 4000 rpm) ve 45 s'de bir döngü ayarına sahip bir homojenizatör ile yeniden askıya alın.

5. Organik ekstraksiyon

DİKKAT: Tehlikeli kimyasal duman başlığını asit-fenol kullanımı ile Adım 6'ya kadar aşağıdaki adımlar için kullanın: kloroform ve ACS sınıfı% 100 etanol, toksisiteleri ve yanıcılıkları nedeniyle. KKD'yi gerektiği gibi değiştirin ve tehlikeli maddelerle çalışırken uygun standart önlemleri alın.

  1. RNA'yı 600 μL asit-fenol ile ekstrakte edin: kloroform (gerekli asit-fenol hacmi: gerekli kloroform, Adım 4.1'de eklenen 1x DPBS'nin başlangıç hacmine eşittir).
    1. Adım 4.1'den itibaren süspansiyona 600 μL asit-fenol ekleyin: kloroform.
      NOT: Asit-fenol çekin: üst faz sulu bir tamponla karıştırıldığı için şişedeki alt fazdan kloroform. Bu iki faz arasındaki interfaz bozulursa, asit-fenol'ü bekleyin ve geri çekin: kloroform, yalnızca interfaz kontaminasyonu önlemek için kendini yeniden kurduğunda.
  2. Vorteks karışımı 60 s iyice karıştırmak için. Alternatif olarak, verimdeki RNA miktarını optimize etmek ve arttırmak için, S4000 ve 45 s'de bir döngü ayarına sahip bir homojenizatör kullanarak karıştırın.
  3. Sulu ve organik fazları bir mikrosantrifüj ile ayırmak için RT'de 10.000 x g'da 15 dakika santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, interfaz kompakt olmalıdır. Değilse, santrifüjlemeyi tekrarlayın.
    NOT: Eğer interfaz, başlangıç hacminin eklenen asit-fenol hacmine eşit olmayan oranı nedeniyle istenildiği kadar kompakt olamıyorsa: birkaç santrifüjleme tekrarından sonra kloroform, kontaminasyonu önlemek için sulu fazı daha dikkatli bir şekilde geri kazanmaya devam edin.
  4. Sulu fazı geri kazanın ve menteşe kapaklı yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın (miRNA izolasyon kiti tarafından sağlanmaz).
    1. Sulu (veya üst) fazı, alt fazı rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın ve menteşe kapaklı yeni bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aktarılan hacme dikkat edin (örneğin, ~500 μL).
      NOT: İnterfaz kompakt olduğunda ve üst faz açıkça ayrıldığında, muhtemelen sulu fazın üstünde yüzen birkaç küçük artık parçacık vardır. Bu kalıntıları önlemek için pipeti dikkatli bir şekilde kullanın ve sulu fazın sadece küçük bir hacmini elde edebilseniz bile, kaliteli bir RNA verimi sağlamak için sadece gözle görülür ve net bir şekilde ayrılmış sulu fazı geri kazanın.

6. Son RNA izolasyonu

  1. 2 mL mikrosantrifüj tüpündeki sulu faza 1.25 hacim RT ACS dereceli% 100 etanol ekleyin (örneğin, Adım 5.4'ten 500 μL sulu faz geri kazanılırsa 625 μL% 100 etanol ekleyin). Vorteks 3 s.
  2. Sulu faz/etanol karışımını miRNA izolasyon kitinde verilen filtre kartuşundan yükleyin.
    1. Her numune için, filtre kartuşunu kit tarafından sağlanan toplama tüplerinden birine yerleştirin.
      1. Pipet ve sulu faz/etanol karışımının 600 μL'sini filtre kartuşuna yükleyin.
        NOT: Pipetlemeden önce etanolün sulu faz ile iyice karıştırılması için karışımı kısa bir süre vortekse edin. Bir seferde sulu faz/etanol karışımının en fazla 700 μL'si yüklenemez.
    2. Karışımın içinden filtrelemek için 90 s boyunca 10.000 x g'de santrifüj. Daha yüksek hızda eğirmek filtreye zarar verebilir.
    3. Filtratın ve birbirini izleyen uygulamalarda tüm karışım aynı filtre membranından filtrelenene kadar Adım 6.2.1 ila 6.2.2'yi tekrarlayın. Aşağıdaki yıkama adımları için aynı toplama tüpünü saklayın ve tekrar kullanın.
    4. Filtreyi 700 μL miRNA Yıkama Çözeltisi 1 ile yıkayın.
      DİKKAT: miRNA Yıkama Çözeltisi 1, cilt tahrişine ve ciddi göz hasarına neden olabilecek guanidin tiyosiyanat içerir. Gerekli KKD'leri giyin, örneğin: eldivenler, yüz siperliği, koruyucu laboratuvar önlüğü. Gerektiğinde eldivenleri sık sık değiştirin.
      1. ACS sınıfı% 100 etanol ile hazırlanan çalışma çözeltisi olan 700 μL miRNA Yıkama Çözeltisi 1'i filtre kartuşuna uygulayın.
      2. miRNA Yıkama Çözeltisi 1'i filtre kartuşundan filtrelemek için 60 sn'lik santrifüj.
      3. Filtrasyonu toplama tüpünden atın ve aynı filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.
    5. Filtreyi her biri 700 μL, 500 μL ve 250 μL hacimlerde art arda 2/3 Yıkama Çözeltisi ile yıkayın.
      1. ACS sınıfı %100 etanol ile hazırlanan çalışma çözeltisi olan 700 μL Yıkama Çözeltisi 2/3'ü filtre kartuşuna uygulayın.
        1. 1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.
        2. Filtrasyonu toplama tüpünden atın ve aynı filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.
      2. Filtre kartuşuna 500 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 uygulayın.
        1. 1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.
        2. Filtrasyonu toplama tüpünden atın ve aynı filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.
      3. Filtre kartuşuna 250 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 uygulayın.
        1. 1 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj.
        2. Filtrasyonu toplama tüpünden atın.
      4. Filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve artık sıvıyı filtreden çıkarmak için tertibatı 5 dakika boyunca döndürün.

7. 50 μL nükleaz içermeyen su ile Elute RNA

  1. Filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın. Pipetle 50 μL nükleaz içermeyen suyu filtrenin ortasına yerleştirin ve toplama tüpünü kapatın.
    1. RT'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
    2. RNA'yı yeni toplama tüpüne geri kazandırmak için 8.000 x g'de 5 dakika boyunca döndürün.
    3. Bir florometre kullanarak geri kazanılan dışkı RNA'sının konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin. Geri kazanılan fekal RNA -80 °C'de saklanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Temsili RNA'lar sırasıyla 50 mg fare dışkı örneğinden (2 fare dışkı peleti) ve 100 mg insan dışkısı örneklerinden izole edildi ve 50 μL nükleaz içermeyen suda salındı. Konsantrasyonun spektrofotometre analizi, sırasıyla toplam 49 μg ve 16 μg RNA miktarının izole edildiğini göstermektedir (Tablo 1). RNA saflığı, ~2.0'lık bir A260 / A280 oranı ve ~ 1.8'lik bir A260 / A230 oranı ile gösterildiği gibi yüksekti (Tablo 1). Bildirilen3 gibi, dışkıdaki RNA'ların çoğunluğu mikroRNA'dır ve bu mikroRNA'lar eksozomda bulunabilir. Bununla tutarlı olarak, RNA'nın çip bazlı bir elektroforez testi, fare ve insan dışkısından temsili RNA izolatlarının 18S ve 28S rRNA bileşimlerinde düşük veya eksik olduğunu ve RNA izolatlarının boyutunun küçük RNA bölgesine düştüğünü göstermektedir (Şekil 1A). Çip bazlı elektroforez ile küçük bir RNA elektroforezi, RNA'ların büyük bir kısmının mikroRNA boyutunda olduğunu ortaya koymaktadır (Şekil 1B). Bu, küçük bir RNA biyoanalizörü kullanılarak tamamlanan nicelemenin, önceki tahliller 6 ile elde edilenle karşılaştırılabilir olduğu gözlemiyletutarlıdır.

Örnek Kimlik Elüsyon hacmi (μL) RNA konsantrasyonu (ng/μL) A260/A280 A260/A230 Verim (ng)
Fare 50 978.333 2.036 1.897 48916.65
İnsan 50 330.759 1.981 1.849 16537.95

Tablo 1: Bu protokolle izole edilen RNA'nın temsili nanodamla analizi. Temsili RNA'lar, 50 μL nükleaz içermeyen suda salınan 2 fare dışkı peletinden veya 100 mg insan dışkısı örneğinden izole edildi. RNA konsantrasyonu, A260/A280 oranı ve A260/A230 oranı nanodamla ile ölçüldü.

Figure 1
Şekil 1: Fekal RNA izolatlarının boyut dağılımının temsili çip bazlı elektroforez analizleri. (A) Burada açıklanan protokol kullanılarak 2 fare dışkı peletinden (sol panel) ve 100 mg insan dışkısı örneğinden (sağ panel) izole edilen temsili RNA'lar, çip bazlı elektroforez testi kullanılarak karakterize edildi. Bu tahlil, RNA izolatlarının çoğunluğunun küçük RNA olduğunu göstermektedir. (B) İzolatlar daha sonra izolatların boyut dağılımını analiz etmek için çip bazlı elektroforez sistemi ile küçük RNA elektroforezi için tabi tutuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İzolasyon sırasında RNaz kontaminasyonunu önlemek için RNase içermeyen tekniğin kullanılması önemlidir7. Santrifüjleme ve kompakt bir interfazın oluşumundan sonra, sulu fazı geri kazanırken interfaz, alt faz ve sulu fazın üstünde yüzen partikül kirleticisinden kaçınmak önemlidir. Ek olarak, optimize edilmiş kalite için filtre membranındaki kirleticileri ortadan kaldırmak üzere 500 μL ve 250 μL Yıkama Çözeltisi 2/3 ile iki yıkama adımı eklenir. Ayrıca, 200 mg'dan daha büyük bir başlangıç numune materyali, bir interfazın net oluşumunda zorluk yaratabileceğinden önerilmez. Benzer şekilde, 25 mg'dan daha az bir numune materyali, aşağı akış analizi için yeterli RNA örneğini çıkarmak için yeterli olmayabileceğinden önerilmez.

Mikrobiyom çalışmasındaki inanılmaz büyüme, mikrobiyal türlerin, genlerin ölçümlerini mikrobiyal profilin metatranskripsiyonel çalışmalarına yönlendirmiştir8. Dışkıdaki mikroRNA'lar 9,10,11 hastalıkları için belirteçler olarak incelenmiştir. Konakçı-mikrop etkileşimlerine aracılık eden fekal mikroRNA'nın ilk raporundan bu yana3, artan çalışmalar konakçı ve diyetin bağırsak ekosistemindeki katkılarını araştırmaya başlamıştır12,13,14. Dikkat çekici bir şekilde, bağırsak lümeni ve dışkısındaki mikropların zenginliği nedeniyle, konakçı-mikrop etkileşiminin konakçı koluna odaklanan çalışmalar, mikroplardan minimum RNA kontaminasyonu talep etmektedir. Bu nedenle, hücre lizasyonu15 adımlarını içeren bir RNA ekstraksiyon protokolü, konakçı ve diyetten salınan RNA'ların incelenmesi için ideal değildir. Bu nedenle, RNA'nın canlı bakterilerden ve dışkıdaki canlı konakçı hücrelerden kaynaklanan kontaminasyonlarını en aza indirmek için lizis adımlarını ortadan kaldırmak için bu protokolü uyarladık.

Bu protokol, dışkı veya bağırsak lümen içeriğindeki hücre dışı RNA'nın ilgi çekici bir amaç olduğu çalışmalar için çalışır. Bu protokol kullanılarak izole edilen RNA, ana bileşen olarak mikroRNA da dahil olmak üzere toplam RNA'dır. Bu protokol, RNA'nın eksozomda, mikro-parçacıklarda mı yoksa vezikülsüz bir formda mı olduğunu ayırt etmez.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, bu protokol makalesinde açıklanan araştırma yöntemiyle ilgili veya maddi hiçbir finansal çıkar beyan etmemektedir.

Acknowledgments

Harvard Tıp Fakültesi'ndeki Biyopolimerler Tesisi'nden biyoanalizör için teknik yardım aldık. Bu çalışma Ulusal Multipl Skleroz Derneği araştırma hibesi RG-1707-28516 (H.L.W. ve S.L.) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Thermo Fischer Scientific AM9720
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fischer Scientific 14190-144
Gloves
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit Thermo Fischer Scientific AM1561
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated) Thermo Fischer Scientific AM9937
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer QIAGEN 13155
RNaseZap RNase Decontamination Solution Thermo Fischer Scientific AM9780
Vortex Shaker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Das, S., et al. The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research. Cell. 177 (2), 231-242 (2019).
  2. Ahmed, F. E., et al. Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue. Cancer Genomics & Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).
  3. Liu, S., et al. The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA. Cell Host & Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).
  4. Viennois, E., et al. Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation. Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).
  5. Liu, S., et al. Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila. Cell Host & Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).
  6. Masotti, A., et al. Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2009, 659028 (2009).
  7. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).
  8. Franzosa, E. A., et al. Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).
  9. Wohnhaas, C. T., et al. Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers. Crohn's & Colitis. 2 (1), 003 (2020).
  10. Tomkovich, S., et al. Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer. mSystems. 5 (1), (2020).
  11. Tarallo, S., et al. Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples. mSystems. 4 (5), 70 (2019).
  12. Xing, S., et al. Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria. Research Square. , (2020).
  13. Teng, Y., et al. Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota. Cell Host & Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).
  14. Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface. Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).
  15. Giannoukos, G., et al. Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes. Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 164 mikroRNA dışkı örnekleri dışkı örnekleri RNA izolasyonu total RNA miRNA
Fekal (mikro) RNA İzolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dhang, F. H., Weiner, H. L., Liu, S. … More

Dhang, F. H., Weiner, H. L., Liu, S. Fecal (micro) RNA Isolation. J. Vis. Exp. (164), e61908, doi:10.3791/61908 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter